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Gebiet der Erfindung
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Diese Erfindung betrifft Vorrichtungen
und Testsätze
zum Testen von Probenflüssigkeiten
wie Serum.
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Hintergrund
der Erfindung
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Agglutinationstests werden beim Testen
von Probenflüssigkeiten
seit vielen Jahren häufig
verwendet. Herkömmlicherweise
wurden solche Tests auf einer festen Oberfläche wie einem Glas-Objektträger eines
Mikroskops durchgeführt,
und das Vorhandensein eines agglutinierten partikelartigen Reagens
wurde entweder mit bloßem
Auge oder mit Hilfe eines Mikroskops beobachtet. Heute sind Testsätze im Handel
erhältlich,
bei denen das partikelartige Reagens in trockener Form vordosiert
auf einer geeigneten festen Oberfläche, z. B. einer „Testkarte",
zur Verfügung
gestellt wird. Die Probenflüssigkeit
wird auf die Karte aufgebracht, z. B. als ein Tropfen Serum. Um
Reagenzien zu konservieren und um die Handhabung der Testkarte zu
erleichtern, ohne eine Kontamination des getrockneten Reagens zu
riskieren, ist dieses Reagens üblicherweise
in einem dafür vorgesehenen
Testbereich auf der Karte angeordnet, z. B. in einem deutlich gekennzeichneten
Bereich, der kreisfömig
ist oder eine andere Form hat. Es ist üblicherweise nötig, die
Probenflüssigkeit
physisch zu agitieren, um eine Herstellung des getrockneten partikelfömigen Reagens
zu fördern.
Daraufhin kann die Agglutinationsreaktion erfolgen, und das Testergebnis
kann durch eine Prüfung
der Testkarte nach einer angemessenen Zeitspanne ausgewertet werden.
Testvorrichtungen dieser Art sind z. B. in der US-3,770,383 offenbart.
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Um dem Nutzer die Gewissheit zu geben, dass
die Testkarte zufriedenstellend funktioniert, ist es wünschenswert,
eine Kontrolle vorzusehen. Üblicherweise
ist dies eine Positiv-Kontrolle, die dem Nutzer hilft, den Grad
der Agglutination (oder deren relative Abwesenheit) festzustellen,
der ein klar positives Testergebnis anzeigt. Beispielsweise ist
bei einigen Tests diese Kontrolle in Form einer Probenflüssigkeit
vorgesehen, die den betreffenden zu bestimmenden Stoff enthält, z. B.
Antikörper
(z. B. in Serum), die gegen ein betreffendes infektiöses Agens (z.
B. H. pylori oder Neisseria) verwendet werden, oder ein Präparat, das
Antigene von dem betreffenden Organismus enthält (welches die Form eines
Antigenextrakts oder einer bakteriellen Zell-Suspension haben kann).
Um die Intaktheit dieses flüssigen
Kontrollreagens zu erhalten, muss es bei niedriger Temperatur aufbewahrt
werden. Die Notwendigkeit eines Zugangs zu Kühl-Aufbewahrungseinrichtungen grenzt die
praktischen Situationen stark ein, in denen solche Tests durchgeführt werden
können.
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Außerdem erfolgt bei den derzeit
erhältlichen Tests
die Herstellung des getrockneten partikelartigen Reagens nicht immer
effektiv.
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Allgemeine Beschreibung
der Erfindung
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Bei einem ersten Aspekt der Erfindung
wird eine Testvorrichtung zum Testen des Vorhandenseins eines zu
bestimmenden Stoffs in einer Probenflüssigkeit zur Verfügung gestellt,
wobei die Probenflüssigkeit
von einer Testfläche
getragen wird, wobei die Vorrichtung einen Teststab aufweist, der
einen Griffabschnitt hat, der von einer den Test durchführenden
Person zu halten ist, sowie einen Mischabschnitt für einen
Kontakt mit der Probenflüssigkeit, wobei
der Mischabschnitt ein getrocknetes, vorher dosiertes Reagens für den Test
trägt,
wobei das Reagens als eine Vielzahl von Punkten in geringem Abstand
zueinander so angeordnet ist, dass durch den Kontakt des Mischabschnitts
des Teststabs mit der Probenflüssigkeit
das Testreagens erstellt wird, wobei der Mischabschnitt so konstruiert
ist, dass er mit einer Mischfläche
versehen ist, um das erstellte Testreagens mit der Probenflüssigkeit
auf der Testfläche
zu mischen.
