DE102020212029A1

DE102020212029A1 - Vorrichtung und Verfahren zur simultanen Abbildung zweier Objektebenen

Info

Publication number: DE102020212029A1
Application number: DE102020212029.3A
Authority: DE
Inventors: Michael Kugler; Marco Schade
Original assignee: Dr Johannes Heidenhain GmbH
Current assignee: Dr Johannes Heidenhain GmbH
Priority date: 2020-09-24
Filing date: 2020-09-24
Publication date: 2022-03-24
Also published as: WO2022063451A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung, die mindestens eine Lichtquelle, ein Einkoppelgitter und einen Biochip aufweist. Der Biochip der Vorrichtung weist mindestens ein Biogitter mit einer Brennweite f und eine wellenleitende Schicht mit einer Oberseite und einer Unterseite auf, wobei auf der Unterseite der wellenleitenden Schicht ein Substrat angeordnet ist. Die Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, dass diese weiterhin ein erstes Objektiv mit einer Brennweite f1, ein zweites Objektiv mit einer Brennweite f2, ein drittes Objektiv mit einer Brennweite f3, einen Strahlteiler mit einer Halterung, eine erste Lochblende und einen ersten und einen zweiten Detektor aufweist. Weiterhin ist die erfindungsgemäße Vorrichtung dazu eingerichtet, die Brennebene des mindestens einen Biogitters auf den ersten Detektor abzubilden und simultan die Oberfläche der Oberseite der wellenleitenden Schicht auf den zweiten Detektor abzubilden. Weiterhin umfasst die Erfindung ein Verfahren zur simultanen Abbildung der Brennebene des mindestens einen Biogitters und der Oberfläche der Oberseite der wellenleitenden Schicht mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung, die mindestens eine Lichtquelle, ein Einkoppelgitter und einen Biochip aufweist. Der Biochip der Vorrichtung weist mindestens ein Biogitter mit einer Brennweite f und eine wellenleitende Schicht mit einer Oberseite und einer Unterseite auf, wobei auf der Unterseite der wellenleitenden Schicht ein Substrat angeordnet ist. Die Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, dass diese weiterhin ein erstes Objektiv mit einer Brennweite f₁, ein zweites Objektiv mit einer Brennweite f₂, ein drittes Objektiv mit einer Brennweite f₃, einen Strahlteiler mit einer Halterung, eine erste Lochblende und einen ersten und einen zweiten Detektor aufweist. Weiterhin ist die erfindungsgemäße Vorrichtung dazu eingerichtet, die Brennebene des mindestens einen Biogitters auf den ersten Detektor abzubilden und simultan die Oberfläche der Oberseite der wellenleitenden Schicht auf den zweiten Detektor abzubilden. Weiterhin umfasst die Erfindung ein Verfahren zur simultanen Abbildung der Brennebene des mindestens einen Biogitters und der Oberfläche der Oberseite der wellenleitenden Schicht mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Bei der Molografie werden über geeignete Vorrichtungen Mologramm-Foki ausgelesen. Neben den Mess-Lichtbündeln, die für die Molografie von Interesse sind, wird unbeabsichtigt an allen Brechungsindexsprüngen im Wellenleiter auch elastisch gestreutes Licht aus dem Wellenleiter ausgekoppelt. Brechungsindexsprünge haben ihre Ursache beispielsweise in der Rauheit von Substrat und/oder Wellenleiter, Verschmutzungen auf der Oberseite des Wellenleiters, Materialinhomogenitäten usw..
Aus der Stärke des elastisch gestreuten Lichts kann der Wellenleiterverlust α bestimmt werden. Hierfür ist jedoch eine Abbildung der Oberseite der Oberfläche des Wellenleiters notwendig, um das Intensitätsprofil des elastisch gestreuten Lichts zu messen.
In einer weiteren Anwendung wird die Molografie kombiniert mit der Fluoreszenzmikroskopie angewendet. In diesem Fall ist es von Interesse die Oberseite des Wellenleiters abzubilden und so die Intensität des emittierten Fluoreszenzlichts zu messen.
Im Hinblick auf die Molografie ist insbesondere das Konzept von Chr. Fattinger/Roche zu nennen ( WO 2013/107811 A1 , WO 2014/086789 A1 , WO 2014/111521 A1 , WO 2015 004264 A1 ). Bei dieser Methode wird zunächst kohärentes Licht mit Hilfe eines optischen Gitters in einen planaren Wellenleiter eingekoppelt. Durch Anlagerung der zu detektierenden Biomoleküle wird ein diffraktives Biogitter mit gekrümmten Linien und kontinuierlich variierender Gitterperiode (Chirp) auf der Oberfläche des Wellenleiters gebildet. Dieses Biogitter wechselwirkt mit dem Nahfeld des im Wellenleiter propagierenden Lichts, koppelt dadurch bioselektiv einen Teil dieses Lichts aus, und fokussiert diesen in einer Brennebene, welche sich im Abstand f zur Wellenleiteroberfläche befindet, auf einen beugungsbegrenzten Fleck. Um dieses Signal messen zu können, muss die Brennebene BE der Biogitter mit einer geeigneten Optik auf einen Detektor abgebildet werden. Die Intensität dieses Signals ist dann ein Maß für die Massenbelegung des Biogitters.
Als eine mögliche Vorrichtung zum Auslesen von Mologramm-Foki wurde bisher der Zeptoreader der ehemaligen Firma Zeptosens benutzt [1]. Der Zeptoreader, beschrieben in der EP 1 327 135 B1 ist ein wellenleiterbasiertes Gerät mit entsprechender Optik, die zur Abbildung und anschließenden Detektion von Mologramm-Foki benutzt werden kann. Hierbei ist der Fokusring eines der beiden Kameraobjektive des Tandemaufbaus motorisiert ausgeführt, sodass die Schärfeebene der Abbildung um wenige Millimeter verstellt werden kann; entweder auf die Wellenleiteroberfläche, oder auf die Brennebene der Mologramme. Nachteil dieser Ausführung ist jedoch, dass die Abbildung seriell und nicht parallel erfolgt, da die Kamera entweder die Brennebene der Mologramme oder die Wellenleiteroberfläche abbilden kann. Weiterhin nachteilig ist, dass der Zeptoreader über keine Möglichkeit verfügt, die numerische Apertur des Tandemobjektivs zu verändern, sodass es nicht an die verschiedenen Abbildungsaufgaben angepasst werden kann: bei der Abbildung der Mologramme ist nämlich eine an die Apertur dieser fokussierenden Biogitter angepasste Apertur gewünscht, um Streulicht von außerhalb der Biogitter zu blockieren. Diese ist vorteilhafterweise klein, um keine Fokussierung der molografischen Signale auf einen Bereich kleiner der optischen Auflösung des Detektor zu erzielen, was die Streulichtunterdrückung verschlechtern würde.
Die Abbildung der Oberfläche, vor allem bei Fluoreszenzaufnahmen, erfordert dagegen eine hohe numerische Apertur, um eine hohe Lichtstärke und hohe optische Auflösung zu garantieren.
Als eine weitere mögliche Vorrichtung zum Auslesen der Molograme wurde von Frutiger et. al [2] mit dem sog. „MoloReader“ eine dedizierte Ausleseeinheit entwickelt. Hierbei handelt es sich im Wesentlichen um ein Mikroskop, welches die Brennebene der Mologrammfoki abbildet, und dessen numerische Apertur passend zur numerischen Apertur der Mologramme gewählt wurde. Durch Verstellen der Schärfeebene (dies wird zwar nicht explizit beschrieben, liegt aber im Wesen eines Mikroskops) kann zusätzlich zwar auch die Oberfläche des Wellenleiters abgebildet werden. Vollkommen analog zum o.g. Zeptoreader können die beiden Abbildungen aber wieder nur seriell erfolgen, also entweder Brennebene der Mologramme oder Wellenleiteroberfläche, und die numerische Apertur des Mikroskops kann nicht angepasst werden. Insbesondere verfügt dieser MoloReader auch über keine Möglichkeit zur Fluoreszenzdetektion.
Zusätzlich zur Detektion des Molografie-Signals ist es also von Interesse simultan die Wellenleiteroberfläche eines Biochips abbilden zu können, um zusätzliche, ergänzende Informationen gewinnen zu können, wie z. B. Wellenleiterbeschaffenheit, Verschmutzungen, Defekte, Wellenleiterdämpfung, oder um die Anlagerung von biologischen Zellen beobachten zu können. Für biologische Anwendungen ist hierbei insbesondere die Abbildung einer Oberfläche mit angelagerten fluoreszenzmarkierten Zellen bei der entsprechenden Emissionswellenlänge zu erwähnen, wie sie beispielweise ein Fluoreszenzmikroskop leisten kann.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, mit der simultan sowohl die Brennebene der Biogitter eines Biochips als auch die Oberseite des Wellenleiters eines Biochips abgebildet werden können.
Die vorliegende Aufgabe löst die Erfindung mit einer Vorrichtung aufweisend mindestens eine Lichtquelle, ein Einkoppelgitter und einen Biochip, wobei der Biochip mindestens ein Biogitter mit einer Brennweite f und eine wellenleitende Schicht mit einer Oberseite und einer Unterseite aufweist, wobei auf der Unterseite der wellenleitenden Schicht ein Substrat angeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, dass

die Vorrichtung weiterhin ein erstes Objektiv mit einer Brennweite f₁, ein zweites Objektiv mit einer Brennweite f₂, ein drittes Objektiv mit einer Brennweite f₃, einen Strahlteiler mit einer Halterung, eine erste Lochblende und einen ersten und einen zweiten Detektor aufweist; und
die Vorrichtung dazu eingerichtet ist, die Brennebene des mindestens einen Biogitters auf den ersten Detektor abzubilden und simultan die Oberfläche der Oberseite der wellenleitenden Schicht auf den zweiten Detektor abzubilden.

