CN1195585C - 采用试剂处理生物样品的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了在显微镜载片(70)上处理生物样品(220)的方法。本发明的一个方面是在其上设置有载片的板(4)的孔(24)中预干试剂，特别是使用可顺序溶解的预干试剂。本发明的另一个方面是与被检测的生物样品一起使用直接置于显微镜载片(70)上的外部对照。外部对照可方便地置于可固定于载片之上的膜(230)上。本发明的另一个方面是特别设计的板(400)，其允许在一块载片上可以对一个细胞样品的所有染色体进行染色。本发明也提出了一种具有凹孔(530)的盖片(500)，当置于载片(510)之上时凹孔作为反应室并由缓冲液充满。优选地，试剂被预干于孔(530)中。本发明的再一个方面是将带有样品的载片(600)和预干试剂的盖片(630)一起放入反应室进行反应方法。

Description

采用试剂处理生物样品的方法
发明背景
本发明涉及一种用于多种目的的、在载片上制备生物样品的装置。利用多种不同生物试验对生物样品进行分析，以满足多种目的。病理学家常利用组织化学和免疫细胞化学去分析生物样品，分子生物学家可能会对生物样品进行原位杂交或原位聚合酶链反应，等等。被分析的样品常植于石蜡中并固定于显微镜载片之上。
试验一般涉及抗体、酶以及其它昂贵试剂的使用，理想的情况是将试剂用量降至最低以降低成本。尽管现已存在一些自动化仪器(如，Ventana ESIHC染色仪，Shandon Lipshaw Cadenza自动免疫染色仪；也可参见Brigati等人(1988)的文章)，但这些试验仍是十分花费劳力的。此处用于指明发明背景或提供其它有关实践细节的出版物和其它材料被引入作为参考，并为方便起见将它们分组列于参考文献附表中。大多数自动化仪器一次运行仅能处理40至48个载片。Fisher的自动化仪器一次运行可处理120个载片。大多数仅用于进行免疫细胞化学的自动化仪器不能进行脱蜡、组织化学(如苏木精和曙红染色)以及加载盖片步骤，因此这些步骤必须采用费时和费工的手工操作。自动化仪器仅执行了制备和分析载片全部工作的一小部分。在自动化操作之前仍然采用手工操作的步骤包括盒和载片的分类，标记载片，自动化仪器程序设置，日常抗体和试剂的准备，准备置于载片之上的对照组织，以及微波抗原回收。在自动化操作之后仍采用手工操作的步骤包括脱水，加载盖片，载片标记以及载片和盒的分类。另外，大多数即用型试剂并不适于要求使用特制试剂的自动化仪。处理大量样品的实验室多愿意支出高的花费以用于购买自动化仪器以及使用试验用的一次性附件和试剂，但小型至中型的实验室则认为采用手工处理样品仍然更为经济。
典型的免疫细胞化学试验需要一系列的多个步骤。它们包括：例如从活组织中获取生物样品，在福尔马林中固定样品，处理样品过夜，将样品植于石蜡中，对不同部位切片，然后固定于载片之上并干燥。此后再进行脱蜡(在二甲苯、乙醇和水中处理)，最后即可在置于载片的样品上进行反应。典型地，在载片上要滴加一系列溶液，包括酶、原抗体、第二抗体、检测试剂、生色剂、复染剂等，温育，然后洗去。最终将样品置于显微镜下观察。显而易见，这存在着多个独立的步骤并且置于载片之上的各样品必须分别进行处理。除了非常花费人力外，将溶液滴在显微镜载片上的样品之上的常规作法存在着缺陷。溶液并不仅局限于生物样品自身区域。同样溶液的厚度相对较大，而非一个薄层。这些特点要求使用过多的昂贵试剂。如果样品必需长时间温育，位于载片上的溶液暴露于空气中可导致挥发。挥发使得试剂浓缩或变干，而高浓度可能导致背景水平的增高，这显然是不利的。如果溶液完全蒸干则试验失败。在带盖的潮湿的室中温育样品可以防止蒸发的问题，但冷凝在潮湿室盖上的水滴可能会落在载片上，这种情况可能导致试验失败。
改进的方法对于小型或中型实验室来说是受欢迎的，其中可以更快速地对几个样品进行试验，同时又不需要高花费的自动化仪器。另外，允许使用更少量试剂并克服在接触大气的载片上处理样品的缺陷的方法也将是一种受人欢迎的技术进步。
发明简述
本发明涉及一种用于对置于显微镜载片之上的生物样品进行试验的装置和方法。利用这些装置和/或方法有助于更快和更方便地进行试验。本发明的一个方面是使用预干于板孔中的试剂，在试验时仅加入水或缓冲液而非加入试剂即可利用试剂。然后将预先带有生物样品的载片置于板孔之上。多孔板的不同孔中可以预干不同的试剂。可以移动载片架从一个多孔板移向另一个进行多步操作，在多孔板的各孔中具有预干的所需试剂。该方法的一个实施方案是在各孔中构成多层试剂，第一层试剂快速溶解并与生物样品作用，然后第二层溶解，释放出用于第二步骤的试剂，因而试验可采用较少的板，甚至有可能仅采用一块板。
本发明的另一个方面是对各载片加装对照。这是载片的一部分，其上附有阳性、阴性对照。这些对照使得工作人员可以确定各载片上的试验是否正常，因为各载片均有自身的对照，这些对照同时也作为各载片的标记。
本发明还涉及具有保持试剂凹孔的盖片。该盖片可置于载片之上使得可保持用于试验的试剂，但又易于移除使得可进行载片清洗。盖片中可包含用于试验的、在其内干燥的对照。
本发明的再一个方面是利用盖片在反应室中自动处理生物样品，该盖片中存在预干的试剂同时也可以预先设置对照。
附图简述
图1显示带有载片70的载片架1。载片架1包括一个带孔11的把手5。载片架1中的开孔7使得可以观察到载片70上的标记。标记也可直接标记在载片架1的区域15上。载片70被插至载片架1的插槽56中。
图2A-B显示板14和载片70。图2A是板14的正视图。孔24间由槽38分隔。孔24的边缘44是平的并且高于孔24的内部。槽90与槽38相连。图2B为板24沿图2A中线54-54的截面图。该图显示孔24，槽38以及孔边缘44。图中载片70置于一孔24之上。
图3显示一个具有生物样品220和标签230的载片。图中显示标记含有试剂A-F。
图4显示孔24，其中已有三种试剂干燥于其内(标记为250、260和270)，孔24上已放置了具有生物样品220的载片70。隔离各层试剂的惰性材料层在图中未作显示。
图5A-B显示多孔板330中的一个孔，其中多孔板330与热循环器、泵和中央处理器一起被用作自动执行试验生物样品操作中的几个步骤。图5A显示具有生物样品220的载片70被置于孔或反应室280之上。图中显示出连接反应器280的进口300和302以及出口294和296。构成反应室280底部的板330的部分在图中标为282。图中显示的任选的档块281用于防止反应室底部282挤压样品220。图5A显示反应室底部282处于“开放”模式，这使得反应室280具有一个大的体积。图5B显示图5A中的板和载片与其它任选装置联用的情况。在图5B中反应室底部282处于“关闭”状态，与图5A相比此状态下反应室280包围的体积更小。图中显示活塞284使反应室底部282移动。活塞284由中央处理单元286控制。图中显示热循环器288被压靠在载片70上。热循环器也可由中央处理单元286控制。管线可与进口300和302以及出口294和296相连。图中显示了与管线相连的泵290，泵290将流体输送进入或离开贮槽291或292或进入凝胶298。
图6A-E显示一个板，其可用于在单一载片上用多种染料对细胞多种染色体进行全染色体染色，或者也可用于对生物样品进行原位杂交或FISH。图6A显示一个具有孔410的8孔板400。各孔与相邻孔间用槽420分隔。各孔410具有一个可以滴加液体的开口或开槽430。图6B为图6A所示8孔板400的侧视图。图中显示载片70被置于板400上。图示的4个孔410有3个为空的而剩余一个充满了液体。开口430和槽420也在图中显示。图6C是图6A和6B板和载片的端视图。图中所示槽420处于二孔410之间。进入孔410的开口430在图中也有显示。如图所示载片70置于板400之上，其中显示在板400上支持载片70的任选的夹子402。图6D是载片70的示意图，显示分别与8个孔410接触的8个载片区域440。这仅起描述作用，实际应用中不必在载片上真正标志这些区域440。图6E通过放大区域440用于描绘在载片70上构建对照的一种方式。各区域440中具有核酸442，它与用于试验的探针杂交，在区域440的周围排列放置。这些对照在杂交期间将与探针接触。