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Vorzugsweise ist das vorher dosierte
Testreagens partikelartig, und die Testergebnisse werden durch das
Auftreten oder die Hemmung einer Agglutination der Partikel nach
dem Mischen mit der Probenflüssigkeit
offenbart.
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Die Testfläche kann eine beliebige feste Oberfläche sein,
auf der ein Test, z. B. ein Agglutinationstest, durchgeführt und
sichtbar gemacht werden kann. Herkömmlicherweise haben solche
Oberflächen
die Form einer Testkarte o. Ä..
Es ist wesentlich, dass unter normalen Verwendungsbedingungen die aufgebrachte
Probenflüssigkeit
im Wesentlichen auf der Oberfläche
der Karte bleiben muss. Dementsprechend sollte die Testkarte die
Probenflüssigkeit
nicht aufsaugen. Kunststoff, als Platte oder Form, ist ideal, aber
absorbierende Materialien wie Papier und Pappe können leicht verwendet werden,
wenn die Arbeitsoberfläche
nicht-absorbierend gemacht wird, durch eine Vorbehandlung oder Beschichtung
mit nicht absorbierendem Material wie Polypropylen oder Celluloseacetat.
Die gegenwärtig
erhältlichen
Testkartenmaterialien können
ohne Schwierigkeiten mit der erfindungsgemäßen Testvorrichtung verwendet werden.
Die Testfläche
ist nicht Teil der vorliegenden Erfindung.
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Wenn das Testergebnis auf einem Agglutinationstest
beruht, sollte das vorher dosierte getrocknete Reagens auf dem Teststab
partikelartig sein. Herkömmliche
Agglutinationstest-Reagenzien sind durchaus geeignet. Vorzugsweise
sind diese „Latex-",
d. h. Polystyrenpartikel, die ein spezielles Bindemittel tragen,
z. B. einen Antikörper
oder ein Antigen, das zu einer Agglutinierung der Partikel während des
Tests führt.
Typischerweise haben diese Partikel eine Größe im Bereich von 200 bis 1000
nm, noch üblichererweise
300 bis 500 nm. Die Partikel sollten eine Farbe haben, die vor dem
Testkartenhintergrund deutlich sichtbar ist. Üblicherweise sind die Partikel
selbst stark farbig, z. B. blau oder rot, und werden vor einem weißen oder
anderen hellen Kartenhintergrund verwendet. Jedoch können auch
weiße
Partikel vor einem dunklen, z. B. schwarzen, Hintergrund verwendet
werden. Erythrozyten oder Protein-A tragende Partikel sind bei einigen
Tests herkömmliche
Alternativen zu Latexpartikeln. Bei Vorhandensein einer „positiven"
Probe kann die Agglutination entweder hervorgerufen oder gehemmt
sein. Für
die Zwecke der Erfindung ist es nicht notwendig, dass sich das Agglutinations-Reagens
von den herkömmlicherweise
verwendeten unterscheidet.