Weiterhin wird ein Verfahren zur simultanen Abbildung der Brennebene des mindestens einen Biogitters und der Oberseite der wellenleitenden Schicht mit Hilfe einer Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 beschrieben, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

Einkoppeln von Licht aus mindestens einer Lichtquelle in die wellenleitende Schicht;
Auskoppeln eines Teils des Lichts als erstes Mess-Lichtbündel I_Diff durch das mindestens eine Biogitter;
Optional auskoppeln je eines weiteren Mess-Lichtbündels durch jedes weitere Biogitter;
Auskopplung von elastisch gestreutem Licht I_Scat und/oder emittierten Fluoreszenzlicht I_Fluoro;
Auffangen des ausgekoppelten Lichts in einem ersten Objektiv;
Aufspalten des ausgekoppelten Lichts in einen ersten und einen zweiten optischen Strahlengang;
Abbilden des ersten optischen Strahlenganges mit der ersten Lochblende und dem zweiten Objektiv auf den ersten Detektor;
Abbilden des zweiten optischen Strahlenganges mit dem dritten Objektiv und optional mindestens ein weiteres optisches Element auf den zweiten Detektor;

Die optische Abbildung der Wellenleiteroberfläche ist hierbei so ausgestaltet, dass vorteilhafterweise neben dem Molografie-Signal entweder elastisch gestreutes Licht (Oberflächenmodus), oder von entsprechenden Fluorophoren emittiertes Licht (Fluoreszenzmodus) detektiert werden kann. Da die Anforderungen an die verschiedenen Abbildungen sehr unterschiedlich sind, legt diese Erfindung ein besonderes Augenmerk auf die Möglichkeit, die verschiedenen optischen Pfade hinsichtlich Lage der Brennebene, numerischer Apertur und detektierbarer Wellenlänge individuell ausgestalten zu können.
Detaillierte Beschreibung
Gemäß der vorliegenden Erfindung weist die Vorrichtung mindestens eine Lichtquelle auf, wobei die mindestens eine Lichtquelle eine kohärente Lichtquelle ist. Geeignete Lichtquellen, sind Lichtquellen, wie beispielsweise Laser, Laserdioden, Leuchtdioden, etc.. Die mindestens eine Lichtquelle weist bevorzugt eine Wellenlänge im Bereich von 400 nm bis 1000 nm auf. In einer Ausführungsform kann die mindestens eine Lichtquelle Licht einer oder mehrerer Wellenlängen abgeben. Die Wellenlängen der mindestens eine Lichtquelle können dabei einzeln mechanisch, z. B. durch sogenannte Shutter, oder elektrisch schaltbar sein. Die Wellenlänge der mindestens einen Lichtquelle kann damit an den jeweiligen Anwendungsfall angepasst werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weist die Vorrichtung zwei Lichtquellen auf. In dieser Ausführungsform kann eine erste Lichtquelle für die Dunkelfeldanregung der molografischen Detektion genutzt werden und eine zweite Lichtquelle für die Dunkelfeldanregung der Fluoreszenzdetektion.
In einer Ausführungsform der Erfindung weist daher eine erste Lichtquelle eine Wellenlänge im Bereich von 600 nm bis 1000 nm, bevorzugt im Bereich von 700 nm bis 900 nm, besonders bevorzugt von 780(±10) nm auf und eine zweite Lichtquelle eine Wellenlänge im Bereich von 400 nm bis 700 nm, besonders bevorzugt von 660(±10) nm auf.
Das Licht der mindestens einen Lichtquelle wird über ein Einkoppelgitter in die wellenleitende Schicht eines Biochips eingekoppelt. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Licht der mindestens einen Lichtquelle über eine Linse in die wellenleitende Schicht eines Biochips eingekoppelt. Die Linse dient dabei dazu das Licht der Lichtquelle zu kollimieren. Gibt die Lichtquelle bereits kollimiertes Licht ab, bsp. bei einem Laser, so ist die Verwendung einer solchen Linse nicht notwendig. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Licht aus zwei Lichtquellen eingekoppelt. Der Biochip gemäß der vorliegenden Erfindung weist eine wellenleitende Schicht mit einer Oberseite und einer Unterseite auf, wobei auf der Unterseite der wellenleitenden Schicht ein Substrat angeordnet ist.
Der Biochip umfasst damit einen Wellenleiter, wobei der Wellenleiter im Sinne der Erfindung aus einer wellenleitenden Schicht mit einem Brechungsindex nw besteht, die zwischen zwei Schichten eingeschlossen ist, die einen geringeren Brechungsindex aufweisen. An die wellenleitende Schicht grenzt erfindungsgemäß eine Substratschicht mit einem Brechungsindex ns und eine Deckschicht mit dem Brechungsindex n_D an.
Die wellenleitende Schicht des Biochips weist ein Material aus der Gruppe enthaltend Ta₂O₅, Si₃N₄, SiO_xN_y, TiO₂, SiC oder Kombinationen hiervon auf. Besonders bevorzugt weist die wellenleitende Schicht des Biochips Ta₂O₅ auf.
Die Substratschicht weist ein Material aus der Gruppe enthaltend D263, Floatglas, Borofloat, Herasil auf. Besonders bevorzugt weist die Substratschicht D263 auf.
Erfindungsgemäß grenzt die Oberseite der wellenleitenden Schicht an eine Deckschicht an, wobei die Deckschicht ein Material aus der Gruppe enthaltend SiO₂, Wasser, DMSO und Luft oder eine Kombination dieser aufweist.
Das Einkoppelgitter befindet sich auf der Unterseite der wellenleitenden Schicht. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung grenzt eine Deckschicht aus SiO₂ im Bereich des Einkoppelgitters an die wellenleitende Schicht an, während außerhalb dieses Bereiches eine Deckschicht aus Wasser oder Luft an die wellenleitende Schicht angrenzt.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind das Einkoppelgitter und der Biochip dazu geeignet gleichzeitig Licht unterschiedlicher Wellenlänge einzukoppeln, wobei der Betrag der Differenz zwischen den Einkoppelwinkeln verschiedener Lichtquellen der Divergenzwinkel Δα ist. Erfindungsgemäß ist der Divergenzwinkel Δα<6°, bevorzugt Δα<3°, besonders bevorzugt Δα≈0°.
In jedem Fall ist der Divergenzwinkel gleich oder kleiner als der Verstellbereich eines vorhergehenden Winkelverstellers, somit können vorteilhafterweise Lichtbündel mit diesen Wellenlängen gleichzeitig über das gleiche Einkoppelgitter in den Wellenleiter eingekoppelt werden.
Geeignete Einkoppelgitter, die in der erfindungsgemäßen Vorrichtung Verwendung finden, weisen eine Gitterkonstante Λ_K im Bereich von 200 nm bis 700 nm, bevorzugt von 300 bis 500 nm, besonders bevorzugt von 360 nm auf.
Um Licht mit mindestens zwei verschiedenen Wellenlängen (λ₁, λ₂) in die wellenleitende Schicht unter der genannten Bedingung einzukoppeln, wird eine Kombination aus effektiven Brechungsindices der wellenleitenden Schicht N(λ₁, j₁), N(λ₂, j₂) und Gitterkonstante des Einkoppelgitters Λ_K genutzt, für die die Einkopplungsbedingung für Licht der Wellenlänge λ₁ in die Wellenleitermode j₁ für einen Einkopplungswinkel α₁ erfüllt ist, und gleichzeitig die Einkopplungsbedingung für Licht der Wellenlänge λ₂<λ₁ in die Mode j₂ mit j₂>j₁, i.d.R. j₂ = j₁+1 für einen Einkopplungswinkel α₂≈α₁ erfüllt ist.
Es ist demnach eine geeignete Kombination von effektiven Brechungsindices N und Gitterkonstante Λ_K vorgesehen, für die sich die Einkoppelwinkel α₁ und α₂ ähneln. Dies wird erreicht, indem für die kürzere Wellenlänge in eine höhere Mode der wellenleitenden Schicht eingekoppelt wird.
Der effektive Brechungsindex N der wellenleitenden Schicht des Wellenleiters hängt von der Wellenlänge λ des eingestrahlten Lichts, der Ordnung der Wellenleitermode j, den Brechungsindices des Substrats ns, der wellenleitenden Schicht nw und der Deckschicht n_D sowie der Wellenleiterdicke d ab. Die sich für asymmetrische Schichtwellenleiter ergebenden Eigenwertgleichungen zur Bestimmung der effektiven Brechungsindices N können nicht analytisch berechnet werden, sondern müssen numerisch gelöst werden.
Erfindungsgemäß muss die Dicke der wellenleitenden Schicht so gewählt werden, dass für die kürzere Wellenlänge die höhere Wellenleitermode im Wellenleiter erlaubt ist. Da der effektive Brechungsindex für festgelegte Materialien der wellenleitenden Schicht, der Substratschicht und der Deckschicht, sowie bekannter Wellenlänge und Polarisation des eingestrahlten Lichts nur eine Funktion der Dicke d ist, gilt N(λ_k,j_k) = N(λ_k, j_k, d) und es kann das passende Wellenleiterdesign abgeleitet werden.
Für identische Gitterkonstanten Λ_K und einen vorgegebenen Divergenzwinkel Δα (i.d.R. Δα=0) erhält man für zwei Wellenlängen λ₁, λ₂, Moden j₁, j₂ und o.b.d.A. α₂=α₁+Δα folgende Gleichung: $arcsin (N (λ_{1}, j_{1}, d) - \frac{λ_{1}}{Λ_{K}}) = arcsin (N (λ_{2}, j_{2}, d) - \frac{λ_{2}}{Λ_{K}}) - Δ α$
Bis auf die Wellenleiterdicke d sind alle Parameter bekannt, nach numerischem Lösen der Gleichung erhält man diese als Funktion des Divergenzwinkels Δα.
Erfindungsgemäß wird die Dicke d der wellenleitenden Schicht und dessen effektiver Brechungsindex N so gewählt, dass die Führung von Wellenleitermoden der Ordnung j>0 für mindestens eine eingekoppelte Wellenlänge möglich ist.
Das in die wellenleitende Schicht eingekoppelte Licht propagiert entlang der wellenleitenden Schicht (x-Richtung) und fällt außerhalb der wellenleitenden Schicht (z-Richtung) exponentiell ab. Das eingekoppelte Licht trifft in der wellenleitenden Schicht auf das mindestens eine Biogitter.
Im Bereich der Biosensoren sind Gitter zum Ein- und Auskoppeln von Licht bekannt, die biologische Materialien aufweisen und als Fängermoleküle für zu untersuchende Biomoleküle, im folgenden auch Analyt-Moleküle genannt, wirken. Lagern sich solche Biomoleküle an den zum Gitter strukturierten Fängermolekülen an, formen die Biomoleküle ein optisch wirksames Gitter. Solche zum Gitter strukturierten Fängermoleküle mit oder ohne adsorbierende Biomoleküle werden im Folgenden als Biogitter bezeichnet. Ein Biogitter besteht demnach aus Fängermolekülen, die gitterförmig, d.h. wie die Stege eines Gitters auf der Oberfläche des Biochips angebunden sind. Derartige Biogitter sind aus dem Stand der Technik bereits bekannt. Durch die gitterförmige Anlagerung der Analyt-Moleküle an den Fängermolekülen wird ein kleiner Teil des in der wellenleitenden Schicht propagierenden Lichts als Mess-Lichtbündel I_Diff ausgekoppelt. Die Gitterform des Biogitters ist dabei erfindungsgemäß so gewählt, dass das ausgekoppelte Mess-Lichtbündel I_Diff auf eine kleine Fokusfläche in der Brennebene im Abstand f fokussiert wird. Die Gitterform stellt damit eine diffraktive Linse mit der Brennweite f dar. Anhand der gemessenen Intensität I_Diff des gebeugten Lichts kann eine quantitative Aussage über die Massenbelegung getroffen werden.