图7A-H显示与带凹孔的盖片联用在载片上处理生物样品的方法。
图8A-D显示与盖片联用在显微镜载片上处理生物样品的方法。
发明详述
本发明是一种在显微镜载片上处理生物样品的一体化系统，与常规系统相比它更为有效并且更为经济。有关本发明公开的背景的大部分内容在第5,958,341号美国专利(W.-S.Chu；公布于1999年9月28日)中有描述，此处引用作为参考。如果在图中未作显示，本发明公开中所使用的部件代码与第5,958,341号美国专利(W.-S.Chu)中的相同。
生物样品指组织切片、活组织、细胞涂片、核酸、蛋白质或肽、染色体、体液或其它常在显微镜下观察的生物材料。图1和2A-B所示的系统包含载片架和板或盖片(参见图7A-H和8A-D)，该体系可同时夹持多片，优选为高达6片的显微镜载片，使得可同时处理多个载片。载片架可以是反复使用的。
在实际工作中，生物样品被置于各载片之上进行分析。常包括的步骤有在富尔马林中固定生物样品，将样品植入石蜡中，从石蜡或冷冻组织上切下系列薄片并固定于显微镜载片之上。在室温下干燥过夜。对生物样品进行一些类型的试验如染色。为此将生物样品与一系列溶液接触，而且在各改变一次试剂之间需添加清洗步骤。在本发明中试剂被定量加入或预干于板14的各孔24中。加入足够的试剂或缓冲液以完全充满孔24，使得孔24中的溶液与置于孔24顶部的显微镜载片70接触。在孔24中的溶液和显微镜载片70之间不应存在气泡。精确地充满孔24或略微过量充填孔24，使得当载片70置于孔24上时出现轻微的溢流(在载片放置之前由孔24中液体的表面张力支持溶液顶部)，这样就不会导致气泡的生成。接触载片70的孔24中的液体的毛细作用使得在孔24整个区域内生物样品和试剂之间接触良好并有助于孔24的密封。板14被设计成在孔边缘44的一侧具有钩子。这显示在第5,958,341号美国专利(W.-S，Chu)的图4C和4F中。将所有载片向钩子方向压下，所有载片将被孔边缘44所夹持，这样就确保了与孔24中的试剂产生良好的接触。
按以上方式将载片70置于板14之上，其上的生物样品向下面向孔24并且不暴露于大气中。这防止了温育期间外源性材料落入试剂中或生物样品之上。另外，载片70覆盖孔24，并有助于防止孔24中的试剂溶液在温育期间蒸发。蒸发有可能导致非常差的背景信号。本发明有助于克服这一问题。
利用各试剂温育后，将载片架1和板14拾起并放入含有500ml磷酸缓冲盐(PBS)溶液的标准染色盘中。一旦进入PBS溶液，载片70和板14之间的表面张力消失，载片非常容易从板上脱除。此后将载片置于适当的清洗步骤中。同时拾起6块载片70是容易的，因为载片均附着于一块载片架1之上。实验室标准染色盘足以垂直容纳6片载片70(载片均附着于一块载片架1之上)并且可容纳20块载片架1。因此120片载片70可以同时被清洗和处理。
上述方法是一种改进，因为这些方法组成了一个封闭的试验体系，这样有助于防止污染。同时封闭体系防止了蒸发，从而恒定体积试剂得以保持，使得试剂用量已知并且浓度恒定。与常规方法，例如，仅将试剂简单地滴在载片上的组织样品之上，试验体系暴露于大气之中导致污染和蒸发的方法相比，这些特点产生更好和更均一的试验结果。
本发明的另一特点是将试剂预干于板14的孔24中，使得在试验时仅需简单地将板14和载片70浸入水或缓冲液中或将水或缓冲液滴至孔24中。板14可以制成一系列试剂预干于多孔板的孔24中的形式，例如多孔板14的各孔24中可以含有不同的预干试剂。在试验时，载片70可以含有置于其上的来自一个患者或不同患者的生物样品，并将载片70置于同一板40之上以同时进行多个试验。含有预干试剂的板14可以预先制备并储存至试验开始。如目前的实际操作一样，将样品固定于载片之上，然后在样品上滴加试剂，由此对生物样品进行试验。这种方法不具有仅需添加水或缓冲液的、预先计量并且预干的试剂的优点。在此所公开的专利中，试剂可以被预干于板14的孔24中，将水或缓冲液加入孔24中，然后将其上装有生物样品的载片70置于孔24的顶部，样品面向下。水或缓冲液可以在载片70置于孔24的顶部之后通过管线加至孔24中。利用载片70和孔24构成一个封闭的反应室以防止污染和蒸发并保证试剂均匀分布的作法比目前普遍采用的将溶液滴加于载片顶部的作法优越。
本发明的另一个方面是在各载片上预置了对照和/或标签。已知的对照被固定在各载片非生物样品的区域中。例如，对照可以是在生物样品中要检测的抗原、肽、蛋白或细胞，如果进行杂交试验，对照可以是已知序列的核酸。它们可以作为一种阳性对照，如果试验进行正确时可以给出一个信息或颜色。阴性对照也可以置于载片之上，如不与孔内试剂反应的蛋白、抗原或核酸。例如，假设要检测某人体内是否存在六种抗原确定簇A-F。可以采用一个六孔板，其中各孔中分别含有不同的抗体A’-F’。这六种抗原确定簇可以点在全部的六块载片上。对于所有载片来说，各载片上仅有一个对照显示阳性。载片A应显示仅有抗原确定簇A为阳性信号，载片B应显示仅有抗原确定簇B为阳性信号，以下各载片以此类推。此时这些对照作为外部对照。如果多于一个对照显示阳性，表明发生抗体交叉反应。如果没有对照显示阳性则表明反应没有发生，例如试剂有可能丧失。此时被检测的生物样品作为内部对照。
外部对照可以按多种方式置于各载片之上。优选的方式是将试剂点于等价于邮票或胶贴纸的物件之上，它采用防二甲苯和乙醇的粘合剂并且能够粘附于各载片之上。这样的邮票或胶贴纸可以采用任何适当的并牢固粘附蛋白、肽、细胞或核酸的材料。此处不作界定，材料可以包括通常用于膜制作的硝基纤维素、塑料、玻璃或尼龙。这些膜材料的具体实例是硝基纤维素本身，Immobilon-P(Millipore)，Hybond-N，Hybond-N-，和Hybond C-extra硝基纤维素(Amersham)，Genescreen和Genescreen Plus(Du Pont)，Clearbliot-P(ATTO Co)以及聚二氟乙烯膜(Millipore或BioRad)。如图3所示这些邮票或胶贴纸具有区域A-F。这些邮票或胶贴纸可预先制备并储存至使用，抗原确定簇、蛋白、肽、细胞或核酸被干于邮票或胶贴纸之上。抗原、蛋白、细胞等的名称被印刷于邮票或胶贴纸之上。这种方式特别适于大量生产。标准的系列试验可以预制成板，如检测乳腺癌的板以及检测何杰金病的板，但人们也可以按照自身的设想设计任何的试剂组合作为外部对照。对照标签可以在生物样品装于载片之前粘附于载片之上，或者也可以延迟放置，直至生物样品已经被固定于载片之上并且已经被处理至相关对照反应即将进行为止。
标签可以采用颜色或数字进行编码用以指示所要进行的某一组特定的试验。按照类似的方式板14也可以采用颜色或数字进行编码或按其他方式标记用以指示所要进行的某一组特定的试验，它与板14的孔24中的预干试剂相独立。标签和板应与颜色、数字或其他标记匹配。
本发明的另一个方面是在孔24中干燥的试剂可以按其发生作用相反的顺序干燥成层状。当缓冲液加入后，最后加入的试剂将首先溶解并发挥作用，然后按顺序倒数第二加入的试剂将发挥作用，此后依此类推。按此方式二种或更多种试剂可以添加在同一孔24中并顺序发挥作用而不必将载片从一个板14移向另一板14。对于多步反应，这将降低所需板14的数量，同时也降低了所需的劳动量。
本发明的另一个方面是一种特殊设计的板或夹，使得操作人员可以在同一块载片上对所有24条人类染色体进行染色。
本发明的再一个方面是一种板和载片的组件，其中可以调整板孔的体积，使得在小的体积下进行反应，例如PCR，然后可以将体积调大使得液体由泵输送通过板孔。
本领域的技术人员应认识到在载片上被检测的样品，包括蛋白、肽、DNA、RNA或细胞，或者标签上的对照蛋白、肽、DNA、RNA或细胞，必须被固定化，以防在试验期间脱落。一旦水或缓冲液加入后，可能已经预干于板中的试剂，包括蛋白、肽、核酸等，应该释放出来，如果试剂采取多层形式则按程序释放。