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Im Gegensatz zu den existierenden
Verfahren werden Vorteile erreicht, wenn die Probenflüssigkeit
nicht direkt auf das vorher dosierte getrocknete Reagens aufgetragen
wird. Wir haben festgestellt, dass eine direkte tropfenweise Zugabe
der Probenflüssigkeit
auf ein vorher dosiertes Reagens Probleme durch schlechte oder ungleichmäßige Abgabe des
getrockneten Materials und „Verklumpen"
des getrockneten Materials, das mit echter Agglutination verwechselt
werden kann, hervorrufen kann. Erfindungsgemäß ist es vorzuziehen, die Probenflüssigkeit
auf die Testkarte (die nicht mit dem getrockneten Reagens vordosiert
ist) zu geben. Nach der Zugabe wird die Probenflüssigkeit bewegt und mit dem
vorher dosierten Reagens gemischt, indem die erfindungsgemäße Testvorrichtung
verwendet wird, wodurch eine gleichmäßige und effektive Herstellung
des getrockneten Reagens gewährleistet
wird, bevor die Agglutinationsreaktion beginnt.
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Praktischerweise umfasst der Teststab
Plastik-, Papp- oder ähnliches
Material von ausreichender Steifigkeit, um das Mischen des Testreagens
und der Probe zu erleichtern. Bei einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Teststab als eine im Wesentlichen lineare Komponente vorgesehen
(praktischerweise im Wesentlichen plan, wie ein Spatel o. Ä.), bei der
der Mischabschnitt durch einen flexiblen (z. B. faltbar verformbaren)
Bereich mit dem Griffabschnitt verbunden ist, so dass der Mischabschnitt
leicht aus der Linie des Stabs heraus gebogen werden kann, um eine
Oberfläche
(in einem Winkel bezüglich
des Griffabschnitts des Stabs) zu bilden, die das Mischen des hergestellten
Testreagens und der Probenflüssigkeit
erleichtert. Dies kann leicht durch eine Sollbruchlinie erreicht
werden, z. B. eine eingeprägte Falt-
oder Knicklinie, eine Perforationslinie oder einen Teilschnitt,
wobei die Sollbruchlinie entlang der Breite des Stabs nah an einem
Ende verläuft.
Einfacher Fingerdruck auf den Griffabschnitt des Stabs, während der
Mischabschnitt eine Oberfläche,
z. B. die Testkarte, berührt,
kann den Stab dazu bringen, sich an der Sollbruchlinie zu biegen.
Die Sollbruchlinie bildet die Grenze zwischen dem Mischabschnitt und
dem Griffabschnitt.
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Alternativ kann der Teststab aus
elastisch verformbarem Material bestehen, so dass der Stab während der
Benutzung gebogen werden kann, um den Mischabschnitt in einem Winkel
zu dem Griffabschnitt vorzusehen, wodurch das Mischen der Probe mit
dem Testreagens erleichtert wird.
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Das Vordosieren des Testreagens kann leicht
durchgeführt
werden, indem eine herkömmliche
Reagens-Aufbringungstechnik wie Reagens-Abdruck und Mikropipettierung
verwendet wird. Typischerweise reicht das Gesamtvolumen des aufgebrachten
Reagens von 1 bis etwa 50 μl,
das als mehr als ein Punkt aufgebracht werden kann. Eine genaue Positionierung
kann erreicht werden, indem z. B. ein Koordinatenschreiber verwendet
wird. Nach der Aufbringung kann das Reagens mit herkömmlichen
Verfahren getrocknet werden. Die Verwendung von Stabilisatoren wie
nichtspezifischen Proteinen (z. B. BSA) und/oder Kohlehydraten und
Zuckern (wie Saccharose, Sorbitol oder Trehalose) ist vorteilhaft.
Ein typischer wässriger
Puffer kann von ungefähr
1 bis ungefähr
30 mg/ml BSA und von ungefähr
10 bis ungefähr
100 mg/ml Sac charose enthalten. Diese können in Aufbringungspuffern
enthalten sein oder nachfolgend gemäß herkömmlicher Verfahren zugefügt werden.
Typische Puffer sind Phosphatpuffer, üblicherweise mit einem pH-Wert
von etwa 7, Glyzinpuffer, Trispuffer und Boratpuffer.