Erfindungsgemäß weist der Biochip mindestens ein Biogitter auf. Der Biochip kann erfindungsgemäß eine Vielzahl von Biogittern aufweisen, wobei die Biogitter ein-dimensional oder zwei-dimensional angeordnet werden können. Beispielsweise kann der Biochip 14 Biogitter in Propagationsrichtung des Lichtes (x-Richtung) aufweisen und 10 in der y-Richtung. In diesem Fall bilden die Biogitter ein zweidimensionales Biogitter-Array. Die Anordnung von mehr oder weniger Biogittern in einem solchen Biogitter-Array ist möglich. Anordnungen von Biogittern in Biochips sind dem Fachmann bekannt.
Am ersten Biogitter wird nur ein sehr kleiner Anteil des in der wellenleitenden Schicht propagierenden Lichts ausgekoppelt. In einer Ausführungsform der Erfindung propagiert der überwiegende Teil weiter zu einem zweiten (dritten, usw...) Biogitter, welches aus zweiten (dritten, usw...) Fängermolekülen besteht, die wiederum gitterförmig angebunden sind. Die Gitterform ist identisch zur Gitterform des ersten Biogitters und stellt damit ebenfalls eine diffraktive Linse dar. Die zweiten Fängermoleküle unterscheiden sich von den ersten Fängermolekülen des ersten Biogitters und binden damit andere spezifische Analyt-Moleküle, deren Massenbelegung ebenfalls gemessen werden soll. Durch die gitterförmige Anlagerung der zweiten Analyt-Moleküle an den Fängermolekülen wird wiederum ein kleiner Teil des in der wellenleitenden Schicht propagierenden Lichts als zweites Mess-Lichtbündel I_Diff ausgekoppelt und auf die Brennebene fokussiert. In dieser Weise wird an jedem der Biogitter ein Mess-Lichtbündel I_Diff ausgekoppelt und auf die Brennebene der Biogitter fokussiert.
Zusätzlich zur beabsichtigten Auskopplung von Messlicht I_Diff an den Biogittern, kommt es bei der Propagation von Licht in der wellenleitenden Schicht an allen Brechungsindexsprüngen, die ihre Ursache z. B. in Rauheit von Substrat und/oder der wellenleitenden Schicht, Verschmutzungen auf der Wellenleiteroberfläche, Materialinhomogenitäten usw. haben, zur unbeabsichtigten Auskopplung von elastisch gestreutem Licht I_Scat, das ebenfalls in Richtung der Brennebene des mindestens einen Biogitters ausgelenkt wird.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist weiterhin ein erstes Objektiv mit einer Brennweite f₁, ein zweites Objektiv mit einer Brennweite f₂, ein drittes Objektiv mit einer Brennweite f₃, einen Strahlteiler mit einer Halterung, eine erste Lochblende und einen ersten und einen zweiten Detektor auf. Weiterhin ist die Vorrichtung dazu eingerichtet, die Brennebene des mindestens einen Biogitters auf den ersten Detektor abzubilden und simultan die Oberfläche der Oberseite der wellenleitenden Schicht auf den zweiten Detektor abzubilden.
Ein Objektiv ist ein sammelndes optisches System, das eine reelle optische Abbildung eines Gegenstands erzeugt. Im einfachsten Fall handelt es sich hierbei um eine einzelne Sammellinse. In der Praxis nutzt man heute Objektive, die aus vielen Linsen bestehen, sodass die Abbildungsfehler minimiert werden. In Rahmen der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt mehrlinsige Objektive mit entsprechend hoher Abbildungsqualität gewählt, die lichtstark (d.h. hohe numerische Apertur), kompakt und robust sind. Die Beschreibung des Strahlenganges an den Objektiven erfolgt über die sogenannten Hauptebenen, dies sind zwei definierte Ebenen, in denen vereinfacht die Brechung der Lichtstrahlen angenommen werden kann. Vorteil der Hauptebenen ist, dass ein Mehrlinsensystem, wie z. B. ein Objektiv, durch nur eine Linse mit nur einer äquivalenten Brennweite und zwei Hauptebenen ausgedrückt werden kann. Entsprechend weist jedes Objektiv der erfindungsgemäßen Vorrichtung zwei Hauptebenen auf.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind die Detektoren der vorliegenden Vorrichtung ausgewählt aus der Gruppe der fotoempfindlichen Detektoren, enthaltend Photodioden, Photomultiplier-Tubes, Zeilendetektoren, Kameradetektoren, Avalanche-Photodioden oder Arrays derselben. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann zumindest ein Detektor als mehr-dimensionales Detektorarray ausgeführt sein. Bevorzugt ist dieser als 1-dimensionales oder 2-dimensionales Detektorarray ausgeführt.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die Vorrichtung weiterhin eine erste Trennwand zur Abschirmung von Streulicht beim Einkoppeln des Lichts in die wellenleitende Schicht auf.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die Vorrichtung weiterhin einen Strahlfänger zur Absorption des beim Einkoppeln transmittierten Lichtanteils auf.
In einem ersten Mess-Modus, dem sogenannten diffraktiven Modus, wird das von dem mindestens einen Biogitter aus dem Wellenleiter ausgekoppelte Licht I_Diff detektiert. Hierzu wird die Brennebene der Biogitter, in welche das Messlicht I_Diff fokussiert wird, mit Hilfe eines ersten Objektivs O1 (Eingangsobjektiv) und eines zweiten Objektivs O2 (Ausgangsobjektiv) mit den jeweiligen Brennweiten f₁ und f₂ auf einen ersten Detektor D1 abgebildet, der sich im Abstand f₂ von der bildseitigen Hauptebene H2' des zweiten Objektivs O2 befindet. Sind die Brennweiten f₁ und f₂ des ersten Objektivs O1 und des zweiten Objektivs O2 gleich, also f₁=f₂, ergibt sich somit eine Abbildung mit Vergrößerung M=-1.
Erfindungsgemäß ist das erste Objektiv O1 so angeordnet, dass sich dessen objektseitige Hauptebene H₁' im Abstand f₁ von der Brennebene des mindestens einen Biogitters befindet. Zwischen dem ersten Objektiv und dem zweiten Objektiv ist eine erste Lochblende angeordnet. Bevorzugt ist die erste Lochblende im Abstand f₁ von der bildseitigen Hauptebene H₁ des ersten Objektivs O1 und im Abstand f₂ von der objektseitigen Hauptebene H₂ des zweiten Objektivs O2 angeordnet. Diese Anordnung der ersten Lochblende ist besonders vorteilhaft, da sich an diesem Ort eine Fourierebene ergibt. Die erste Lochblende stellt damit eine Fourierblende dar, so dass eine k-Raum-Filterung, also eine Winkelfilterung, umgesetzt wird. Der Begriff Fourierblende wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung synonym zum Begriff erste Lochblende genutzt. Die erste Lochblende weist eine Öffnung auf, durch die das Mess-Lichtbündel hindurchtritt. Dabei wird der Durchmesser d der Blendenöffnung so gewählt, dass sich die gewünschte numerische Apertur gemäß NA=d/2f ergibt. Auf diese Weise kann die numerische Apertur der Detektionsoptik derart angepasst werden, dass unerwünschtes Streulicht I_Scat, welches in andere Moden als die Messmode abgestrahlt wird, blockiert wird.
Messmode bezeichnet damit jenen Anteil des Lichts, der aus dem Ort des diffraktiven Biogitters in die Richtungen, in die das Biogitter beugt, abgestrahlt wird. Licht, das z. B. aufgrund von Rauheit des Wellenleiters von außerhalb oder in andere Richtungen abgestrahlt wird, entfällt auf andere Moden und soll geblockt werden. Die Blende in der Fourierebene ergibt somit einen erwünschten Modenfilter.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die erste Lochblende ortsveränderlich. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die erste Lochblende in x-Richtung und/oder in y-Richtung verschiebbar ausgeführt. So können Verkippungen des aus dem Biochip ausgekoppelten Mess-Lichtbündels um die R_x- und R_y-Achse kompensiert werden.
Wie bereits beschrieben, wird nicht nur das Mess-Lichtbündel I_Diff aus der wellenleitenden Schicht ausgekoppelt sondern auch elastisch gestreutes Licht I_Scat. Unter Kenntnis des Intensitätsprofils des elastisch gestreuten Lichts I_Scat kann der Wellenleiterverlust berechnet werden, dessen Kenntnis für eine Intensitätsnormierung im Wellenleiter wichtig ist.
Das Intensitätsprofil des elastisch gestreuten Lichts kann über eine Abbildung der Oberseite der wellenleitenden Schicht gemessen werden. Hierfür ist es besonders vorteilhaft, simultan zur Molografie-Messung die Oberseite der wellenleitenden Schicht abzubilden. Aus dem detektierten Bild der Oberseite der wellenleitenden Schicht wird das detektierte Intensitätsprofil des Streulichthintergrunds exponentiell gefittet. Die Abfallkonstante dieser Exponentialfunktion, ggf. in Abhängigkeit von der Position y auf dem Wellenleiter, ist der Wellenleiterverlust, der für gute Wellenleiter (z. B. aus Ta₂O₅) weniger als 1 dB/cm beträgt. Die Bestimmung des Wellenleiterverlustes auf diese Art ist aus dem Stand der Technik bekannt [3].
Um die simultane Abbildung der Oberseite der wellenleitenden Schicht und der Brennebene des mindestens einen Biogitters zu ermöglichen, weist die erfindungsgemäße Vorrichtung einen Strahlteiler auf.
Dieser ist bevorzugt im optischen Weg nach dem ersten Objektiv und vor der ersten Lochblende angeordnet, wobei jedes weitere Objektiv nach dem Strahlteiler angeordnet ist. Erfindungsgemäß ist der Strahlteiler ein dichroitischer Strahlteiler oder ein wellenlängenunabhängiger Strahlteiler. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist der Strahlteiler ein Aufspaltungsverhältnis (Reflektion:Transmission) im Bereich von 1:99 bis 99:1 auf. Bevorzugt weist der Strahlteiler ein Aufspaltungsverhältnis (Reflektion:Transmission) von 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20 oder 90:10 auf. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Halterung des Strahlteilers beweglich ausgebildet. Vorteile dieser Ausführungsform werden noch genannt.
Da das Messlicht I_Diff und das elastisch gestreute Licht I_Scat die gleiche Wellenlänge haben, wird in einer Ausführungsform der Erfindung ein wellenlängenunabhängiger Strahlteiler genutzt.
Ein erster Teil des Lichts I_Diff und I_Scat wird nach Durchgang durch das erste Objektiv O1 am Strahlteiler transmittiert und passiert, wie schon oben beschrieben, die erste Lochblende, welche einen Großteil des Streulichts I_Scat absorbiert, bevor es mit einem zweiten Objektiv (Ausgangsobjektiv) O2 auf den ersten Detektor D1 abgebildet wird. Dort werden die Signale des mindestens einen diffraktiven Biogitters detektiert.
Ein zweiter Teil des Lichts I_Diff und I_Scat wird nach Durchgang durch das erste Objektiv O1 am Strahlteiler reflektiert und mit einem dritten Objektiv O3 (Ausgangsobjektiv) auf den zweiten Detektor D2 abgebildet. Beide Abbildungen teilen sich somit das erstes Objektiv O1 als gemeinsames Eingangsobjektiv und haben jeweils separate Objektive, nämlich das zweite Objektiv O2 und das dritte Objektiv O3 als Ausgangsobjektive. Im Folgenden wird die Abbildung O1-O2-D1 als bezeichnet und die Abbildung O1-O3-D2 als .