                         实施例
在各实施例中生物样品首先被安装于显微镜载片70之上，然后被检测。通过手术和尸体解剖从多种器官(淋巴结、肝、肾、肺、乳腺、皮肤、前列腺)中获得的人类生物样品按常规在10％中性缓冲的福尔马林中固定，在组织处理器中处理过夜并植于石蜡中。将各部位切成4-5μm的片并置于Probe-On-Plus载片(#15-188-52：Fisher Scientific)上，在室温下干燥过夜。然后将载片70插入可反复使用的载片架1中。此时处于同一载片架1中的所有载片(高达6片)可以同时被处理。以5分钟为间隔更换4次二甲苯，100％乙醇处理两次，95％乙醇处理两次，每次各1分钟，由此将载片70置于染色盘中进行脱蜡。用去离子水清洗脱蜡的组织载片。
在以下实施例中更详细地描述本发明，实施例仅起描述作用而绝不是用于对本发明进行界定。实施例中采用了本领域已为人所熟知的标准技术和以下具体描述的技术。
                        实施例1
                      免疫细胞化学
在本实施例中生物样品用抗体(第一和第二)处理，进行处理以进行色原体显色，并最终进行复染。
A、固定组织样品的蛋白水解预处理
在本领域中众所周知，当采用某些抗体进行免疫细胞化学染色时需要采用蛋白水解酶，例如0.4％胃蛋白酶，pH2.0，对经过福尔马林固定的组织切片进行预处理。当需要此操作时可以采用以下的步骤。将几滴(150-200μL)蛋白水解消化液置于3或6孔板14的各孔24中。将载片70的组织面向下置于孔24之上。带有载片70的载片架1应缓慢放下并置于板14的孔24上。在载片70的组织面和板14中孔24的溶液之间不应存在气泡。将载片70，载片架1和带有溶液的板14在40℃下温育15分钟。
如果有多个样品需同时处理，在蛋白水解预处理过程中不采用板14则更为有效。载片70仍置于载片架1之中，一个载片架1中放6片载片70。然后将载片架1和载片70垂直放入含500ml蛋白水解消化液(溶液可反复使用)的染色盘中，然后在水浴中于40℃下温育20分钟。在该预处理步骤中可以将高达20块的载片架1(120片载片)同时置于染色盘中。
某些抗体要求组织切片通过微波抗体回收进行预处理。将带有载片70的载片架1(高达20块)垂直置于含500ml 0.01M柠檬酸盐缓冲液的染色盘中，将染色盘置于微波炉的中心，然后在高功率(800-850瓦)下开动微波炉7-8分钟使得溶液快速沸腾。将微波炉关闭并将功率设为400瓦，然后开动微波炉继续加热溶液7-8分钟。
经蛋白水解消化和微波处理后，在染色盘中采用500ml磷酸盐缓冲液(PBS)清洗组织切片3次。
B、采用山羊和马血清处理组织切片
所有载片70，不论是否经过蛋白水解消化和微波处理，于室温下在5％的常规山羊和马混合血清中温育20-30分钟。在板14的各孔24中充填常规山羊和马混合血清(约150-200μL)。将载片70的组织面向下置于孔24之上与血清接触。带有载片70的载片架1应缓慢放下，避免在载片70和孔24之间夹带气泡。同样地，如果有多个样品需同时处理，将20块的载片架1成批垂直地放入含500ml 5％常规山羊和马混合血清的染色盘中进行处理则更为有效。
C、第一抗血清或抗体的使用
与血清温育后，将载片架1、载片70以及盘14放入含PBS的染色盘中。板14与载片架1分离并且二者均用PBS清洗一次。经清洗的板14可以在下一步骤中重复使用。将预先稀释的第一抗血清或抗体(约150-200μL)置于板14的各孔24中。然后将仍处于载片架1之中并经清洗的载片70的组织面放在孔24之上。必须小心操作以避免在载片70和孔24之间夹带气泡。样品可以与原抗血清或抗体在室温下温育2-4小时，或于40℃下在潮湿的室中温育2小时，或者也可以于室温下在潮湿的室中温育过夜。温育后的载片架1以及其上的载片70从板14上脱除并在染色盘中用PBS清洗三次。
D、第二抗体的使用
将预先稀释的第二抗体(约150-200μL)置于板14的各孔24中。然后将处于载片架1之中的载片70组织面朝下地放在孔24之上，小心操作以避免气泡。于40℃下在潮湿的室中温育30分钟。温育后，载片架1以及其上的载片70从板14上脱除并在染色盘中用PBS清洗三次。
E、去除内源性过氧化酶活性的操作
将所有带有载片70的载片架1置于含有500ml PBS溶液的染色盘中，其中PBS溶液含有3％过氧化氢和0.1％叠氮化钠，并于室温下温育15分钟。经过氧化氢PBS溶液温育后，将载片架1以及其上的载片70在染色盘中用PBS清洗三次。
F、ABC复合物“ELITE”的使用
采用PBS将ABC复合物(Vector Laboratories Inc.，Burlingame，CA)稀释至工作浓度。将工作浓度的溶液(约150-200μL)置于一个新板14的各孔24中。然后将处于载片架1之中的载片70组织面朝下地小心放在板14之上，避免在溶液和载片70之间夹带气泡。于40℃下在潮湿的室中将含有ABC溶液的载片70和板14温育30分钟。温育后，载片架1以及其上的载片70从板14上脱除并在染色盘中用PBS清洗三次。
G、采用二氨基联苯胺(DAB)进行色原体显色
向100ml PBS中添加100mg DAB并添加50μL 30％H2O2，由此制备DAB溶液。将约150-200μL的DAB溶液置于一个新板14的各孔24中至完全充满各孔24。然后将处于载片架1之中的载片70组织面朝下地小心放在孔24之上以避免夹带气泡。可以在显微镜下观察含有DAB溶液的载片架1和板14检测显色。在阳性细胞的部位将出现有色的沉淀。颜色在2-5分钟后出现，一般在10分钟内可以充分显色，但对于微弱染色的样品可能需要20-30分钟的温育。显色停止后，所有载片架1以及其上的载片70从板14上脱除并在染色盘中用去离子水清洗三次。
H、复染
将载片架1和其上的载片70浸入Harris′s苏木精中10-50秒，然后浸入去离子水中3次进行洗涤。此后将所有载片70浸入0.2％氨水中30秒并浸入去离子水中3次进行洗涤。将载片70浸入95％乙醇中两次，每次2分钟，然后浸入100％乙醇中两次，每次2分钟，最后载片70浸入二甲苯中两次进行清洗，每次2分钟。
I、安装盖片
当载片70仍处于载片架1之上时向各载片70的组织切片面滴加1滴Cytoseal 60或预装于该组织面之上。将盖片置于各载片70之上。虽然此步操作可以逐一进行，但更为有效的方式是采用一种特殊设计的盖片，它其实是6个(或3个)具有适当间隔以对齐6个(或3个)载片70的互联的盖片。利用这种特殊的盖片，高达6个盖片可以同时有效对齐并置于载片70之上。简单地弯折盖片，由此可以容易地将各盖片与将它们连接在一起的塑料条分离，其中通过预先设计使得塑料条与盖片分离的同时盖片仍然保持在载片70之上。此时可以手工将载片70从载片架1中分别取下，或者为了转移方便，载片70可以仍然保留在载片架1之上。
第5,958,341号美国专利(W.-S.Chu)中的图10-12显示了一项研究的结果，在该项研究中对于采用本发明染色方法的作法以及简单地采用标准手工方法的作法进行了对比，其中在标准手工方法中将试剂滴加至安装于载片之上的组织样品的表面，并且在温育过程中任由试剂暴露于大气之中。图中显示两种方法所得结果非常有对比性，其中采用本发明所得的结果与采用传统方法所得的结果至少同样好，或者明显更好。但是，本发明利用较少的工作和较少量的试剂就取得了这些结果。
对比这两种方法，利用本发明的方法明显降低了背景染色，特别是使用多克隆抗体时(抗κ轻链抗体和抗λ轻链抗体)情况更是如此。通过背景的降低，本发明明显地改善了染色结果。背景部分是由于因重力沉淀并非选择性与组织结合的游离FC切片所致。本发明使载片倒置，使得组织位于溶液之上，因此游离FC切片不能通过重力沉淀至组织之上。
                         实施例2
                         原位杂交
在本实施例中，生物样品被安置于载片70之上，与生物素或洋地黄毒苷标记的探针杂交并与抗生物素或抗洋地黄毒苷抗体反应。然后将样品染色。