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Die trockenen Reagenzien der Erfindung können auch
Zusätze
enthalten, die die Leistung des Tests verbessern, z. B. Hemmer für nichtspezifische Bindungen,
z. B. ein Tensid wie „Tween
20", und Eliminatoren von Störfaktoren
wie dem Rheuma-Faktor bei Serum. Es ist offensichtlich, dass das
Trocknen von Reagenzien an dem Teststab die Stabilität des Reagens
(z. B. proteinhaltiger Substanzen) erhöht, insbesondere bei Umgebungstemperaturen.
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Vorzugsweise ist wenigstens der Mischabschnitt
(oder dessen Bereich, auf dem das getrocknete Reagens aufgebracht
wird), und wünschenswerterweise
der gesamte Teststab, aus transparentem oder durchscheinendem Material
hergestellt. Dies hat den Vorteil, dass eine Person, die den Teststab während eines
Tests verwendet, leicht visuell bestimmen kann, wann das getrocknete
Reagens richtig hergestellt und von dem Teststab gelöst wurde.
Einige transparente oder durchscheinende Kunststoffe sind bekannt,
die Eigenschaften haben, die zum Herstellen von erfindungsgemäßen Teststäben geeignet sind.
Dazu gehören
Polystyren, Polyethlyen, Polypropylen, Polymere aus Acrylsäuren oder
Methacrylsäuren,
und verwandte Verbindungen und Derivate der Vorigen.
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Ein weiteres fakultatives Merkmal
des Teststabs ist, dass er so konstruiert ist, dass er verwendet werden
kann, um Bakterienkolonien von der Oberfläche von Agarplatten aufzunehmen.
Es ist ebenfalls ein bevorzugtes Merkmal, dass der Teststab eine kleine
Menge an Flüssigkeit
(z. B. eine wässrige
Probenflüssigkeit)
aufnehmen kann. Typischerweise wird die Flüssigkeit durch einen speziell
dafür angepassten
Bereich des Mischabschnitts aufgenommen, und wünschenswerterweise wird die
Flüssigkeit
getrennt von dem getrockneten Reagens gehalten, um dessen vorzeitige
Bildung zu verhindern. Typischerweise wird die Flüssigkeit
durch Oberflächenspannung
und/oder Kapillarwirkung aufgenommen. Z. B. kann der Flüssigkeitsaufnahmebereich
die Form einer kleinen Öse
in einem Endbereich des Teststabs (ähnlich denen, die bei herkömm lichen
Impfösen
verwendet werden) oder die Form eines engen geraden Kanals in dem
Teststab annehmen.
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Die aufgenommene Flüssigkeit
kann auf der Oberfläche
einer Testkarte aufgebracht werden, indem der Flüssigkeitsaufnahmebereich des
Teststabs die Oberfläche
der Testkarte berührt,
so dass die aufgenommene Flüssigkeit
mit der Testkarte in Kontakt kommt. Alternativ kann der Flüssigkeitsaufnahmebereich
verformt werden, indem er gegen die Testkarte gedrückt wird,
um die aufgenommene Flüssigkeit
abzugeben.
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Bei bestimmten Ausführungsformen
kann es wünschenswert
sein, eine Vielzahl von Substanzen auf dem Teststab vorzusehen,
wobei jede der Substanzen als einzelner getrockneter Punkt ausgebildet ist.
Wenn z. B. Substanzen nicht für
eine mittel- oder langfristige gemeinsame Lagerung geeignet sind, können sie
auf dem Teststab als einzelne getrocknete Punkte vorgesehen sein,
die sich erst bei der Herstellung während der Durchführung des
Tests vermischen, so dass sie während
der wenigen Minuten, die zur Durchführung und Ablesung eines typischen Tests
erforderlich sind, ausreichend stabil sind.
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Bei einem zweiten Aspekt der Erfindung
wird ein Testsatz zum Testen des Vorhandenseins eines zu bestimmenden
Stoffs in einer Probe zur Verfügung gestellt,
wobei der Testsatz die oben definierte Testvorrichtung umfasst.