Um für solche, sogenannte Tandemobjektivanordnungen, bei gegebener Gegenstandsweite g_in (Abstand objektseitige Hauptebene H₁' des ersten Objektivs O1 zum abzubildenden Gegenstand) die jeweiligen Bildweiten b_out zu berechnen, das sind b2 (Abstand bildseitige Hauptebene H₂' des zweiten Objektivs O2 zu erstem Detektor D1) und b3 (Abstand bildseitige Hauptebene H₃' des dritten Objektivs O3 zu zweiten Detektor D2), wendet man die Abbildungsgleichung zweimal an. Die Dicke des von den Lichtbündeln passierten Substrats, die im Allgemeinen klein ist gegen die Brennweiten der Objektive, wird bei der folgenden analytischen Berechnung der Übersichtlichkeit halber vernachlässigt. Die durch sie verursachten geringfügigen Korrekturen der entsprechenden Abstände können im Rahmen der üblichen Montagetoleranzen kompensiert werden. Im Optikdesign mit einschlägigen Simulationspaketen können diese bereits vorab berücksichtigt werden.
Seien g_in, b_in und f_in die Gegenstandsweite, Bildweite und Brennweite des ersten Objektivs O1, so gilt: $b_{in} = {(\frac{1}{ƒ_{in}} - \frac{1}{g_{i n}})}^{- 1}$
Seien weiterhin g_out, b_out und fout die Gegenstandsweite, Bildweite und Brennweite des zweiten Objektivs O2 oder des dritten Objektivs O3, so gilt: $b_{out} = {(\frac{1}{ƒ_{out}} - \frac{1}{g_{out}})}^{- 1}$
Das vom ersten Objektiv O1 erzeugte Bild wird vom zweiten oder dritten Objektiv, das sich im Abstand L (jeweils gemessen von Hauptebene H₁ zur Hauptebene H₂ oder H₃) befindet, wiederum abgebildet, sodass gilt: $g_{out} = - (b_{in} - L)$
Im allgemeinen Fall erhält man dann für die Bildweite b_out: $b_{out} = {(\frac{1}{ƒ_{out}} + {({(\frac{1}{ƒ_{in}} - \frac{1}{g_{in}})}^{- 1} - L)}^{- 1})}^{- 1}$
Für den Spezialfall L=f_in+f_out vereinfacht sich dies zu: $b_{out} = \frac{ƒ_{out} (ƒ_{in} (ƒ_{in} + ƒ_{out}) - ƒ_{out} g_{in})}{ƒ_{in}^{2}}$
Für den Spezialfall einer 4f-Geometrie, also f_in=f_out, L= f_in+f_out =2f_out vereinfacht sich dies weiter zu: $b_{out} = 2 ƒ_{out} - g_{in}$
Das gemeinsame erste Objektiv O1 (Eingangsobjektiv) ist erfindungsgemäß so positioniert, dass seine Brennebene mit der Brennebene des mindestens einen Biogitters und jedem weiteren Biogitter zusammenfällt. Für die Abbildung der Brennebene der Biogitter (diffraktiver Modus) entspricht die Gegenstandsweite g_in somit der Brennweite des ersten Objektivs O1, also g_in=f_in. Auf diese Weise erhält man für einen Unendlichstrahlengang, in welchen eine erste Lochblende (Fourierblende) als Modenfilter, und ein Strahlteiler eingebracht werden können. In einem Abstand L (gemessen zwischen den beiden Hauptebenen H₁ und H₂) vom ersten Objektiv O1 ist ein zweites Objektiv O2 als Ausgangsobjektiv positioniert, das ein Bild auf einem ersten Detektor D1 erzeugt. Mit g_in=f_in folgt für die Bildweite am zweiten Objektiv (Ausgangsobjektiv) allgemein aus Gleichungen (5), (6), oder (7) b_out=f_out bzw., da es sich im konkreten Fall um das zweite Objektiv O2 handelt, b₂=f₂. Der erste Detektor D1 muss also in der Brennebene des zweiten Objektivs O2 positioniert werden, um die Brennebene der Biogitter scharf abzubilden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der erste Detektor D1 daher in der Brennebene des zweiten Objektivs O2 angeordnet.
Die Abbildung der Oberfläche der wellenleitenden Schicht (Oberflächenmodus) basiert auf demselben, fest positionierten, ersten Objektiv O1 als Eingangsobjektiv. Die Gegenstandsweite g_in dieser Abbildung ist somit um die Brennweite f der Biogitter verlängert, also g_in=f_in+f. In einem Abstand L (gemessen zwischen den Hauptebenen H₁ und H₃) vom ersten Objektiv O1 ist ein drittes Objektiv O3 als Ausgangsobjektiv positioniert, das ein Bild auf einem zweiten Detektor D2 erzeugt. Mit g_in=f_in+f folgt für die Bildweite am dritten Objektiv O3 allgemein aus Gleichung (5) b_out=(1/f_out +((f_in ²+ff_in)/f-L)^-1)^-1 bzw., da es sich im konkreten Fall beim Ausgangsobjektiv um O3 handelt, b₃=(1/f₃ +((f₁ ²+ff₁)/f-L)^-1)^-1. Für den Spezialfall L=f_in+f_out vereinfacht sich dies nach Gleichung (6) zu b_out=f_out-f(f_out/f_in)² bzw. b₃=f₃-f(f₃/f₁)². Im Spezialfall einer 4f-Geometrie mit f_in=f_out vereinfacht sich dies nach Gleichung (7) weiter zu b_out=f_out-f, bzw. b₃=f₃-f. Da sich die Oberseite der wellenleitenden Schicht in einer größeren Gegenstandsweite g_in relativ zum gemeinsamen ersten Objektiv O1 befindet, reduziert sich also die zugehörige Bildweite b₃ am dritten Objektiv O3. Der zweite Detektor D2 muss folglich in einem Abstand kleiner als die Brennweite f₃ zum dritten Objektiv O3 positioniert werden, um die Oberseite der wellenleitenden Schicht scharf abbilden zu können. Hierbei ist zu beachten, dass dies nur möglich ist, solange die Bildweite b3 hinreichend groß bleibt, sodass das Bild außerhalb der letzten optischen Oberfläche des Ausgangsobjektivs O3 erzeugt wird. Mit der hinteren Scheitelbrennweite (besser bekannt als back focal length) f_bfl,3 von Objektiv O3 ist diese Bedingung erfüllt, solange gilt: b₃>f₃- f_bfl,3.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der zweite Detektor daher im Abstand f₃-f(f₃/f₁)² zur bildseitigen Hauptebene H₃' des dritten Objektivs angeordnet. Weiterhin ist der zweite Detektor dabei bevorzugt in einem Abstand größer als f₃- f_bfl,3 zur bildseitigen Hauptebene H₃'des dritten Objektivs angeordnet. In einer Ausführungsform ist der Abstand des zweiten Detektors D2 zur bildseitigen Hauptebene H₃' des dritten Objektivs in einem geringen Maße von unterhalb 1% verstellbar, sodass die abbildende Optik auch bei mechanischen Lagetoleranzen des Biochips und chromatischer Aberration der Objektive exakt auf die Oberfläche der wellenleitenden Schicht scharfgestellt werden kann
Sind die beiden optischen Abbildungen erfindungsgemäß ausgelegt, so ist die aus dem ersten Objektiv O1, dem zweiten Objektiv O2 und dem ersten Detektor D1 (O1-O2-D1) bestehende auf die Brennebene des mindestens einen Biogitters scharfgestellt (b2=f2, diffraktiver Modus), während die aus erstem Objektiv O1, dritten Objektiv O3 und zweiten Detektor D2 (O1-O3-D2) bestehende auf die Oberseite der wellenleitenden Schicht scharfgestellt ist (b₃=f₃-f(f₃/f₁)², Oberflächenmodus). Diese Ausführung ist besonders vorteilhaft, da unter Verwendung desselben Eingangsobjektivs, nämlich des ersten Objektivs O1, zeitgleich zwei verschiedene Gegenstandsebenen abgebildet werden können.
Weiterhin vorteilhaft ist, dass unter Verwendung des ersten Objektivs O1 als gemeinsames Eingangsobjektiv Abbildungen mit verschiedenen numerischen Aperturen realisiert werden können. Die numerische Apertur von wird durch eine erste Lochblende, die als Fourierblende fungiert, begrenzt, und so auf die numerische Apertur der fokussierenden Biogitter angepasst. Auf diese Weise kann I_Diff detektiert werden, während der Großteil des elastischen Streulichts I_Scat von der Fourierblende blockiert wird. Im Gegensatz dazu wird ohne Fourierblende ausgeführt, was zu einer hohen numerischen Apertur und damit hoher Lichtstärke führt, und eine genaue Detektion des schwachen Streulichthintergrunds am Wellenleiter ermöglicht. Die hohe numerische Apertur von geht mit einer geringen Tiefenschärfe einher, sodass es vorteilhaft ist, das dritte Objektiv O3 und/oder den zweiten Detektor D2 in x-Richtung verstellbar auszuführen, sodass die abbildende Optik auch bei mechanischen Lagetoleranzen des Biochips und chromatischer Aberration der Objektive exakt auf die Oberfläche der wellenleitenden Schicht scharfgestellt werden kann.
In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind daher mindestens ein Detektor und/oder das dritte Objektiv entlang des Strahlenganges ortsveränderlich. Besonders bevorzugt sind der zweite Detektor und/oder das dritte Objektiv entlang des Strahlenganges ortsveränderlich. Ortsveränderlich bedeutete in diesem Zusammenhang, dass der Detektor und/oder das dritte Objektiv mindestens entlang einer Achse im Raum bewegt werden können. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der mindestens eine Detektor und/oder das dritte Objektiv in x-Richtung verstellbar, d.h. in Richtung des optischen Weges des Lichtstrahlenbündels, dass auf den mindestens eine Detektor und/oder das dritte Objektiv fällt.
Alternativ kann zur Vergrößerung des Tiefenschärfebereichs die numerische Apertur von durch eine geeignete Blende reduziert werden. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vor dem dritten Objektiv daher eine zweite Lochblende im Strahlengang angeordnet. Bei mehrlinsigen Objektiven kann diese Blende auch innerhalb des Objektivs angeordnet werden, entsprechende Optiken mit - ggf. verstellbarer - Blende sind aus dem Stand der Technik bekannt und kommerziell verfügbar. Dabei wird der Durchmesser d der Blendenöffnung so gewählt, dass sich die gewünschte numerische Apertur gemäß NA=d/2f ergibt.
Besonders vorteilhaft an der vorliegenden Erfindung ist, dass es sich bei der am Strahlteiler transmittierten um einen Unendlichstrahlengang bezüglich der Brennebene zwischen dem ersten Objektiv O1 und dem zweiten Objektiv O2 handelt. Auf diese Weise treten bei der Transmission durch die planparallele Platte des Strahlteilers keine Abbildungsfehler auf. Bei handelt es sich wegen der vergrößerten Gegenstandweite nicht um einen Unendlichstrahlengang, dieser wird am Strahlteiler aber reflektiert, sodass ebenfalls keine Abbildungsfehler auftreten.
Prinzipiell können die am Strahlteiler entstehenden reflektierten und transmittierten Strahlengänge auch vertauscht werden, sodass der reflektierte Anteil durch die erste Lochblende geleitet und mit dem zweiten Objektiv O2 auf den ersten Detektor D1 abgebildet wird, während der transmittierte Anteil mit dem dritten Objektiv O3 auf den zweiten Detektor D2 abgebildet wird. In diesem Fall erfährt aber der Nicht-Unendlichstrahlengang von eine Transmission durch die planparallele Platte des Strahlteilers, was zu entsprechenden nachteiligen Abbildungsfehlern führen kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der am Strahlteiler transmittierte Anteil des Lichts durch die erste Lochblende über das zweite Objektiv O2 auf den ersten Detektor D1 gelenkt und der reflektierte Anteil des Lichts wird über das dritte Objektiv O3 auf den zweiten Detektor D2 gelenkt.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der am Strahlteiler reflektierte Anteil des Lichts durch die erste Lochblende über das zweite Objektiv O2 auf den ersten Detektor D1 gelenkt und der transmittierte Anteil des Lichts wird über das dritte Objektiv O3 auf den zweiten Detektor D2 gelenkt.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind auf der Oberseite der wellenleitenden Schicht Fluorophore angeordnet. Die Fluorophore können beispielsweise fluoreszenz-gelabelte Biomoleküle sein. Bei Anregung mit einer passenden Anregungswellenlänge, kommt es zusätzlich zur Emission von Fluoreszenzlicht I_Fluoro, das ebenfalls in Richtung des ersten Objektivs O1 ausgelenkt wird.
In dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wird zusätzlich zum diffraktiven Modus der sogenannte Fluoreszenzmodus des Biosensors realisiert, bei dem die Oberfläche der wellenleitenden Schicht abgebildet wird, und so die Intensität des emittierten Fluoreszenzlichts I_Fluoro gemessen wird.
Wie bereits beschrieben, wird eine Geometrie mit einem gemeinsamen ersten Objektiv O1 als Eingangsobjektiv und einem zweiten und einem dritten Objektiv O2, O3 als Ausgangsobjektiven genutzt, wobei sich der erste Detektor D1 und der zweite Detektor D2 in den entsprechenden Bildweiten b₂=f₂ bzw. b₃=f₃-f(f₃/f₁)² befinden, sodass einmal die Brennebene der Biogitter und einmal die Oberseite der wellenleitenden Schicht scharf abgebildet wird.
Ziel dieser Ausführungsform ist es, neben der Molografie, Licht zu detektieren, das von auf der Wellenleiteroberfläche angelagerten Fluorophoren emittiert wird. Dessen Wellenlänge ist, verglichen mit der im Wellenleiter geführten Anregungswellenlänge, zu größeren Wellenlängen Stokes-verschoben. Daher wird in den Strahlengang, nach einem gemeinsamen ersten Objektiv O1 (Eingangsobjektiv) in dieser Ausführungsform ein dichroitischer Strahlteiler mit eingebracht, dessen spektrale Kante sich zwischen den Wellenlängen des elastisch gestreuten Lichts I_Diff und des Fluoreszenzlichts I_Fluoro befindet, also zwischen λ_Diff und λ_Fluoro. Dieser dichroitische Strahlteiler trennt die an den Biogittern elastisch gestreuten und die von den Fluorophoren emittierten Lichtanteile spektral, und zwar so, dass die Lichtanteile I_Diff und I_Scat transmittiert werden und das emittierte Fluoreszenzlicht I_Fluoro reflektiert wird.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der dichroitische Strahlteiler als Longpass Filter oder als Shortpass Filter ausgebildet.
In einer Ausführungsform wird die Molografie und die Fluoreszenz mit der gleichen Wellenlänge angeregt, d.h. λ_Diff=λ_Anregung<λ_Fluoro, mit der Molografiewellenlänge λ_Diff, der Anregungswellenlänge λ_Anregung, und der Fluoreszenzwellenlänge λ_Fluoro. In diesem Fall wird ein Shortpass Filter als dichroitischer Strahlteiler gewählt, der das kurzwellige λ_Diff mit der Intensität I_Diff transmittiert und λ_Fluoro mit der Intensität I_Fluoro reflektiert.
In einer weiteren Ausführungsform werden Fluoreszenz und Molografie über zwei separate Wellenlängen angeregt. In diesem Fall wird Licht zweier Wellenlängen, wie bereits eingangs beschrieben, simultan in die wellenleitende Schicht eingekoppelt. I_Diff wird damit bei einer größeren Wellenlänge erzeugt, d.h. λ_Anregung<λ_Fluoro<λ_Diff. In dieser Ausführungsform wird ein Longpass Filter als dichroitischer Strahlteiler eingesetzt, was wiederum dazu führt, dass I_Diff transmittiert und I_Fluoro reflektiert wird.
Der Lichtanteil bestehend aus I_Diff und I_Scat wird nach Durchgang durch das erste Objektiv O1 am Strahlteiler transmittiert und passiert die Fourierblende, welche einen Großteil des Streulichts I_Scat absorbiert, bevor es mit einem zweiten Objektiv O2 (Ausgangsobjektiv) auf den ersten Detektor D1 abgebildet wird ( ).
Der von Fluorophoren emittierte Anteil des Lichts I_Fluoro wird nach Durchgang durch das erste Objektiv O1 am Strahlteiler reflektiert und mit einem dritten Objektiv O3 (Ausgangsobjektiv) auf den zweiten Detektor D2 abgebildet. Bevorzugt wird dieser Anteil des Lichts durch einen Filter gefiltert, um verbliebenes Anregungslicht (Wellenlänge λ_Anregung) zu blockieren.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vor dem zweiten Detektor D2 mindestens ein Filter im Strahlengang angeordnet. In einer Ausführungsform können 1 bis 4, bevorzugt 1 bis 3, besonders bevorzugt 1 Filter vor dem zweiten Detektor D2 angeordnet sein. Erfindungsgemäß ist der mindestens ein Filter ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Emissionsfilter und Passfilter. Der Filter ist erfindungsgemäß im Strahlengang zwischen dem Strahlteiler und dem zweiten Detektor angeordnet.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Emissionsfilter vor dem zweiten Detektor D2 angeordnet.
In einer weiteren Ausführungsform ist der mindestens ein Filter vor dem zweiten Detektor senkrecht zum Strahlengang ortsveränderlich. In einer Ausführungsform ist jeder Filter der vor dem zweiten Detektor D2 angeordnet ist senkrecht zum Strahlengang ortsveränderlich. Damit kann der mindestens eine Filter und jeder weitere Filter bei Bedarf aus dem Strahlengang heraus oder hineinbewegt werden.
Diese Ausführungsform hat den Vorteil, dass bei Bedarf zwischen der Detektion des Fluoreszenzlichts (I_Fluoro) und des elastisch gestreuten Lichts mit dem zweiten Detektor D2 gewechselt werden kann. Wird als Filter ein für die Messung des Fluoreszenzlichts geeigneter Emissionsfilter verwendet und befindet sich dieser im Strahlengang, so wird über den zweiten Detektor D2 das Fluoreszenzlicht mit der Intensität I_Fluoro detektiert. Bei herausbewegtem Emissionsfilter oder Verwendung eines Passfilters passend zur Anregungs- oder Molografiewellenlänge kann dagegen das regulär am wellenlängenunabhängigen Strahlteiler oder parasitär am dichroitischen Strahlteiler reflektierte (die Reflektion ist auch im transmittierten Wellenlängenbereich nie exakt R=0) elastisch gestreute Licht I_Scat detektiert werden, sodass man ein Bild der Oberseite der wellenleitenden Schicht erhält.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird daher zusätzlich zum Filter auch der Halter des Strahlteilers beweglich ausgeführt. Dies hat den Vorteil, dass zwischen verschiedenen Konfigurationen gewechselt werden kann. Eine erste Konfiguration kann beispielsweise einen dichroitischen Strahlteiler und einen Emissionsfilter aufweisen, während eine zweite Konfiguration einen wellenlängenunabhängigen Strahlteiler ohne Filter vor dem zweiten Detektor D2 oder einen wellenlängenunabhängigen Strahlteiler und einen zur Anregungswellenlänge der Biogitter passenden Passfilter vor dem zweiten Detektor D2 aufweist. In der ersten Konfiguration ist dann die Fluoreszenzabbildung wie beschrieben realisiert. In der zweiten Konfiguration ist dagegen die Oberflächenabbildung der wellenleitenden Schicht bei der Wellenlänge zur Anregung der Biogitter realisiert.
Vollkommen analog zur obigen Diskussion ergeben sich für die Detektion des Molografiesignals simultan mit dem Fluoreszenzsignal dieselben bereits beschriebenen Vorteile, nämlich die simultane optische Abbildung zweier verschiedener Gegenstandsebenen unter Benutzung nur eines Eingangsobjektives, nämlich des ersten Objektives O1 als Eingangsobjektiv, wobei es sich bei in dieser Ausführungsform um eine Fluoreszenzabbildung handelt.
Insbesondere für die Abbildung der vergleichsweise schwachen Fluoreszenzemission ist wiederum die hohe numerische Apertur von vorteilhaft, welche mit einer hohen Lichtstärke (Collection Efficiency) und einer hohen optischen Auflösung einhergeht, was es ermöglicht, auf der Oberseite der wellenleitenden Schicht angelagerte biologische Zellen direkt betrachten zu können. Hierbei ist es wegen der geringen Tiefenschärfe von wiederum vorteilhaft, das dritte Objektiv O3 und/oder den zweiten Detektor D2 entlang des Strahlenganges verstellbar auszuführen, sodass die abbildende Optik auch bei mechanischen Lagetoleranzen des Biochips und chromatischer Aberration der Objektive exakt auf die Fluorophore auf der Oberseite der wellenleitenden Schicht scharfgestellt werden kann.
Besonders vorteilhaft an der gezeigten Geometrie ist wiederum, dass der dichroitische Strahlteiler so ausgeführt ist, dass der von Fluorophoren emittierte Anteil I_Fluoro reflektiert und anschließend mit dem dritten Objektiv O3, unter zusätzlicher Filterung mit einem Emissionsfilter, auf den zweiten Detektor D2 abgebildet wird. Da es sich wegen der vergrößerten Gegenstandsweite bei nicht um einen Unendlichstrahlengang handelt, ist es vorteilhaft, dass dieser Strahlengang am Strahlteiler reflektiert wird, sodass keine Abbildungsfehler auftreten. Bei der transmittierten handelt es sich wiederum um einen Unendlichstrahlengang, für den bei der Transmission durch die planparallele Platte des Strahlteilers keine Abbildungsfehler auftreten.
Auch in dieser Ausführungsform kann der dichroitische Strahlteiler mit einem invertierten Reflektions- bzw. Transmissionsprofil ausgeführt werden. Dies führt zu einer entsprechenden Vertauschung der Strahlengänge, sodass der von Fluorophoren emittierte Anteil I_Fluoro transmittiert und mit dem dritten Objektiv O3 unter zusätzlicher Filterung mit einem Emissionsfilter auf den zweiten Detektor D2 abgebildet wird. In diesem Fall erfährt aber der Nicht-Unendlichstrahlengang von eine Transmission durch die planparallele Platte des dichroitischen Strahlteilers, was zu entsprechenden nachteiligen Abbildungsfehlern führt.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Lichtanteil I_Fluoro am Strahlteiler transmittiert und mit dem dritten Objektiv O3 unter zusätzlicher Filterung mit einem Emissionsfilter auf den zweiten Detektor D2 abgebildet und der Lichtanteil I_Diff und I_Scat wird am Strahlteiler reflektiert und mit dem zweiten Objektiv O2 auf dem ersten Detektor D1 abgebildet. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Lichtanteil I_Fluoro am Strahlteiler reflektiert und mit dem dritten Objektiv O3 unter zusätzlicher Filterung mit einem Emissionsfilter auf den zweiten Detektor D2 abgebildet und der Lichtanteil I_Diff und I_Scat wird am Strahlteiler transmittiert und mit dem zweiten Objektiv O2 auf dem ersten Detektor D1 abgebildet.
Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zur simultanen Abbildung der Brennebene des mindestens einen Biogitters und der Oberseite der wellenleitenden Schicht mit Hilfe einer Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