A、制备和安置组织样品
按上述方法制备组织样品，但采用附加手段防止核酸降解。将组织样品在10％中性缓冲的福尔马林中固定，在组织处理器中处理过夜，植于石蜡中。切成4-5μm的系列组织切片，安置于Probe-On-Plus载片(#15-188-52：Fisher Scientific)上并在室温下干燥过夜。然后将载片70插入载片架1中并置于染色盘中脱蜡。以5分钟为间隔更换4次二甲苯，100％乙醇处理两次，95％乙醇处理两次，每次各1分钟，由此对载片进行处理。采用含有RNase阻断剂(Biogenex，San Ramon，CA)的去离子水清洗脱蜡的组织载片。
B、蛋白酶K处理固定的组织样品
将约150-200μL新稀释的蛋白酶K溶液置于板14的各孔24中以充满各孔24。将显微镜载片70(仍处于载片架1中)组织面向下地置于孔24之上。将载片70缓慢置于孔24上以避免在载片70和孔24中的溶液之间存在气泡。在室温下温育15分钟。
消化后将带有载片70的载片架1从板14上脱除并在一个染色盘中利用含有RNase阻断剂的PBS清洗5分钟。在一个染色盘中顺序浸入以下溶液进行脱水：500ml蒸馏水加RNase阻断剂10秒，500ml 50％乙醇加RNase阻断剂10秒，500ml 95％乙醇10秒，以及500ml 100％乙醇10秒。载片70在室温下干燥5分钟。
C、与生物素或洋地黄毒苷标记的探针杂交
此处可采用含有浅孔(0.02-0.08mm深)的板保持材料。将含有生物素化或洋地黄毒苷标记的寡肽探针的溶液置于板14的各孔24中。向各孔24中添加足够的溶液以完全充满孔24。这需要约50-100μL溶液。将载片70小心置于孔24之上(此时仍然处于载片架1之中的3或6片载片)避免夹带气泡。加装载片架1和载片70的板14被置于一炉中或一个加热块上于95℃下加热8-10分钟使核酸变性。该步骤消除了mRNA序列的发夹环或重新折叠。变性步骤后，将载片70置于潮湿的室中于45℃下温育过夜。杂交步骤后，装有载片70的载片架1与板14的脱除，并在染色盘中于37℃下用2X SSC(标准柠檬酸盐溶液)清洗载片5分钟，然后于37℃下用1XSSC清洗5分钟，由此清洗载片70。此后于60℃下用0.2XSSC清洗30分钟。最后用PBS清洗载片70两次，每次2-5分钟。
D、信号检测
室温下将带有载片70的载片架1垂直放入含500ml 5％常规山羊和马混合血清的染色盘中20分钟。将预先稀释的鼠抗生物素或鼠抗洋地黄毒苷抗体(约150-200μL)置于一个新板14的孔24中。将载片70小心放在板14的孔24之上以避免夹带气泡。将含有抗体的载片70和板14置于潮湿的室中于40℃下温育2小时。
与抗生物素或抗洋地黄毒苷抗体温育后，将带有载片70的载片架1从板14上脱除并在染色盘中用PBS清洗3次。
E、第二抗体的使用
将预先稀释的第二抗体(约150-200μL)置于一个新板14的各孔24中。然后将处于载片架1之中的载片70组织面向下地小心放在孔24之上以避免气泡。于40℃下在潮湿的室中温育30分钟。温育后，载片架1以及其上的载片70从板14上脱除并在染色盘中用PBS清洗三次。
F、去除内源性过氧化酶活性的操作
将所有带有载片70的载片架1置于含有500ml PBS溶液的染色盘中，其中PBS溶液含有3％过氧化氢和0.1％叠氮化钠，并于室温下温育15分钟。经过氧化氢PBS溶液温育后，将载片架1以及其上的载片70在染色盘中用PBS清洗三次。
G、ABC复合物“ELITE”的使用
采用PBS将ABC复合物稀释至工作浓度。将工作浓度的溶液(约150-200μL)置于一个新板14的各孔24中。然后将处于载片架1之中的载片70组织面朝下地小心放在板14之上，避免在溶液和载片70之间夹带气泡。于40℃下在潮湿的室中将含有ABC溶液的载片70和板14温育30分钟。温育后，载片架1以及其上的载片70从板14上脱除并在染色盘中用PBS清洗三次。
H、采用二氨基联苯胺(DAB)进行色原体显色
向100ml PBS中添加100mg DAB并添加50μL 30％H2O2，由此制备DAB溶液。将约150-200μL的DAB溶液置于一个新板14的各孔24中至完全充满各孔24。然后将处于载片架1之中的载片70组织面朝下地小心放在孔24之上以避免夹带气泡。可以在显微镜下观察含有DAB溶液的载片架1和板14检测显色。在阳性细胞的部位将出现有色的沉淀。颜色在2-5分钟后出现，一般在10分钟内可以充分显色，但对于微弱染色的样品可能需要20-30分钟的温育。显色停止后，所有载片架1以及其上的载片70从板14上脱除并在染色盘中用去离子水清洗三次。
I、复染
将载片架1和其上的载片70浸入Harris′s苏木精中10-50秒，然后浸入去离子水中3次进行洗涤。此后将所有载片70浸入0.2％氨水中30秒并浸入去离子水中3次进行洗涤。将载片70浸入95％乙醇中两次，每次2分钟，然后浸入100％乙醇中两次，每次2分钟，最后载片70浸入二甲苯中两次进行清洗，每次2分钟。
J、安装盖片
当载片70仍处于载片架1之上时向各载片70的组织切片面滴加1滴Cytoseal 60或预装于该组织面之上。将盖片置于各载片70之上。虽然此步操作可以逐一进行，但更为有效的方式是采用一种特殊设计的盖片，它其实是6个(或3个)具有适当间隔以对齐6个(或3个)载片70的互联的盖片。利用这种特殊的盖片，高达6个盖片可以同时有效对齐并置于载片70之上。简单地弯折盖片，由此可以容易地将各盖片与将它们连接在一起的塑料条分离，其中通过预先设计使得塑料条与盖片分离的同时盖片仍然保持在载片70之上。此时可以手工将载片70从载片架1中分别取下，或者为了转移方便，载片70可以仍然保留在载片架1之上。
                        实施例3
                      PCR原位杂交
聚合酶链反应被发展成一种在体外扩增少量特定核酸的方法。随后它采用了原位实验的方式使得可以在组织切片中扩增核酸。本发明的方法适合进行原位PCR。PCR原位杂交规程的一个实例在Nuovo(1994)的文章中被描述。
A、原位PCR
将系列组织切片切成4-5μm厚，置于Probe-On-Plus载片70之上并在室温下干燥过夜。对安置的组织切片脱蜡并根据在福尔马林中固定时间的长短于40℃下采用胃蛋白酶消化15-90分钟。在焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水中清洗载片1分钟，然后在100％乙醇中洗1分钟，由此使胃蛋白酶失活。然后在空气中干燥载片70。
依据任何标准程序制备聚合酶链反应溶液。参见，如K.B.Mullis等人的第4,800,159号美国专利。混合缓冲液、5’和3’引物、水、Taq聚合酶(AmpliTaq，Perkin Elmer)(或其他嗜热性聚合酶)和Self-Seal试剂(MJ Reseach，Inc.)，总体积为20-50μL。将该20-50μL的溶液加入特别设计的原位PCR铝板14的孔24中。在实施例1中所采用的板14优选采用一次性塑料材料制成，但用于PCR的板14必须要能经受一系列的可能达到95-100℃的温度循环。因此板14必须具有耐热性(即在高温下不应熔化或损坏)而且还是热的良导体。铝是制备板14的优选材料。铝板14具有的孔24深度为0.005-0.03mm，约能容纳20-50μL的溶液。
铝板14各孔24被充填完全后，将载片架1和载片70置于板14的顶部，组织面向下使其与其下的孔24中的溶液接触。必须小心操作以避免溶液和载片之间出现气泡。此后将载片70、载片架1和铝板14置于热循环器的一个模块中，于95℃加热3分钟，使组织中核酸变性。然后在60℃下2分钟和94℃下1分钟之间进行20-30次热循环。
热循环步骤后，于37℃下将载片70、载片架1和铝板14垂直放入一个含2XSSC的染色盘中5分钟。将载片架1从铝板13上脱除并在37℃-60℃下用0.5-1XSSC清洗10-30分钟(依据背景而定)。如实施例2所述，采用生物素或洋地黄毒苷标记的探针进行原位杂交。