Im Einzelnen enthält
der Testsatz praktischerweise eine Vielzahl dieser Testvorrichtungen.
Vorzugsweise ist die Vielzahl von Teststäben als „Abreiß"-Anordnung von vereinzelbaren Einmal-Stäben vorgesehen,
vorzugsweise in einer Anordnung Seite an Seite, wobei jeder Stab
von benachbarten Stäben
durch eine Sollbruchlinie getrennt ist (z. B. eine Falt-, Knick-,
Teilschnittlinie, Perforation etc.). Bei einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst das getrocknete Testreagens einen Antikörper, der spezifisch für ein Antigen
ist, das spezifisch für die
Lancefield-Gruppe ist. Wünschenswerterweise umfasst
der Testsatz eine Vielzahl von Anordnungen von Stäben, wobei
jede Anordnung von Stäben
einen Antikörper
hat, der spezifisch für
ein anderes Antigen ist, das spezifisch für die Lancefield-Gruppe ist.
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Andere Komponenten können vorteilhafterweise
vorhanden sein. Zu diesen fakultativen Komponenten zählt eine
Testkarte, die eine Testfläche aufweist,
auf der die Pro benflüssigkeit
während
des Tests getragen wird. Vorzugsweise sind die Teststäbe und die
Testkarte (sofern vorhanden) Einwegprodukte. Zusätzlich erfordert der Lancefield-Gruppierungs-Agglutinationstest,
der verwendet wird, um Streptokokken einer der verschiedenen Lancefield-Gruppen
zuzuordnen, einen Extraktionsschritt, der an den Bakterienzellen
vor dem Test vorgenommen wird – bei
einem Testsatz zur Durchführung
von Lancefield-Gruppierungstests ist es deshalb wünschenswert,
Reagenzien zum Durchführen
der Extraktion vorzusehen (z. B. Enzympräparate oder Verbindungen für die in
situ-Synthese von salpetriger Säure).
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Bei bestimmten Ausführungsformen
kann der Testsatz vorzugsweise auch einen oder mehrere Stäbe aufweisen,
die mit einem Kontrollreagens versehen sind (das typischerweise
zu einem bekannten Ergebnis führt),
wodurch die Auswertung der Testergebnisse vereinfacht wird. Vorzugsweise
ist das Kontrollreagens eine Positiv-Kontrolle, falls gewünscht, kann jedoch statt des
Positiv-Kontrollstabs oder zusätzlich
zu diesem ein Negativ-Kontrollstab vorgesehen sein. Die Kontrollstäbe sind,
falls sie in dem Testsatz vorhanden sind, deutlich markiert, um
von den Teststäben
unterscheidbar zu sein.
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Bei einem dritten Aspekt der Erfindung
wird ein Verfahren zum Testen des Vorhandenseins eines zu bestimmenden
Stoffs in einer Probenflüssigkeit zur
Verfügung
gestellt, wobei die Probenflüssigkeit von
einer Testfläche
getragen wird, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Die Verwendung
eines Teststabs, der einen Griffabschnitt hat, der von einer den
Test durchführenden
Person zu halten ist, sowie einen Mischabschnitt, der ein getrocknetes,
vorher dosiertes Reagens für
den Test trägt,
so dass der Mischabschnitt des Teststabs in Kontakt mit der Probenflüssigkeit
tritt, um das Testreagens herzustellen, sowie das Bewegen des Mischabschnitts
bezüglich der
Testfläche,
um ein Mischen des erstellten Reagens mit der Probenflüssigkeit
zu verursachen.