Alle Merkmale die bereits für die erfindungsgemäße Vorrichtung beschrieben wurden, treffen genauso auf das erfindungsgemäße Verfahren zu und umgekehrt.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird Licht aus mindestens einer Lichtquelle in die wellenleitende Schicht eingekoppelt. In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Licht aus zwei Lichtquellen simultan in die wellenleitende Schicht der Vorrichtung eingekoppelt. Einzelheiten hierzu sind bereits beschrieben.
Ein Teil des in die wellenleitende Schicht eingekoppelten Lichts wird als erstes Mess-Lichtbündel der I_Diff durch das mindestens eine Biogitter der Vorrichtung ausgekoppelt. In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Vorrichtung mehr als ein Biogitter auf, so dass je ein weiteres Mess-Lichtbündel durch jedes weitere Biogitter ausgekoppelt wird.
Erfindungsgemäß wird weiterhin elastisch gestreutes Licht I_Scat und/oder emittierten Fluoreszenzlicht I_Fluoro aus der wellenleitenden Schicht ausgekoppelt. In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden demnach ein oder mehrere Messbündel I_Diff und elastisch gestreutes Licht der Intensität I_Scat ausgekoppelt. Befinden sich auf der Oberseite der wellenleitenden Schicht Fluorophore, die durch das eingekoppelte Licht angeregt werden, so werden in dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ein oder mehrere Messbündel I_Diff, elastisch gestreutes Licht der Intensität I_Scat und emittierten Fluoreszenzlicht I_Fluoro aus der wellenleitenden Schicht ausgekoppelt.
Erfindungsgemäß wird das ausgekoppelte Licht in einem ersten Objektiv O1, welches als gemeinsames Eingangsobjektiv dient, aufgefangen. Das ausgekoppelte Licht wird auf einen Strahlteiler gelenkt und durch diesen in einen ersten und einen zweiten optischen Strahlengang aufgespalten. Der erste optische Strahlengang wird über die erste Lochblende, die eine Fourierblende darstellt, und ein zweites Objektiv O2 auf den ersten Detektor D1 abgebildet. Der zweite optische Strahlengang wird über das dritte Objektiv O3 und optional mindestens ein weiteres optisches Element auf den zweiten Detektor D2 abgebildet. Das mindestens eine weitere optische Element ist dabei erfindungsgemäß ausgewählt aus der Gruppe enthaltend Filter und Lochblende.
In einer bevorzugten Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens wird über den ersten Strahlengang das Licht des mindestens einen Messbündels I_Diff und jedes weiteren Messbündels I_Diff auf den ersten Detektor D1 abgebildet und das elastisch gestreute Licht I_Scat oder das emittierte Fluoreszenzlicht I_Fluoro über den zweiten Strahlengang auf den zweiten Detektor D2.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird auf dem ersten Detektor D1 die Brennebene des mindestens einen Biogitters und jedes weiteren Biogitters abgebildet und auf dem zweiten Detektor D2 die Oberfläche der Oberseite der wellenleitenden Schicht.
Erfindungsgemäß erfolgt die Abbildung des ersten optischen Strahlenganges auf den ersten Detektor D1 und die Abbildung des zweiten optischen Strahlenganges auf den zweiten Detektor D2 simultan, d.h. zeitgleich.
Um eine simultane Detektion der Brennebene der Biogitter (Molografie-Modus) und der Wellenleiteroberfläche (Oberflächen- bzw. Fluoreszenzmodus) des Biochips zu erreichen, sieht die vorliegende Erfindung vor, das aus dem Wellenleiter stammende Licht mit einem gemeinsamen ersten Objektiv O1, dem Eingangsobjektiv, aufzufangen, es sodann mit Hilfe eines Strahlteilers in zwei optische Strahlengänge aufzuspalten, und mit Hilfe zweier separater weiterer Objektive O2, O3, den Ausgangsobjektiven, auf zwei separate Detektoren D1, D2, abzubilden. Bevorzugt weist die vorliegende Erfindung daher drei Objektive auf. In die resultierenden Strahlengänge werden zusätzliche optische Elemente eingebracht, sodass die verschiedenen optischen Pfade hinsichtlich Lage der Brennebene, numerische Apertur und detektierbarer Wellenlänge individuell ausgestaltet werden können.
Die Verwendung eines gemeinsamen Eingangsobjektivs ist besonders vorteilhaft, da dies eine besonders platz- und materialsparende Realisierung, sowie eine hohe numerische Apertur ermöglicht. Zum Vergleich: Die beschriebene simultane Abbildung könnte auch mit zwei separaten abbildenden Optiken realisiert werden. In diesem Fall würde man nach den abzubildenden Ebenen zuerst einen Strahlteiler einbringen, um die optischen Pfade zu trennen. Dann würde in jeden der beiden optischen Pfade ein Detektor, also eine Kamera, und eine Optik bestehend aus je zwei Objektiven eingebracht werden, was in insgesamt vier Objektiven resultieren würde. Der Strahlteiler vor dem Eingangsobjektiv würde außerdem eine höhere Gegenstandweite der nachfolgenden Abbildung erfordern, sodass eine vorteilhafte hohe numerische Apertur der Abbildung nicht erreicht werden könnte. Der simpelste Fall einer einlinsigen Abbildung kann die Aufgabe der vorliegenden Erfindung schon aufgrund der allgemein bekannten nachteiligen Bildfehler nicht lösen.
Die Verwendung des ersten Objektives O1 als gemeinsames Eingangsobjektivs ist weiterhin vorteilhaft, da der benötigte Strahlteiler dann in den Unendlichstrahlengang zwischen Eingangs- und Ausgangsobjektiv (zweites Objektiv O2) eingebracht werden kann, sodass durch diesen keine Abbildungsfehler durch sphärische Aberration erzeugt werden.
Weiterhin vorteilhaft ist, dass die Verwendung des ersten Objektives O1 als gemeinsames Eingangsobjektiv konstruktiv sicherstellt, dass die zugehörigen optischen Abbildungen denselben Bereich des Biochips abbilden, sodass die entsprechenden Bilder übereinandergelegt und verglichen werden können.
Darüber hinaus werden durch die Nutzung des ersten Objektives O1 als gemeinsames Eingangsobjektiv und eines nachfolgenden Strahlteilers, zwei separate optische Pfade ermöglicht, die individuell, z. B. hinsichtlich Schärfeebene, numerische Apertur und Wellenlänge ausgestaltet werden können.
Simultan können daher zwei Abbildungen unterschiedlicher Gegenstandsebenen mit unterschiedlichen numerischen Aperturen und Wellenlängenbereichen umgesetzt werden, wobei der kompakte Optikpfad mit Strahlteiler im Unendlich-Teil eine hohe numerische Apertur und eine gute Abbildungsqualität erlaubt. Nicht zuletzt können durch die Einsparung eines Objektivs im Hinblick auf den Stand der Technik Kosten und Bauraum gespart werden.
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung weiterhin anhand von zwei Figuren und zwei Ausführungsbeispielen näher erläutert.