B、逆转录酶原位PCR
将系列组织切片切成4-5μm厚，置于Probe-On-Plus载片70之上并在室温下干燥过夜。逆转录酶(RT)原位PCR的重要特点是同时进行阴性和阳性对照，并且优选在同一块玻璃载片上进行。阳性对照省略了DNAse消化步骤并且应该从目标扩增、DNA修复和错误引发(mispriming)中产生强的核信号。阴性对照采用DNAse处理步骤以及不与细胞中的靶响应的引物。实验样品进行DNAse处理，但使用对细胞中的所需靶核酸特异性的引物。对安置的组织切片脱蜡并根据在福尔马林中固定时间的长短于40℃下采用胃蛋白酶消化15-90分钟。在焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水中清洗载片70共1分钟，然后在100％乙醇中洗1分钟，由此使胃蛋白酶失活。然后在空气中干燥载片70。
通过向一个塑料板14的孔24中充填预先稀释的不含RNase的DNAse(约150-200μL)并将载片70(处于载片架1之中)组织面向地下置于孔24顶部，小心操作以避免夹带气泡并使孔24中的溶液与组织样品接触，由此用不含Rnase的DNAse消化3个安置的组织切片中的2个。在37℃下温育过夜。在DEPC水中清洗1分钟并在100％乙醇中洗1分钟使不含RNase的DNAse失活。在空气中干燥载片70
采用EZ RT PCR(Pekin Elmer)系统进行逆转录。RT/扩增(RT-PCR)溶液含有EZ rTth缓冲液，浓度各为200μM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP、400μg/ml牛血清白蛋白、40单位的Rnasin、0.8μM的5’和3’引物、2.5mM的氯化镁、5单位的rTth以及2X浓缩Self-Seal试剂(MJResearch，Inc.)。将20-50μL的RT-PCR溶液分别置于特殊设计的原位PCR铝板14的3个孔24中(孔24深度为0.005-0.03mm)以充满孔24。将载片70小心置于孔24之上使组织与孔24中的液体接触。将载片70，载片架1和铝板14置于热循环器的一个模块中，于65℃加热30分钟，然后进行95℃加热3分钟的变性步骤。然后进行20-30次热循环，每次循环在60℃下2分钟然后在94℃下1分钟。
热循环步骤后，于37℃下将载片架1、载片70和铝板14垂直放入一个含2XSSC的染色盘中5分钟。将载片架1从铝板13上脱除并在37℃-60℃下用0.5-1XSSC清洗10-30分钟(依据背景而定)。如实施例2所述，采用生物素或洋地黄毒苷标记的探针进行原位杂交。
本领域的技术人员应认识到，除PCR之外的扩增方式现已广为人知并且可以用来替代PCR。这包括连接扩增(连接酶链反应，LCR)以及基于使用Q-β复制酶的扩增法。也可以使用链置换扩增(SDA)，嗜热性SDA以及基于核酸序列的扩增(3SR或NASBA)。参见，如第4,683,195和4,683,202号美国专利以及Innis等人有关PCR的介绍(1994)；Wu和Wallace有关LCR的介绍(1989)；第5,270,184和5,455,166号美国专利以及Walker等人有关SDA的介绍(1992)；Spargo等人(1996)有关嗜热性SDA的介绍以及第5,409,818号美国专利，Fahy等人(1991)和Compton(1991)有关3SR和NASBA的介绍。
                      实施例4
                  具有多层干试剂的孔
利用预干于孔24中的单一试剂可以进行实验，而且如果需要采用几种试剂，带有生物样品的载片70可以从含有第一种试剂的第一孔24移至含有第二种试剂的第二孔24，以下依此类推，其中多个孔24可在同一块板14或不同的板14中。此外，可以将一种以上的试剂预干于同一孔24中。试剂可干燥成层，其中最外层为首先使用的试剂。这在图4中得以表示，该图显示含有细胞或组织切片220的载片70置于孔24之上，试剂在孔24内按第二抗体270、原抗体260和蛋白阻断剂250的顺序被预干于其内。按此方式不同试剂被分离并以干态储存，直至向孔内加入水或缓冲液后反应方能发生。当向孔中加入水(如果盐被预干于孔中的情况下)或缓冲液时，蛋白阻断剂250将首先溶解，因为它是最后预干于孔中的试剂层。此后原抗体260将溶解，最后第二抗体溶解并能够反应。这样的体系允许进行3个步骤而不必将载片70由一块板14移向另一块板14或由一个孔24移向另一个孔24。对于不同类型的试验，例如需要使用系列4种试剂的试验，实验人员可以将这4种试剂按起作用相反的顺序预干于同一孔24中，或者可以使用2块板，其中每块板各含2种试剂或者第一块板含3种试剂而第二块板含第一或第四种试剂，效能更高，例如当第一块板或第二块板的步骤之间需要清洗步骤时。对于本领域技术人员来说，这些方案的变化是显而易见的。与使用4块板相比，任何合并方案均降低了所需劳动力。特别是对于病理学来说，所进行的试验类型被很好地标准化，这种体系非常适合于大量生产含预干试剂的、储存待用的板。该体系并不仅局限于抗原/抗体反应，也可以用于其他反应，例如酶可预干在孔中，利用干在孔中的不同探针可以进行核酸杂交，荧光探针可以作为干试剂，生物素可以被干燥于孔中等等。
为制备具有多层不同试剂的孔，在各层试剂间优选具有惰性材料层。例如，可以按以下方式用试剂涂布孔。将第二抗体涂于孔中并使其变干。在其顶部涂布一种高浓度的惰性材料(即一种任何反应均不需要并且不干扰反应的材料)，如牛血清白蛋白、明胶、蔗糖、胎牛血清、淀粉、琼脂糖以及其他惰性材料，使其变干。优选地，惰性材料分几层添加，例如添加明胶溶液，使其变干，然后再添加明胶溶液，使其变干，以下以此类推。涂布次数依据试验设计而定，涂层的数目影响第二抗体释放的延迟时间。对于惰性层溶解使第二抗体释放的延迟时间为15-20分钟的情况，已经发现在第二抗体顶部涂布5层可以得到好的效果。在第一惰性材料层的顶部涂布原抗体并使其变干。在原抗体层的顶部涂布第二惰性材料层并使其变干。这可以采用低浓度的牛血清白蛋白、明胶、牛胎血清、淀粉、琼脂糖以及其他惰性材料。对于惰性层溶解使原抗体释放的延迟时间约为10分钟的情况，已经发现涂布3层第二惰性材料层可以得到好的效果。在第二惰性材料层顶部涂布蛋白阻断剂，如马和山羊血清。蛋白阻断剂在空气中任其干燥。对于多层的惰性材料需要花时间进行溶解，使得在下一层活性试剂溶解之前有足够的时间进行反应。
该体系的局限性在于它仅能用于连续步骤间不需要清洗步骤的系列步骤中。例如，如果与原抗体反应之后接着与第二抗体反应，在检测步骤之前必须将第二抗体洗净。因此检测时间不能象第二抗体那样预干在同一孔中。类似地，如果一个步骤需要加热(如核酸探针变性)，那么它不能与加热会失活或毁坏的试剂进行合并。
                        实施例5
        内置的对照和自动标记-免疫试验或ISH/FISH
当在临床设备上进行试验时，食品与药物管理部门要求具有对照。在被检测的同一载片上内置对照是检测对照的非常好的方法。如果对照处于另一块完全不同的载片上，则对照的工作效果不好，因为此时它不能指示是否存在诸如试剂没有与生物样品包括对照或真正的测试样品接触，或者遗漏了某一个向对照或测试样品添加试剂的步骤等问题。同时，由于人员或机器的错误，有时滴加到对照样品上的试剂可能与滴加到测试样品上的试剂不同，特别是当几个试验同时进行的时候情况更是如此。当对照与测试样品处于同一载片时，这些问题可以由对照进行指示。但是如果对照是正常或肿瘤组织切片时，制备对照样品是非常费时和费力的。