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Die Erfindung kann in einem weiten
Bereich von Tests angewandt werden. Beispielartig sei nur genannt,
dass dieser Bereich jeden Test umfasst, der herkömmlicherweise unter Verwendung
des Prinzips der Partikelagglutination durchgeführt wird. Solche Tests werden
routinemäßig durchgeführt, um
infektiöse
Organismen wie H. pylori, Neisseria, Streptokokken, Legionella,
E. coli, Salmonella und Staphylococcus nachzuweisen. Besonders bevorzugt
sind Testsätze
zum Durchführen
der „Lancefield- Gruppierung" von
Streptokokken. Andere Beispiele für Tests, die erfindungsgemäß durchgeführt werden
können,
sind schnelle biochemische Tests auf Oxidase, bei denen Tetramethyl-p-Phenylendiamin-Dihydrochlorid
mit Ascorbinsäure
verwendet wird, um oxidasepositive Organismen, z. B. Neisseria gonorrhoeae,
von oxidasenegativen Organismen (z. B. E. coli) zu unterscheiden,
sowie β-Lactamase-Tests,
bei denen Nitrocefin, ein chromogenes Substrat, zum schnellen Nachweis von
Penicillinase produzierenden Stämmen
eingesetzt wird. In den meisten Fällen werden die Reagenzien
entweder auf einer flachen Karte getrocknet und in Verbindung mit
einer Manipulationsvorrichtung wie einer Öse verwendet. Zusätzliche
Flüssigkeit
wie Wasser, eine Salzlösung
oder Pufferlösung
sind in manchen Fällen
nötig.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnung
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1 zeigt
eine Anordnung von erfindungsgemäßen „Abreiß"-Teststab-Testvorrichtungen.
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2 zeigt
einen der Teststäbe
getrennt von dem Rest der Anordnung, im Gebrauch.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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In 1 umfassen
die Teststäbe 200 eine Seite-an-Seite-Anordnung
von Stäben,
die aus einem Kartenblatt ausgeschnitten oder ausgestanzt sind.
Das Ausschneiden oder Ausstanzen hat ein kleines Netz 201 aus
Kartenmaterial hinterlassen, das jedes benachbarte Paar von Stäben verbindet. Die
Stäbe 200 sind
deshalb deutlich voneinander getrennt, sind aber in der Anordnung
miteinander verbunden und sind leicht von Hand durch Reißen des Restnetzes 201 voneinander
zu trennen. Die Ecken eines Endes 202 jedes Stabs 200 sind
abgeschnitten, so dass dieser eine charakteristische Form hat. Der
Endbereich 207 um das Ende 202 jedes Stabs 200 bildet
den Mischabschnitt, der das Arbeitsende des Stabs im Gebrauch darstellt.
Eine kurze Strecke von dem Ende 202 aufwärts an dem
Stab 200 ist ein Teil-Querschnitt 203 über die
gesamte Breite jedes Stabs angeordnet, wodurch gewährleistet
wird, dass der Mischabschnitt 207 des Stabs leicht aus
der Flucht herausgebogen wird, wenn der Stab nach unten gegen eine
feste Oberfläche
gedrückt
wird, z. B. die Oberfläche
einer Testkarte. Der Bereich 206 bildet den Griffabschnitt
jedes Teststabs 200.
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Jeder Stab 200 ist etwa
40 mm lang und 11 mm breit. Der Griffabschnitt 206 ist
ewa 31 mm lang, der Mischabschnitt ist etwa 11 mm lang.
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Die Oberfläche 204 des Mischabschnitts 202,
die die Unterseite des Mischabschnitts 207 bildet, wenn
der Stab 200 gebogen wird, trägt ein getrocknetes, vorher
dosiertes Testreagens 205. Wie in 1 dargestellt, wird dieses als vier eng
beieinander angeordnete Reagens-Punkte aufgebracht.
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2 zeigt
einen Teststab 200 im Gebrauch. Der Stab 200 steht
in Kontakt mit einer Testkartenoberfläche 101, und der Stab-Mischabschnitt 207 wird aus
der Flucht mit dessen Griffabschnitt 206 heraus gebogen.
Der Stab 200 wird mit schrubbender oder rührender
Bewegung benutzt, um Probenmaterial und Reagenzien innerhalb des
Testbereichs 102, der durch die Linie 103 auf
der Testkarte 101 gebildet wird, zu bewegen.