1 stellt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar, bei der elastisch gestreutes Licht I_Scat auf dem zweiten Detektor D2 abgebildet wird;
2 stellt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar, bei der emittiertes Fluoreszenzlicht I_Fluoro auf dem zweiten Detektor D2 abgebildet wird.

Allgemein ist anzumerken, dass in den 1 und 2 das erste Objektiv O1 50, das zweite Objektiv O2 53 und das dritte Objektiv O3 54 vereinfacht als einlinsige Objektive dargestellt sind, erfindungsgemäß handelt es sich bei den Objektiven jedoch um mehrlinsinge Objektive.
1 stellt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar, bei der elastisch gestreutes Licht I_Scat auf dem zweiten Detektor D2 61 und die Messlichtbündel I_Diff der drei Biogitter 33, 34, 35 auf dem ersten Detektor D1 60 abgebildet werden. Zunächst wird Licht der Lichtquelle 10 über die Linse 15 und das Einkoppelgitter 20 in die wellenleitende Schicht 30 eingekoppelt. Oberhalb des Einkoppelgitters 20 befindet sich ein Strahlfänger 16, der den am Einkoppelgitter 20 transmittierten Lichtanteil absorbiert, sodass vagabundierendes Streulicht vermieden wird. Das eingekoppelte Licht propagiert in der wellenleitenden Schicht 30 und trifft auf das erste Biogitter 33. An diesem wird ein Teil des propagierenden Lichts als Mess-Lichtbündel I_Diff ausgekoppelt. Der restliche Teil des Lichts propagiert weiter in der wellenleitenden Schicht 30 und trifft auf das zweite Biogitter 34, an welchem ebenfalls ein Mess-Lichtbündel I_Diff ausgekoppelt wird. Dasselbe passiert am dritten Biogitter 35. Die ausgekoppelten Mess-Lichtbündel I_Diff werden auf eine kleine Fokusfläche in der Brennebene der Biogitter 40 im Abstand f fokussiert. Die Gitterform der Biogitter 33, 34, 35 stellt damit eine diffraktive Linse mit der Brennweite f dar.
Im Abstand f₁ von der Brennebene der Biogitter 33, 34, 35 befindet sich die objektseitige Hauptebene H₁' des ersten Objektivs O1 50 mit der Brennweite f₁. Das erste Objektiv O1 50 dient als gemeinsames Eingangsobjektiv. Diesem nachgeordnet ist der Strahlteiler 51, der das ausgekoppelte Licht in zwei Strahlengänge aufteilt. Der Strahlteiler ist in dieser Ausführungsform ein wellenlängenunabhängiger Strahlteiler. Der erste Strahlengang wird dabei erfindungsgemäß auf den ersten Detektor D1 60 abgebildet. Im ersten Strahlengang befindet sich nach dem Strahlteiler 51 eine erste Lochblende 52, das zweite Objektiv O2 53 mit der Brennweite f₂ und der erste Detektor D1 60. Die erste Lochblende 52 befindet sich im Abstand f₁ von der Hauptebene H₁ des ersten Objektivs O1 50 und im Abstand f₂ von der Hauptebene H₂ des zweiten Objektivs O2 53.
Die erste Lochblende 52 befindet sich daher in einer Fourierebene, so dass ein k-Raum Filterung, d.h. eine Winkelfilterung realisiert wird. Das zweite Objektiv O2 53 befindet sich im Abstand f₂ von der ersten Lochblende 52 im Strahlengang. Auf diese Art werden die Brennebenen der Biogitter 40 und damit die Mess-Lichtbündel I_Diff auf dem ersten Detektor D1 60 abgebildet.
Zusätzlich zur beabsichtigten Auskopplung von Messlicht I_Diff an den Biogittern 33, 34, 35, kommt es bei der Propagation von Licht in der wellenleitenden Schicht 30 an allen Brechungsindexsprüngen, die ihre Ursache z. B. in Rauheit von Substrat 32 und/oder der wellenleitenden Schicht 30, Verschmutzungen auf der Oberseite der wellenleitenden Schicht 31, Materialinhomogenitäten usw. haben, zu unbeabsichtigter Auskopplung von elastisch gestreutem Licht I_Scat, das ebenfalls in Richtung der Brennebene der Biogitter 40 ausgelenkt wird.
Für das elastisch gestreute Licht I_Scat dient ebenfalls das erste Objektiv O1 50 als Eingangsobjektiv, anschließend fällt das elastisch gestreute Licht I_Scat auf den Strahlteiler 51 und wird in Richtung des dritten Objektivs O3 54 und des zweiten Detektors D2 61 ausgelenkt. Dies stellt den zweiten Strahlengang dar. Nach dem Strahlteiler 51 fällt das elastisch gestreute Licht I_Scat auf das dritte Objektiv O3 54 mit der Brennweite f₃. Im Abstand f₃-f(f₃/f₁)² von der bildseitigen Hauptebene H₃' des dritten Objektivs O3 54 befindet sich der zweite Detektor D2 61. Somit wird die Oberseite der wellenleitenden Schicht 31 auf den zweiten Detektor D2 61 abgebildet.
Die hohe numerische Apertur dieser Abbildung geht mit einer geringen Tiefenschärfe einher, sodass es vorteilhaft ist, das dritte Objektiv O3 54 und/oder den zweiten Detektor D2 61 in x-Richtung, das heißt in Richtung des Strahlenganges, verstellbar auszuführen. Somit kann die abbildende Optik auch bei mechanischen Lagetoleranzen des Biochips und chromatischer Aberration der Objektive exakt auf die Oberseite der wellenleitenden Schicht 31 scharfgestellt werden. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann zur Vergrößerung des Tiefenschärfebereichs die numerische Apertur der Abbildung durch eine geeignete Blende reduziert werden.
Weiterhin kann eine Trennwand 17 zur Abschirmung von Streulicht aus dem Einkoppelvorgang in der Vorrichtung 100 angebracht sein.
2 stellt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar, bei der emittiertes Fluoreszenzlicht I_Fluoro auf dem zweiten Detektor D2 61 abgebildet wird. Der Aufbau der erfindungsgemäßen Vorrichtung 100 ist in weiten Teilen gleich zu dem in der 1 beschriebenen Aufbau. Auf der Oberseite der wellenleitenden Schicht 31 sind Fluorophore angeordnet, die durch das in die wellenleitende Schicht 30 eingekoppelte Licht angeregt werden und Fluoreszenzlicht I_Fluoro emittieren. Das emittierte Fluoreszenzlicht wird ebenfalls in Richtung der Brennebene der Biogitter 40 ausgekoppelt und über das erste Objektiv O1 50 in Richtung Strahlteiler 51 gelenkt. Der Strahlteiler 51 in dieser Ausführungsform ist als wellenlängenabhängiger, also dichroitischer Strahlteiler ausgeführt. Am Strahlteiler wird das ankommende Licht analog des Aufbaus der 1 in einen ersten Strahlengang und einen zweiten Strahlengang zerlegt. Die Mess-Lichtbündel I_Diff und das elastisch gestreute Licht I_Scat folgen analog des Aufbaus in der ersten Figur dem ersten Strahlengang. Das elastische gestreute Licht I_Scat wird an der ersten Lochblende 52 zum großen Teil absorbiert und die Mess-Lichtbündel I_Diff werden auf dem ersten Detektor D1 60 abgebildet. Das emittierte Fluoreszenzlicht I_Fluoro wird am Strahlteiler 51 in den zweiten Strahlengang gelenkt und über das dritte Objektiv O3 54 und einen Emissionsfilter 70 auf dem zweiten Detektor D2 61 abgebildet.
Insbesondere für die Abbildung der vergleichsweise schwachen Fluoreszenzemission ist wiederum die hohe numerische Apertur dieser Abbildung vorteilhaft, welche mit einer hohen Lichtstärke (Collection Efficiency) und einer hohen optischen Auflösung einhergeht, was es ermöglicht, auf der Oberseite der wellenleitenden Schicht 31 angelagerte biologische Zellen direkt betrachten zu können. Hierbei ist es wegen der geringen Tiefenschärfe der Abbildung wiederum vorteilhaft, das dritte Objektiv O3 54 und/oder den zweiten Detektor D2 61 in x-Richtung, d.h. in Richtung des Strahlenganges verstellbar auszuführen, sodass die abbildende Optik auch bei mechanischen Lagetoleranzen des Biochips und chromatischer Aberration der Objektive exakt auf die Fluorophore auf der Oberseite der wellenleitenden Schicht 31 scharfgestellt werden kann.
Ausführungsbeispiel 1
Es wurde ein Biochip bestehend aus D263 Substrat mit einer wellenleitenden Schicht 30 aus Ta₂O₅ verwendet. Auf der Wellenleiteroberfläche waren 140 Biogitter 33, 34, 35 in einem 14x10 Raster mit je 500 µm Mittenabstand (in x- bzw. y-Richtung) angeordnet. Licht einer ersten Wellenlänge λ₁=785 nm wurde über ein Einkoppelgitter 20 mit einer Gitterkonstante A=360 nm in die wellenleitende Schicht 30 eingekoppelt.
Die Biogitter 33, 34, 35 wiesen einen Durchmesser von d=0.4 mm und eine Brennweite von f=12 mm auf und dementsprechend eine numerische Apertur von NA=d/2f=0.0167. Die Biogitter 33, 34, 35 erzeugten entsprechende beugungsbegrenzte Foki in der Brennebene 40.
Als erstes Objektiv O1 50, zweites Objektiv O2 53 und drittes Objektiv O3 54 wurden drei identische mehrlinsige Objektive mit fester Brennweite f₁=f₂=f₃=35 mm verwendet, die im Abstand L=f₁+f₂ bzw. L=f₁+f₃ gegensinnig als Tandemobjektive angeordnet waren. Damit wurde eine 4f-Abbildung mit einer Vergrößerung von M=-1 umgesetzt.
Der Strahlteiler 51 wurde als wellenlängenunabhängiger Strahlteiler mit einem Aufspaltungsverhältnis (Reflektion:Transmission) von 10:90 ausgeführt. Der Großteil des ausgekoppelten Lichts I_Diff und I_Scat wurde am Strahlteiler 51 transmittiert und gelangte zu einer Fourierblende. Die Fourierblende war im Abstand f₁=35 mm hinter der bildseitigen Hauptebene H₁ des ersten Objektivs O1 50 positioniert. Die Blendenöffnung hatte einen Durchmesser von D=2f₁NA=f₁d/f≈1.2 mm, sodass die numerische Apertur der Abbildung der der Biogitter 33, 34, 35 entsprach. Der Großteil des elastisch gestreuten Lichts I_Scat wurde von der Fourierblende blockiert, während das Licht I_Diff transmittiert, und mit Hilfe des zweiten Objektivs O2 53 auf den ersten Detektor D1 60 abgebildet wurde, der als CMOS Kamerasensor mit geringem Dunkelrauschen ausgeführt war.
Der kleinere Teil des Lichts I_Diff, I_Scat wurde am Strahlteiler 51 reflektiert und mit Hilfe des dritten Objektivs O3 54 auf einen zweiten Detektor 61 abgebildet, der ebenfalls als CMOS Kamerasensor mit geringem Dunkelrauschen ausgeführt war. Der Abstand dieses Detektors 61 zur bildseitigen Hauptebene des dritten Objektivs O3 54 betrug b₃=f₃-f(f₃/f₁)²=35 mm-12 mm=24 mm. Dieser Abstand konnte durch Verschieben des dritten Objektivs O3 54 und/oder des zweiten Detektors 61 geringfügig verstellt werden, sodass die Abbildung auch bei mechanischen Lagetoleranzen des Biochips und chromatischer Aberration der Objektive exakt auf die Fluorophore auf der Oberseite der wellenleitenden Schicht 31 scharfgestellt werden konnte.
Ausführungsbeispiel 2
Es wurde ein Biochip bestehend aus D263 Substrat mit einer wellenleitenden Schicht 30 aus Ta₂O₅ verwendet. Auf der Wellenleiteroberfläche waren 140 Biogitter in einem 14x10 Raster mit je 500 µm Mittenabstand (in x- bzw. y-Richtung) angeordnet. Die zu den Biogittern 33, 34, 35 angelagerten Biomoleküle waren zusätzlich mit einem Fluoreszenzfarbstoff gelabelt, der sich bei einer Wellenlänge von λ₂=660 nm anregen lässt und bei einer Wellenlänge λ_Fluoro>660 nm Fluoreszenzlicht emittiert (z. B. Cyanin 5.5). Licht einer ersten Wellenlänge λ₁=785 nm und einer zweiten Wellenlänge λ₂=660 nm wurde über ein Einkoppelgitter 20 mit einer Gitterkonstante A=360 nm in den Wellenleiter eingekoppelt. Die Biogitter hatten einen Durchmesser von d=0.4 mm, eine Brennweite von f=12 mm und dementsprechend eine numerische Apertur von NA=d/2f=0.0167. Die Biogitter 33, 34, 35 erzeugten entsprechende beugungsbegrenzte Foki in der Brennebene 40.
Als erstes Objektiv O1 50, zweites Objektiv O2 53 und drittes Objektiv O3 54 wurden drei identische mehrlinsige Objektive mit fester Brennweite f₁=f₂=f₃=35 mm verwendet, die im Abstand L=f₁+f₂ bzw. L=f₁+f₃ gegensinnig als Tandemobjektive angeordnet waren. Damit wurde eine 4f-Abbildunge mit einer Vergrößerung von M=-1 umgesetzt.
Der Strahlteiler 51 wurde als dichroitischer Langpassfilter ausgeführt, dessen spektrale Kante (in diesem Fall der Cut-on) sich mit 760 nm zwischen den Wellenlängen des Fluoreszenzlichts λ_Fluoro>660 nm und des elastisch gestreuten Lichts λ_Diff=785 nm befand. Dieser dichroitische Strahlteiler trennte die an den Biogittern 33, 34, 35 elastisch gestreuten und die von den Fluorophoren emittierten Lichtanteile spektral, und zwar so, dass die Lichtanteile I_Diff und I_Scat transmittiert wurden und das emittierte Fluoreszenzlicht I_Fluoro reflektiert wurde.
Die am Strahlteiler 51 transmittierten Lichtanteile I_Diff und I_Scat gelangten zu einer Fourierblende, die im Abstand f₁=35 mm hinter der bildseitigen Hauptebene H₁ des Objektivs O1 positioniert war. Die Blendenöffnung hatte einen Durchmesser von D=2f₁NA=f₁d/f≈1.2 mm, sodass die numerische Apertur der Abbildung der der Biogitter 33, 34, 35 entsprach. Der Großteil des elastisch gestreuten Lichts I_Scat wurde von der Fourierblende blockiert, während das Licht I_Diff transmittiert, und mit Hilfe des zweiten Objektivs O2 53 auf den ersten Detektor D1 60 abgebildet wurde, der als CMOS Kamerasensor mit geringem Dunkelrauschen ausgeführt war.
Das emittierte Fluoreszenzlicht I_Fluoro wurde am Strahlteiler 51 reflektiert und mit Hilfe des dritten Objektivs O3 54 auf einen zweiten Detektor 61 abgebildet, der ebenfalls als CMOS Kamerasensor mit geringem Dunkelrauschen ausgeführt war. Der Abstand dieses zweiten Detektors 61 zur bildseitigen Hauptebene des dritten Objektivs O3 betrug b₃=f₃-f(f₃/f₁)²=35 mm-12 mm=24 mm. Dieser Abstand konnte durch Verschieben des Objektivs O3 und/oder des zweiten Detektors 61 geringfügig verstellt werden, sodass auch bei mechanischen Lagetoleranzen des Biochips und chromatischer Aberration der Objektive exakt auf die Fluorophore auf der Oberseite der wellenleitenden Schicht 31 scharfgestellt werden konnte.
In den Strahlengang zwischen dichroitischem Strahlteiler und Detektor D2 61 war ein Bandpassfilter 70 eingebracht, der ein Transmissionsband von z. B. 720 nm ± 30 nm hatte, sodass nur das emittierte Fluoreszenzlicht zum zweiten Detektor D2 61 gelangte, während Anregungslicht der Wellenlänge λ₂=660 nm oder verbliebene Lichtanteile I_Diff, I_Scat mit λ₁=785 nm blockiert wurden. Dieser Bandpassfilter 70 war beweglich ausgeführt, so dass er aus dem Strahlengang gefahren werden konnte, um bei Bedarf auch Licht der in die wellenleitende Schicht 30 eingekoppelten Wellenlängen 660 nm bzw. 785 nm auf den zweiten Detektor D2 61 gelangen zu lassen. Dies konnte genutzt werden, um die Oberfläche des Wellenleiters bei den entsprechenden Wellenlängen wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben abzubilden.
Bezugszeichenliste