图3显示了一个其上已经固定有组织片220的载片70，同时也显示了载片70中的一个独立区域，在该区域中已经固定有具有6个独立区A-F的标签或粘贴纸230(例如，粘贴于载片70上的一片硝基纤维素或其他膜或者塑料或玻璃型基体)，虽然使用标签或粘贴纸并不是至关重要的，例如对照可以直接涂布在载片70之上。依据所进行的试验的类型，在A-F各区域中已经点有例如特征抗原性物质或核酸，尽管这些物质可以直接施加于载片70的某一区域而不使用标签或粘贴纸230。采用一个6孔板进行6个独立的试验。各孔24具有分别与A-F反应的试剂A’-F’。仅当载片70位于含试剂A’的孔24上时对照A显阳性，并且对于其他5个孔均应显阴性。仅当载片70位于含试剂B’的孔24上时对照B显阳性，并且对于其他5个孔均应显阴性，以下依此类推。具有外部对照的标签或粘贴纸230可以按商品形式预先制造以供大量交易，或者也可由消费者自己制造。在用于常规临床检验的标签或粘贴纸230中采用颜色编码或其他通过目视可快速显示试验进程的标记则是有用的。颜色编码或其他标记也可与和标签联用的板14的颜色编码或其他标记相匹配，如绿色标签含有抗原决定簇A-F，而绿色的板含有抗体A’-F’。除颜色编码外也可以采用数字或字母编码。它们可以用于乳腺癌的系列检测，与之相反，红色的标签和红色的板指示它们可用于何杰金病的试验。可以采用任何类型的颜色编码，例如系列的颜色条。这些颜色编码可以降低在临床检测实验室中的出错率。在各载片上使用阳性对照也可以作为载片的自动标记系统，因为阳性外部对照对于在载片上进行的试验具有指示作用。如果需要，标签可以与相应的板包装在一起，甚至可以在包装时置于板上，然后在使用时从板上撕下并置于载片之上。与制备对照生物样品，例如用作对照的正常或肿瘤组织切片相比，使用其上含有对照的标签或粘贴纸则更为简单并且耗时更短。
作为一个实施例，可以进行采用6个特征诊断标记物的乳腺检测板。这些特征诊断标记物可以是细胞角蛋白7、细胞角蛋白20、ER、Bcl-2、PR和组织蛋白酶D。这些抗原决定簇均可涂布于标签或粘贴纸上作为对照，而相应的抗体抗原预干在6孔板的各孔中。如果细胞角蛋白7和等价的抗原决定簇被置于标签或粘贴纸的位置A上，则对抗细胞角蛋白7的抗体置于孔A’中。当载片置于孔A’上时标签或粘贴纸的位置A显阳性，并且对于其他5个孔均应显阴性。同时，当载片置于孔A’上时仅有标签或粘贴纸的位置A显阳性，而位置B-F均应显阴性。这使得通过内置式对照可以自动标记载片。如果位置A不显阳性或者如果载片上的任何位置B-F显阳性，则表明试验出现了问题或者试验结果不可靠。
其他可以作为乳腺癌检测标记物板的实例包括如Ki-67、Her-2/neu(c-erbB-2)、P53、pS2、EGFR和因子VIII。其他癌症，如前列腺癌、膀胱癌和结肠癌也可采用相同的检测板。在常规的病理学实践中，四块检测板可以涵盖90-95％的造血疾病的诊断：1〕何杰金病检测板可以包括标记物LCA(CD45)、L26(CD20)、CD3、Leu-M1(CD15)、Ki-1(CD30)和LMP。2〕非何杰金病检测板可以包括标记物L26(CD20)、CD3、MT1、Bcl-1、Bcl-2、Ki-1(CD30)。3〕一独立的非何杰金病检测板可以包括Kappa、Lambda、UCHL-1(CD45RO)、CD5、CD23和CD10。4〕白血病检测板可以包括L26(CD20)、CD34、MPO、Lyso、TdT和DBA44。任何其他所需的检测也可类似地进行，此处不进行界定，例如检测不明来源的未分化的肿瘤的板，肉瘤分类板，淋巴瘤vs.肿瘤vs.黑素瘤，腺癌vs.间皮瘤，肝细胞/胆管瘤vs.转移肿瘤，垂体板，佩吉特式病vs.黑素瘤vs.扁平细胞瘤vs.纤维状组织细胞瘤板，乳腺板，以及膀胱vs.前列腺癌板。其他可能的板为神经内分泌板，小圆细胞肿瘤，生殖细胞肿瘤，何杰金病vs.非何杰金病淋巴瘤，淋巴瘤vs.反应性增生，血浆细胞体液不调，白血病板和病毒板。
各实验室可以制作其自身的试验系统，使得最适于其职员以及所进行的试验的数目及类型。例如，如果试验需要使用第一套抗体，然后再与第二种抗体反应，其中第二种抗体对所有样品均相同，如果所进行的试验数量少则在板上进行试验，但是如果所进行的试验数量大，则优选将所有载片置于一个含有第二种抗体和/或检测系统的大池中(“批量”或“大量”温育的方法)。此外，对于进行少量试验的实验室来说，有可能在一片滤纸上涂布第二种抗体和/或检测系统，将所有载片置于滤纸之上并在使用时将滤纸弄湿。与使用板相比这样较为便宜。类似地，核酸探针可以置于滤纸之上。
                      实施例6
                内置式对照-核酸杂交
按照类似于实施例5中免疫试验所讨论的方式，内置式对照可用于核酸试验如ISH或荧光原位杂交(FISH)。在一种类型的FISH中，使用照亮染色体大部分的荧光探针。这称为全染色体染色(WCP)。该技术可用于观察总染色体失常如易位。所用探针结合有各种不同的有色荧光团。例如，染色体1的探针可以是荧光黄，染色体2的探针可以是荧光绿，而染色体3的探针可以使用红的荧光团。因此有可能同时对全部3条染色体染色并且仍能容易地相互分辨。在人细胞中有多达24条特征核染色体，即染色体1-22、X和Y染色体。如果使用三种不同的荧光团，使用仅8种不同的组织切片或8种不同的细胞即可对所有24条染色体进行研究。这可以在8个独立的载片上进行研究，或者如果需要将不同的组织切片或细胞置于同一载片的不同部位。有可能将8个组织切片置于同一载片上，使得在同一载片上利用不同的8套3个混合探针进行所有反应来研究所有24条染色体。通过将载片置于具有8个独立孔的板或架之上在一块细胞涂片上进行测试，其中各孔中已经预干有不同的3个探针。使用微量试验技术将24个内置式对照直接涂布于载片之上，使其在载片的内部边界内围绕各孔区域(参见图6E)。本领域技术人员应当认识到不必使用8套3个探针。其他有可能的变化如使用6套4个不同标记的探针。也不必使用预干有试剂的板，试剂可以按液体形式添加至板中。按类似的方式，使用所需数目的对照也可以进行其他技术如原位杂交，其中对照被直接涂布于围绕载片内边界的区域中。虽然如图所示对照按围绕孔边缘的方式放置，这种模式并不是必需的，对照可以采用其他模式只要它们处于可与孔中试剂接触的区域即可。
                        实施例7
                 自动化的多孔板以及机器
生物样品的检测是非常费时的，甚至当采用自动化系统时情况也是如此，因为自动化系统仍需要一些手工执行的步骤。采用安装有管线和一个泵或多个泵或自动处理机器的多孔板，或含有预干试剂的多孔板，可以部分或全部进行生物样品的自动化处理。这种多孔板在设计上类似于上述的板14。但是自动化多孔板330(参见5A-B)可用于诸如清洗步骤或者可以较大用量使用较便宜试剂的步骤。自动化多孔板330的反应室280被设计成容纳体积例如为0.01-1mL，尽管这一数量并不至关重要，它可以更大或更小。孔包含用于连接管线的一个或多个进口和一个或多个出口。连接进口的管线与泵相连。带有载片70的载片架1被置于自动化多孔板330的顶部并且将液体通过进口如300或302输送至反应室280中。如果需要利用，泵190和通过进口302的管线295以及通过出口294的管线310，在反应期间可以循环和反复使用试剂(如图5B所示)。此外，操作人员可以将使用过的材料通过出口296直接输送至废液容器291或一个槽中，或者例如送至一个凝胶或其他仪器中进行分析。循环的试剂可以减少温育或反应时间并降低背景。循环试剂的浓度也可逐渐增加和减少以达到最佳反应条件，特别是使用多个探针时。特别实用的情况是使用允许采用可变体积的软底板。
中央处理单元286控制试剂的输送以及连接在泵上的管线的各部位阀门的开关，使得一个泵可以控制几种不同的试剂或者多个泵可由中央处理单元全部控制。按照这种设置，带有载片和固定的生物样品的载片架可被置于多孔板之上，以液体循环或直接处置液体的模式，中央处理单元可以被启动将所需液体和试剂输送至反应室中。不同的试剂可以顺序输送至反应室中而不必手工将载片由一块板移向另一块板。例如，带有生物样品的载片可被置于自动化多孔板上，而且该系统可以输送以下试剂：二甲苯、100％乙醇、90％乙醇、过氧化氢、第二种抗体、检测试剂(ABC)、二氨基联苯胺、曙红、各步骤间的PBS清洗液，以及然后的90％乙醇、100％乙醇和二甲苯及盖片溶液。如果需要，反应在上述常规多孔板14中进行，可以在任何中断步骤中将载片从自动化多孔板上取下。
