DE19919091A1 - Anordnung zur Einstellung der Laserleistung und/oder der Pulslänge eines Kurzpulslasers in einem Mikroskop - Google Patents

Abstract

Anordnung zur Einstellung der Laserleistung und/oder der Pulslänge in einem Mikroskop, wobei durch Einstrahlung mittels eines Kurzpulslasers eine Probe zu nichtlinearer Fluoreszenz, vorzugsweise Zweiphotonenfluoreszenz angeregt wird, wobei DOLLAR A das nichtlineare Fluoreszenzsignal sowie ein ein Reflektionssignal und/oder ein der Laserleistung entsprechendes Referenzsignal detektiert werden und das Verhältnis von Fluoreszenzsignal und Reflektionssignal und/oder Referenzsignal als Regelsignal zur Einstellung dient.

Description

Für die Anregung nichtlinearer Prozesse (Multiphotonen-Absorption, SHG, OBIC, zeitaufgelöster Fluoreszenznachweis, etc.) durch gepulste Laser in Präparaten ist eine möglichst hohe Puls-Spitzenleistungen P_Peak notwendig. Die Pulsspitzenleistung (Intensität I) berechnet sich wie folgt:

Somit ist die Spitzenleistung um so höher desto kürzer die Pulslänge τ im Präparat ist. Kurze Pulse besitzen jedoch je nach Pulslänge eine bestimmte spektrale Breite Δλ. A und f bezeichnen jeweils die Repetitionsrate und die Wechselwirkungsfläche mit dem Präparat. P_avg ist die mittlere Leistung der Laserstrahlung.

Durch die Dispersion in optischen Komponenten werden die Pulse beim Durchlaufen der optischen Medien (einschließlich Präparat) verbreitert. Zusätzlich können nichtlineare Effekte wie SPM auftreten, die sich auf das Spektrum und damit wiederum auf die Pulslänge auswirken.

Es besteht also die Notwendigkeit die Pulslänge und die mittlere Leistung am Ort der Laser-Wechselwirkung mit der Probe zu optimieren.

Herkömmliche Verfahren

Kurze Pulse unterhalb von 1 ns können aufgrund ihrer kürze nicht mehr direkt auf elektronischem Wege vermessen werden. Man verwendet hierzu z. B. Autokorrelatoren mit denen die Autokorrelationsfunktion der Pulse bestimmt werden kann. Anschließend wird aus dieser Autokorrelationsfunktion auf die Pulslänge geschlossen.

Diese Meßgeräte benötigen jedoch generell einen Parallelstrahl des zu untersuchenden Laserlichtes. Sie sind also ungeeignet zur Bestimmung der Pulslänge direkt nach einem hochaperturigen Objektiv. Sie sind prinzipiell ungeeignet zur Bestimmung/Optimierung der Pulslänge in Abhängigkeit von der Eindringtiefe in ein Präparat.

Beschreibung der Erfindung

Mit Hilfe des vorgeschlagenen Verfahrens ist es möglich die Pulslänge am Ort der Laser-Wechselwirkung mit der Probe zu vermessen und die Pulsspitzenleistung zu optimieren. Hierzu wird die nichtlineare Wechselwirkung in Kombination mit einer linearen Wechselwirkung in einem biologischen Präparat verwendet.

Die nichtlineare Wechselwirkung kann im Allgemeinen wie folgt beschrieben werden:

C ist hierbei ein Proportionalitätsfaktor und n gibt die Ordnung der Nichtlinearität an. Die Konstante C hängt ab von den Präparateigenschaften. Nichtlineare Probenwechselwirkungen sind z. B. die Zwei-Photonen-Mikroskopie (n = 2), die Erzeugung der zweiten Harmonischen (n = 2), die Drei-Photonen-Absorption (n = 3), etc.

Eine lineare Probenwechselwirkung ist i. A. gegeben durch:

S_L = C₁.P_avg (3)

C₁ ist hierbei wiederum ein Proportionalitätsfaktor, der auch hier von den Probeneigenschaften abhängt. Eine lineare Wechselwirkung ist z. B. jede Reflexion am Präparat, die Anregung einer Ein-Photonen-Fluoreszenz oder aber die Messung der mittleren Leistung mit einem Leistungsmeßgerät.

Wenn man beide Prozesse (linear/nichtlinear) gleichzeitig mißt und das Verhältnis

zwischen beiden Signalen bestimmt, dann ergibt sich beispielsweise für eine Zwei- Photonenabsorption folgender Zusammenhang:

wobei f und A unabhängig von der Pulslänge sind.

Die Proportionalitätskonstanten (C, C₁) sind im Normalfall ebenfalls unabhängig von der Pulslänge. Das Verhältnis R von nichtlinearem und linearem Signal ist im Zwei- Photonenfall umgekehrt proportional zur Pulslänge und unabhängig von der mittleren Leistung. Die Konstante (Const) hängt vom verwendeten Präparat und von der Detektionseinrichtung ab.