10: Lichtquelle
15: Linse
16: Strahlfänger für den transmittierten Lichtanteil
17: Trennwand für Streulicht
20: Einkoppelgitter
30: wellenleitende Schicht
31: Oberseite der wellenleitenden Schicht
32: Substrat
33, 34, 35: Biogitter
40: Brennebene der Biogitter
50: erstes Objektiv O1
51: Strahlteiler
52: erste Lochblende
53: zweites Objektiv O2
54: drittes Objektiv O3
60: erster Detektor
61: zweiter Detektor
70: Emissionsfilter
80: Deckschicht
100: Vorrichtung

Literatur

[1] V. Gatterdam et al., Nature Nanotechnology 12, 1089 (2017), AM Reichmuth et al., Anal. Chem. 92, 13, 8983 (2020)
[2] Frutiger et al., Phys. Rev. Applied 11, 014056 (2019)
[3] F. Zernike, Fabrication and Measurements of Passive Components. In: T. Tamir (eds.) Integrated Optics. Topics in Applied Physics, vol 7. Springer, Berlin, Heidelberg (1975)

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 2013/107811 A1 [0005]
WO 2014/086789 A1 [0005]
WO 2014/111521 A1 [0005]
WO 2015004264 A1 [0005]
EP 1327135 B1 [0006]

Claims

Vorrichtung (100) aufweisend mindestens eine Lichtquelle (10), ein Einkoppelgitter (20) und einen Biochip, wobei der Biochip mindestens ein Biogitter (33, 34, 35) mit einer Brennweite f und eine wellenleitende Schicht (30) mit einer Oberseite (31) und einer Unterseite aufweist, wobei auf der Unterseite der wellenleitenden Schicht ein Substrat (32) angeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung (100) weiterhin ein erstes Objektiv (50) mit einer Brennweite f₁, ein zweites Objektiv (53) mit einer Brennweite f₂, ein drittes Objektiv (54) mit einer Brennweite f₃, einen Strahlteiler (51) mit einer Halterung, eine erste Lochblende (52) und einen ersten und einen zweiten Detektor (60, 61) aufweist; und die Vorrichtung (100) dazu eingerichtet ist, die Brennebene (40) des mindestens einen Biogitters auf den ersten Detektor (60) abzubilden und simultan die Oberfläche der Oberseite der wellenleitenden Schicht (31) auf den zweiten Detektor (61) abzubilden.
Vorrichtung (100) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die objektseitige Hauptebene des ersten Objektivs (50) im Abstand f₁ von der Brennebene (40) des mindestens einen Biogitters (33, 34, 35) angeordnet ist.
Vorrichtung (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Lochblende (52) im Abstand f₁ von der bildseitigen Hauptebene des ersten Objektivs (50) und im Abstand f₂ von der objektseitigen Hauptebene des zweiten Objektivs (53) angeordnet ist.
Vorrichtung (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Strahlteiler (51) im optischen Weg nach dem ersten Objektiv (50) und vor der ersten Lochblende (52) angeordnet ist und jedes weitere Objektiv nach dem Strahlteiler (51) angeordnet ist.
Vorrichtung (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Strahlteiler (51) ein dichroitischer Strahlteiler oder ein wellenlängenunabhängiger Strahlteiler ist.
Vorrichtung (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Halterung des Strahlteilers (51) beweglich ist.
Vorrichtung (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Detektor (60, 61) und/oder das dritte Objektiv (54) entlang des Strahlenganges ortsveränderlich sind.
Vorrichtung (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Detektor (61) im Abstand f₃-f(f₃/f₁)² von der bildseitigen Hauptebene des dritten Objektivs (54) angeordnet ist.
Vorrichtung (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor oder innerhalb des dritten Objektivs (54) eine zweite Lochblende im Strahlengang angeordnet ist.
Vorrichtung (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem zweiten Detektor (61) mindestens ein Filter im Strahlengang angeordnet ist.
Vorrichtung (100) gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Filter vor dem zweiten Detektor (61) senkrecht zum Strahlengang ortsveränderlich ist.
Vorrichtung (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Oberfläche der Oberseite der wellenleitenden Schicht (31) Fluorophore angeordnet sind.
Vorrichtung (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung (100) weiterhin mindestens eine Trennwand (17) zur Abschirmung von Streulicht beim Einkoppeln des Lichts in die wellenleitende Schicht (30) aufweist.
Vorrichtung (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das die Vorrichtung (100) weiterhin ein Strahlfänger (16) für den beim Einkoppeln transmittierten Lichtanteil aufweist.
Verfahren zur simultanen Abbildung der Brennebene (40) des mindestens einen Biogitters (33, 34, 35) und der Oberseite der wellenleitenden Schicht (31) mit Hilfe einer Vorrichtung (100) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Einkoppeln von Licht aus mindestens einer Lichtquelle (10) in die wellenleitende Schicht (30); Auskoppeln eines Teils des Lichts als erstes Mess-Lichtbündel I_Diff durch das mindestens eine Biogitter (33, 34, 35); Optional auskoppeln je eines weiteren Mess-Lichtbündels durch jedes weitere Biogitter (33, 34, 35); Auskopplung von elastisch gestreutem Licht I_Scat und/oder emittierten Fluoreszenzlicht I_Fluoro; Auffangen des ausgekoppelten Lichts in einem ersten Objektiv (50); Aufspalten des ausgekoppelten Lichts in einen ersten und einen zweiten optischen Strahlengang; Abbilden des ersten optischen Strahlenganges mit der ersten Lochblende (52) und dem zweiten Objektiv (53) auf den ersten Detektor (60); Abbilden des zweiten optischen Strahlenganges mit dem dritten Objektiv (54) und optional mindestens ein weiteres optisches Element auf den zweiten Detektor (61); wobei auf dem ersten Detektor (60) die Brennebene (40) des mindestens einen Biogitters (33, 34, 35) und jedes weiteren Biogitters (33, 34, 35) abgebildet wird und auf dem zweiten Detektor (61) die Oberfläche der Oberseite der wellenleitenden Schicht (31); und wobei die Abbildung des ersten optischen Strahlenganges auf den ersten Detektor (60) und des zweiten optischen Strahlenganges auf den zweiten Detektor (61) simultan erfolgt.