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Beispiele
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Beispiel 1
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Das Folgende, das nur als Beispiel
angeführt wird,
beschreibt die Herstellung eines Testsatzes gemäß der Erfindung.
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Ein Heliobacter Pylori-Latex-Agglutinationstest
umfasst ein Dry Spot-Latex-Reagens.
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Das Reagens besteht aus 350 nm großen Polystyren-Latex-Partikeln,
beschichtet mit einem löslichen
Extrakt aus H. pylori-Zellen. Dies wird in einem Phosphatpuffer
mit einem pH-Wert von 7,3 präpariert,
der bovines Serumalbumin mit einer Konzentration von 10 mg pro ml
und Saccharose mit einer Konzentration von 80 mg pro ml enthält. Die
Konzentration der Latexpartikel beträgt ungefähr 85 mg pro ml.
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Das Reagens wird auf die Mischabschnittsoberfläche eines
mit Polypropylen überzogenen
Karten-Teststabs in Mengen von 1,25 μl (4 Punkte mit insgesamt 5 μl pro Teststab)
aufgebracht. Dies geschieht unter Verwendung eines Spritzenpumpensystems
und eines X-Y-Koordinatensystems, um eine genaue Positionierung
zu ermöglichen.
Der Stab, der sich daraus ergibt, ist in 1 gezeigt. Die Stäbe sind in Streifenanord nungen
von 10 vorgesehen und sind teilweise miteinander verbunden, um eine
leichte Trennung zu ermöglichen,
wie in 1 dargestellt.
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Der Testsatz umfasst auch Positiv-
und Negativ-Kontrollstäbe.
Humanserum, das nachweislich einen spezifischen Anti-H. pylori-Antikörper (positiv) oder
nachweislich keinen spezifischen Anti-H. pylori-Antikörper (negativ)
enthält,
wird verdünnt,
und Saccharose wird zugefügt,
um eine Konzentration von 80 mg pro ml zu bilden.
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Das Positiv- oder Negativ-Kontrollserum
wird auf die Mischabschnitte entsprechender Positiv- oder Negativ-Kontrollstäbe in Mengen
von 1,25 μl
(4 Punkte, insgesamt 5 μl
pro Stab) aufgebracht. Die Stäbe werden
deutlich als Positiv- oder Negativkontrolle gekennzeichnet, sind
aber ansonsten im Wesentlichen identisch mit den Teststäben.
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Die Kontrollreagenzien können auf
einer Testfläche
hergestellt werden, wobei z. B. destilliertes Wasser oder wässrige Puffer
verwendet werden (z. B. phosphatgepufferte Salzlösung), und dann in der üblichen
Weise mit einem Teststab behandelt werden, als ob es sich um eine
normale Probenflüssigkeit
handelte.
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Die Punkte der Test- und Kontrollreagenzien werden
auf der Kartenoberfläche
getrocknet, wobei eine Kombination aus Warmluft und Infrarotenergie auf
einem sich bewegenden Förderband
verwendet wird. Die Teststabanordnungen werden in feuchtigkeitsundurchlässige, folienbeschichtete
Taschen verpackt.
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Der Testsatz umfasst auch eine Testkarte
bekannter herkömmlicher
Art, auf der der Test vorgenommen wird.
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Beispiel 2
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Lancefield-Streptokokken-Gruppierungs-Testsatz
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Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
wird ein Streptokokken-Gruppierungs-Testsatz
zur Verfügung
gestellt, der zusammen mit salpetriger Säure oder Enzym-Extraktionsverfahren
für eine
schnelle Identifizierung von (3-hämolytischen
Streptokokken der Lancefield-Typen A, B, C, D, F und G verwendet wird.
Eine Differenzierung zwischen den verschiedenen Lancefield-Gruppen
kann wünschenswert
für eine
medizinische Behandlung und/oder für epidemiologische Zwecke sein.