作为另一个实施例，带有固定的组织切片的载片可被单独脱蜡和处理，然后置于具有预干试剂的多孔板之上并连接于自动处理器上，该自动处理器将输送所需液体如第二种抗体、检测试剂(ABC)、二氨基联苯胺和曙红以及各步骤间的PBS清洗液，然后是90％乙醇、100％乙醇和二甲苯及盖片溶液。
使用自动化多孔板具有几个好处。它使得多个步骤连续进行，在各步骤中不需手工参与。同时它也更为安全，因为以下危险性试剂，如致癌的二甲苯和二氨基联苯胺，可直接从容器输送至反应室中，然后再进入废物接受器中或使试剂重复使用的接受器中，而不需操作人员将这些试剂手工加入孔中并处理带有致癌物质的板。对于现有技术中仅简单地将试剂滴加至置于载片上的生物样品顶部的方法来说，这些试剂的反复使用是不可能的。因此，自动化多孔板降低了危险性试剂的暴露量，使得危险性试剂的处置容易，同时降低了这些试剂的用量，因为试剂可以反复使用和循环。
中央处理单元286也可控制加热块288的加热和冷却以进行原位PCR或者使用于原位杂交的探针变性。PCR试剂，包括生物素或如果需要的洋地黄毒苷、以及引物组，可以被涂布和干燥于板330的孔中。带有样品220的载片70被置于板330之上并加入水和缓冲液。加热块288可以紧贴于载片70(如图5B所示)或板，或者可被设计成与载片和板组件的两面接触，并且可以由中央处理单元286控制。从各孔410中可以得到两个结果。第一，孔410中的液体可以被除去并且在预干凝胶298上检测是否存在DNA带。这些带的大小可以在凝胶298上确定。这可以作为对照以指示PCR进行得是否成功。这是有可能的，因为扩增的DNA的大部分不会保留在样品的细胞中而是泄漏至孔中的溶液内。第二，扩增的DNA的一部分保留在细胞中，这可以采用本领域众所周知的方法通过检测生物素或洋地黄毒苷进行观察。因此一个原位PCR显示出试验所检测的何种细胞。
本发明也采用了一种新型的改进方法，其允许操作人员在继续后处理组织样品之前，回收反应液体并检测反应液体以确定PCR是否进行正常或已经受到了污染。这一试验是非常快速和简单的，例如，简单地将反应液体置于琼脂糖凝胶中并观察是否存在特定尺寸的带。当确定PCR进行正常时，则值得继续后处理组织样品。但是如果确认PCR失败时，操作人员知道不值得花费劳力和金钱进行处理这一具体样品。
上述提及的检测反应液体的能力不仅对于确定是否值得继续后处理这一具体样品是有用的，而且也获得了仅在组织中观察原位杂交结果所不能得到的实验结果。当进行原位杂交时，扩增物的一部分保留于扩增区域而另一部分则进入溶液中。通过检测溶液中的这一部分，操作人员不仅可以确定核酸的相对量，而且也可以确定扩增核酸的大小。当仅观察组织样品时，操作人员不能确定所生成产品的大小，而仅能知道某些核酸被扩增了。另一本发明方法操作人员还可以确定的是何种细胞表达了核酸。这两套数据是相互补充的。显然本发明使得操作人员可以看到两套相互补充的数据。到目前为止尚没有任何设备可以使操作人员从一个聚合酶链反应中得到两种类型的数据。
本发明的另一个方面是反应室280的体积可以调整。优选地，采用中央处理单元286控制活塞284，该活塞推动柔性或可移动的反应室底部282。活塞移动调节了反应室280的体积。例如，当进行原位PCR时，理想的情况是将反应体积保持得非常小，如10-50μL。PCR反应后可能需要将反应液体输送至反应室之外。但是如此小体积的液体将通过毛细作用而得以保持在载片70和反应室底部282之间。通过扩大反应室以容纳更多的液体，可以更加容易地完成所需的输送。本领域的技术人员应认识到可以采用多种方法调整反应室280的体积，而不必使用由中央处理单元控制的活塞。例如，可以在反应室底部安置螺栓，通过转动螺栓将挤压板的底部，迫使反应室底部移向显微镜载片以减小反应室280的体积。进行反向操作则可扩大体积。
                          实施例8
                       全染色体染色
通过已知的全染色体染色技术可以检查染色体的宏观异常如易位。该方法使用多个荧光标记的探针与染色体结合从而有效地“点亮”整个染色体。各染色体的特征探针组可用于研究任何所希望的染色体。人类共有24条细胞核染色体，它们是染色体1-22、X和Y。同时对多个染色体进行染色是常见的。通过使用不同颜色的荧光探针可容易地辨别染色体。例如，采用探针组可以同时对染色体1、2和3进行染色，其中探针组利用荧光黄染色一个染色体，利用荧光绿染色第二个染色体，利用荧光红染色第三个染色体。典型地，使用这种体系一次检测要使用8块载片以检查人类的全部细胞核染色体组。该试验包括将8个载片置于板的8个孔上。所检测组织的实例是血液或骨髓涂片。如果需要，探针可预干于孔中。
本发明推出了一种设计用于在同一块载片70上分析全部24条染色体的架或板400。板400是一种可以夹在或附于显微镜载片70之上的物品。架或板400含有8个孔410，各孔410间通过沟或槽420与相邻孔410分离。这种板400在图6A中显示。板400的各孔410具有一个狭小的开口430，通过该开口试剂可加到孔410中。
在实际使用中，将所检测的细胞滴加或分散至显微镜载片70之上。然后将载片70附于板400之上，使得细胞面向板400的孔410。然后通过板中通向各孔410的开口430将试剂分别加入到各孔410中。通过毛细作用试剂将在孔410和载片70间展开。在各孔410中加入对不同染色体具有特异性的不同试剂。孔410间的沟或槽420用于防止从一个孔410中出来的液体扩展到相邻孔410中，从而避免了交叉污染。孔410保持预定体积的液体，如各为10-20μL，毛细作用使得仅有足够充满孔410的缓冲液被加入而不造成过度的溢流。这有助于防止交叉污染。采用如黄、绿和红的荧光探针，可以在每个孔中检测3种不同染色体，从而使得在同一块载片70上检测全部24条人染色体。
在一个优选的实施方案中，探针被预干在板400的8个孔410中，其中每一孔中的探针检测3条染色体。如果需要，其他试剂如盐也可预干在各孔410中。中期或间期细胞被铺展固定在载片70之上，同时载片70与板400接触。然后从各孔410的开口430加入缓冲液，对所有孔410加入相同的缓冲液以避免在孔410中加入错误试剂(人为错误)的可能性。孔410加入缓冲液后预干的探针和盐溶解并且发生杂交。典型的温育是70-90℃下1-2分钟，使探针和细胞核DNA失活，此后在37-45℃下温育约2小时，常规温育时间为30分钟至过夜之间的任何时间点。可以从本领域常用的几种缓冲液体系中按照需要选择杂交缓冲液。例如常采用2XSSC。有时将甲酰胺加到缓冲液中。在一个优选的实施方案中，温育后板400可放在一种吸收性材料如纸巾上，孔410中的反应液体将通过毛细作用从孔410中物理性移出，吸收性材料吸收杂交液体。这防止了载片70与板400分离时孔410间的交叉污染。
在一个更优选的实施方案中，载片70在区域440处含有阳性和阴性对照，这些区域分别与8个孔410中的杂交液体接触。采用现今非常流行的微量实验技术，优选在细胞置于载片之前，将与用于染色体染色的探针互补的核酸涂布和固定于载片70之上。该操作可以在工业化条件下进行，并且带有内置对照的载片可以成为商品。优选地，在所有与杂交缓冲液接触的8个区域上放置24个对照442。该排列的一个实例在图6E中有显示，其中所有24种核酸围绕与各孔410接触的各区域440的边缘排列。例如，如果第一区域440接触含有染色体1、2和3的探针，则染色后这些染色体的对照核酸将显现(各对照仅显示一种颜色)，而其余21个对照不应杂交并且不应显现荧光。以此方式下，对8个孔410均有阳性和阴性对照以及标记。
本领域的技术人员应认识到可以采用其他类似设计的板。不必采用8孔板。例如，如果使用4种颜色的荧光探针，采用6孔板就可以获得相同的结果。而且本发明并不仅局限于分析人类染色体。其他生物的染色体按类似方法进行分析，板中孔的数目依据个人选择而定，通常由所检测的染色体或探针的数目而定。本领域的技术人员也应认识到板可设计成保持多于一块的载片，使得可以同时检测多个细胞样品，与几个独立载片相比多个载片同时处理更为容易。