Technische Umsetzung

Die technische Umsetzung soll hier beispielhaft anhand der Zweiphotonen-Absorption erläutert werden.

Fig. 1 Technische Umsetzung in einem LSM

Zur technischen Umsetzung ist es notwendig zwei Detektoren D1 und D2 (Fig. 1) so anzuordnen, daß die Reflexion/mittlere Leistung und die Zwei-Photonen- Fluoreszenz simultan (sequentiell) registriert wird. Anschließend wird im Rechner das Verhältnis R berechnet und grafisch dargestellt.

Anordnung 1a in Fig. 1 zeigt einen Aufbau bei der als lineares Signal in D2 die Reflexion der von einem Laser L beleuchteten Probe P über ein Objektiv O und Hauptfarbteiler HFT und Nebenfarbteile NFT detektiert wird.

Dieses Reflexionssignal wird mit geeigneten Dichroiten NFT von der Fluoreszenzstrahlung abgetrennt, die über einen Kurzpaßfilter KP auf D1 gelangt.

Anordnung 1b zeigt einen Aufbau bei dem eine Monitordiode MD als D2 die mittlere Leistung der Laserstrahlung detektiert.

Die Monitordiode wird mit einer festen Ausspiegelung des Laserlichtes gespeist. Diese Anordnung ist die bevorzugte, da hier das Reflexionssignal unabhängig von den Reflexionseigenschaften des Präparates ist.

Als Hauptfarbteiler HFT dient in beiden Anordnungen ein Kurzpaßfilter. Er reflektiert Licht im Nir-Wellenlängenbereich und transmittiert Licht im VIS-UV-Bereich.

Fig. 2 zeigt das Verhältnis R als Funktion der Pulslänge.

Abb. 2

Bei der minimalen Pulslänge, d. h. bei max Pulsspitzenleistung am Ort der Probe ergibt sich entsprechend Gleichung (4) ein Maximum. Somit kann eine Optimierung der Pulslänge durch das Einstellen einer Prechirp-Einheit erfolgen.

Eine derartige einstellbare Prechirp-Einheit wird in DE. . . beschrieben.

Besonders vorteilhaft ist, daß die Messung der Kenngröße/Verhältnis R in erster Näherung unabhängig von der mittleren Leistung (d. h. Koppeleffizienz in eine Glasfaser, Änderung der mittleren Ausgangsleistung beim Optimieren des Lasers, etc.) ist. Die Kenngröße hängt ausschließlich nur von der Pulslänge ab. Wird jedoch die mittlere Leistung weiter erhöht, so können in den verwendeten Optiken (in der Faser bei einer Faserkopplung) nichtlineare Prozesse (wie Selbstphasenmodulation) angeregt werden. Hierdurch ändert sich die spektrale Bandbreite der (ultra)-kurzen Laserpulse, und damit die Pulslänge, wodurch sich die Pulsspitzenleistung verringert. Diese Effekte sind zu vermeiden, d. h. die mittlere Leistung zu begrenzen.

Zum Aufsuchen des Schwellwertes für die mittlere Leistung kann oben beschriebenes Verfahren ebenfalls eingesetzt werden.

Fig. 3 zeigt die Abhängigkeit des Verhältnisses von der mittleren Leistung bei unveränderter Einstellung der Prechirpeinheit (Pulslänge wird nicht über die Prechirpeinheit variiert). Die oben erwähnte Änderung der Pulslänge aufgrund der nichtlinearen Effekte in den verwendeten Optiken äußert sich im Diagramm durch ein Abknicken des laut Gl. 4 als konstant erwarteten Verhältnisses.

Fig. 4 zeigt eine Gesamtanordnung aus Kurzpulslaser KPL, Prechirpeinheit PCE, Lichtleitfaser F und Mikroskop MI, vorzugsweise Laser-Scanning-Mikroskop LSM.

Claims (3)

1. Anordnung zur Einstellung der Laserleistung und/oder der Pulslänge in einem Mikroskop, wobei durch Einstrahlung mittels eines Kurzpulslasers eine Probe zu nichtlinearer Fluoreszenz, vorzugsweise Zweiphotonenfluoreszenz angeregt wird, wobei das nichtlineare Fluoreszenzsignal sowie ein ein Reflexionssignal und/oder ein der Laserleistung entsprechendes Referenzsignal detektiert werden und das Verhältnis von Fluoreszenzsignal und Reflexionssignal und/oder Referenzsignal als Regelsignal zur Einstellung dient.

2. Anordnung nach Anspruch 1, wobei zur Registrierung der Laserleistung dem Laser nachgeordnet Laserlicht auf eine Monitordiode ausgeblendet wird.

3. Anordnung nach Anspruch 1 oder 2 in einem Laser-Scanning-Mikroskop.