                         实施例9
                      具有凹孔的盖片
除了简单地将试剂滴加到固定于载片上的生物样品中的方法以及将载片置于带有充满试剂的孔的板中的方法外，可以在载片或一系列互联的载片上放置盖片，其中盖片是凹形的，而且包含一个或多个孔。这在图7A-E中有显示，其中6个载片被同时分析。图7A显示带有生物样品520的载片510被夹持于载片架515中。图7B显示与图7A相配合的盖片500。以下讨论的插件540可包含用于显示信息的书写部位501。区域502和503分别为阳性和阴性对照。依据所进行的具体类型的试验，对照502和503可以为例如蛋白、核酸和细胞系。通道504和505允许液体进入以及空气排出。孔530也被图示出来。盖片500也可用条码标记，这在图7B中显示为506或者可以具有书写标记。
图7C显示盖片500置于载片510之上。盖片500被置于带有生物样品520的载片510之上并利用盖片500的顶部固定于载片510之上。然后将载片510和盖片500浸入水、缓冲液或试剂中。毛细作用将造成液体上升入盖片500的孔530中。表面张力使盖片500牢固夹持载片510。这造成了一个具有已知体积和试剂浓度的封闭体系。
图7D显示反应发生后并且盖片510已经脱除后的结果。显示生物样品520和阳性对照502被染色。
在本发明的一个优选方面中，盖片500具有预干于其上的试剂或试剂组。当带有预干试剂的盖片500置于带有生物样品520的载片510之上时，仅将载片510和盖片500浸入水或缓冲液中，造成液体充填盖片500中的孔530并使干试剂溶解。然后将载片510和盖片500从水或缓冲液中取出并听任反应进行。已知量的试剂或试剂组被预先干燥，因此在孔530中具有准确已知量的试剂并因而与生物样品520接触。孔530的体积也是已知的，因而试剂的浓度也是已知的。
在本发明的另一个优选方面中，用耐有机和水性液体的胶将插件540例如玻璃或塑料插件粘结在载片510上，由此使盖片500附着于载片510之上。这在有关单一载片和用于单一载片的盖片的图7E-H中有显示。包含孔530的盖片500被置于插件540之上，其中孔530具有通道504和505。图7F显示了插件540，其包含阳性502和阴性503对照，用于识别插件540的书写部位501，以及水溶性胶区域542。盖片500的上部因此通过水溶性胶粘附于插件540之上。对照502和503位于盖片500的孔530区域中。通过例如耐有机和水性液体的胶，插件540的背面被置于并固定在载片510之上。载片510和盖片500被浸入缓冲液中，然后取出，并听任反应进行。此后可以将载片510和盖片500置于含试剂或清洗溶液的槽中进行处理。水性溶液将造成水溶性胶溶解从而释放出盖片500，但插件540不被释放。此时盖片500可容易地脱除。插件540仍保持在载片510上作为对照和标记。
在本发明的再一个优选方面中，载片510具有固定于其上的对照样品502和503。对照502和503可点于载片510上，或者在粘附于载片510之上的纸或标签上，或者是在插件540上。这些可用作阳性对照、阴性对照或同时用作阳性和阴性对照的对照样品(作为独立的点加以固定)，可用于确定方法进行是否正常。如果对照502和503固定于插件540之上，它们应固定在不被胶掩盖并与盖片500的孔530交叠的区域中，使得对照502和503接触缓冲液和试剂。
具有对照502和503的插件540可以预先制造待用。这些插件540还包含指示对照502和503名称以及是否为阳性和阴性的文字。
盖片500也可被标记，并可包含条码560以方便或自动化识别。含有预干试剂的盖片500易于保存并且为待用状态，使用非常方便。使用含有预干试剂的盖片500也意味着在分析时不需滴加少的、准确量的试剂，使得生物样品的分析速度更快。
                         实施例10
             在载片上处理生物样品的自动化方法
通过使用图5A-B所示的反应室，类似于实施例9的方法可以自动化地进行。不同之处在于在自动化规程中所采用的盖片不需包含孔，它可以为平的。图8A-D显示了这一方法。带有生物样品610的载片600被置于载片架620中。盖片630包含可含有书写信息的区域640。对照样品650和660可包含在盖片630上。盖片630可包含条码650和写于其上的文字。带有生物样品610的载片600被置于反应室中，如图5A-B所示，用有机试剂处理使样品610脱蜡。在一个优选的实施方案中，如图8A所示，几个载片600被被置于同一载片架620中。样品610脱蜡并清洗后，可将试剂加入到反应室中。在一个优选的实施方案中，盖片630与载片600一起被置于反应室中。这在图8C中有显示，虽然图中未显示反应室，但显示出了盖片630以及带有生物样品610的载片600。盖片630优选含有预干在其中的试剂，优选位于区域680中。添加水或缓冲液溶解试剂，使其与生物样品610以及对照650和660反应。反应后，可使清洗溶液由反应室中通过。清洗完成后，将一起从反应室中取出的盖片630和载片600压在一起，即不象实施例9中的盖片500那样，盖片630作为一个永久性盖片。图8D显示了盖片630安装于带有生物样品610的载片600之上，其中阳性对照650呈阳性。
在盖片630上预干有已知量试剂的优选方法在临床实验室中使用非常快速和容易。试剂不需计量或滴加。仅需简单地将盖片630和带有生物样品610的载片600一起置于反应室中并听任反应进行。而且盖片630可以包含预先点于其上的阳性和阴性对照，使得可简便地分析反应进行是否正常。
                         * * *
采用上述方法可以使操作人员在15-30分钟内获得所有诊断标记物的结果。因此当患者尚处于手术室中时就可以获得检测结果。病理工作者和外科医生可立即决定是否要进行另外的手术或者是否需要进行化疗或放射疗法。这使得外科医生可立即进行手术而不是在以后的时间进行手术。如果采用当今的商品自动化系统而非本发明的方法，为得到结果需要更长的时间，这部分是因为当今的商品自动化系统不能就一位病人进行检测，而是要将许多样品置于自动化仪器中进行检测，必须等候直至所有样品被加载并接着被处理。当今的商品自动化系统将试剂滴加至载片顶部并且生物样品并不总是被完全覆盖，而本发明的方法及生物样品置于充满液体的孔上，确保了整个样品与试剂的接触。
上述实施例仅起示例性作用，它们并不用来界定可采用本发明定义的装置进行试验的技术。此处不作界定，本发明可以用于免疫组织化学、原位杂交、原位PCR以及荧光原位杂交(FISH)。对于本领域技术人员来说，显而易见上述描述仅起示例性作用，它们并不起界定作用。具体的描述并不是至关重要的，在仍能获得好的结果的前提下可以进行改变。本领域的技术人员可以容易地构想出本发明的其他应用。
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Claims (1)

1、一种采用试剂处理生物样品的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将所述生物样品置于显微镜载片之上，
(b)将所述显微镜载片插进一个载片架中，所述载片架可以夹持多个载片，并且在载片架上有多个盖片与每个载片相对，
(c)在每个盖片的表面上预干一种以上的试剂，而且所述试剂之间通过惰性层相互分隔，其中所述一种以上的试剂是按起作用相反的顺序干燥成层状，而且在添加水或缓冲液时都溶解，
(d)将处于所述载片架中的所述显微镜载片与所述盖片相互对置，其中不存在用于将所述显微镜载片固定在所述盖片表面上的密封，以及
(e)向所述载片与盖片之间的间隙中添加水或缓冲液以溶解所述试剂，使得所述生物样品接触所述盖片中的所述试剂。
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