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Der Testsatz umfasst sechs Folientaschen, die
jeweils 6 Anordnungen von 10 Testreagens-Stäben umfassen, im Wesentlichen
wie in 1 gezeigt. Jede
der sechs Taschen umfasst Stäbe
mit Testreagenzien, die spezifisch für eines der sechs Lancefield-Gruppen-Antigene
A, B, C, D, F oder G sind. Das Testreagens weist getrocknete, vorher
dosierte blaue monodisperse Latexpartikel auf, die mit Kaninchen-Antikörper, der
sich gegen das entsprechende Antigen richtet, sensibilisiert sind.
Der Testsatz umfasst damit 60 Teststäbe für jede Lancefield-Gruppe.
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Der Testsatz weist weiterhin auf:
3 Streifen von 10 Stäben,
die mit positivem polyvalenten Kontrollreagens vordosiert sind (getrockneter
Antigen-Extrakt von Streptokokken der Gruppe A, B, C, D, F und G);
weiße
Einweg-Testkarten, die eine Testfläche zum Tragen der Probenflüssigkeit
bilden; ein Kunststoffclip zum Wiederverschließen der Folientaschen, nachdem
diese geöffnet
wurden; sowie eine Gebrauchsanleitung. Wie bei Beispiel 1 sind die
Test- und Kontrollreagenzien in einer Anordnung von vier getrockneten
Tropfen vorgesehen, von denen jeder ursprünglich ein Volumen von 1,25 μl hat.
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Der Testsatz kann wie folgt hergestellt
werden:
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Spezifische hyperimmune Anti-Streptokokken-Antiseren
des Kaninchens werden mit herkömmlichen
Techniken hergestellt. Antiseren der Lancefield-Gruppen A, B, C,
D, F und G werden aus einzelnen Gruppen von Kaninchen hergestellt,
und kleinere auftretende Kreuzreaktionen mit anderen Bakterien werden
herausabsorbiert. Der Antikörper
in den Seren wird durch Ammoniumsulphat-Ausfällung und Dialyse gegen phospatgepufferte
Salzlösung
mit einem pH-Wert von 7,3 teilweise gereinigt.
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Blaue Latexpartikel mit einem Durchmesser von
300 – 400
nm werden in phosphatgepufferter Salzlösung suspendiert, so dass sich
eine 1%ige Konzentration ergibt. Die Temperatur der Partikelsuspension
wird im Wasserbad auf 55°C
erhöht,
und der gereinigte Antikörper
wird zugefügt.
Nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten wird das Gefäß aus dem Wasserbad
entfernt, und die Latex-Suspension wird bei 4000 U/min zentrifugiert,
um die Partikel zu sedimentieren. Das sensibilisierte Latex wird
dann wieder mit 10%iger Konzentration in phosphatgepufferter Salzlösung, die
1% BSA und 6% Saccharose enthält, suspendiert.
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Nach der Filtrierung wird die Suspension
unter Verwendung eines automatisierten mikrodosierenden Spritzensystems
als Vielzahl von Punkten in Mengen von 5 μl pro Test (4 × 1,25 μl-Punkte)
auf Karten oder Stäbe
aufgebracht.
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Die Punkte werden bei einer Temperatur
von 60°C
getrocknet, und wenn sie abgekühlt
sind, werden die Stäbe
in einer feuchtigkeitsundurchlässigen Folientasche
platziert, und ein Silicagel-Beutel wird zugefügt, um Feuchtigkeit zu entfernen,
die bei dem nachfolgenden wiederholten Öffnen der Tasche eindringen
kann.
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Testverfahren
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- 1. Unter Verwendung von bekannten enzymatischen
oder Säure-Extraktionsverfahren
(Maxted 1948 Lancet (ii) 255–256,
Ederer et al., 1972 Appl. Microbiol. 23, 285–288; Lancefield 1938 Proc. Soc.
Exp. Biol. 38, 473–-478) wird ein Antigen-Extrakt
aus einer frischen Kultur des Organismus hergestellt (die vorzugsweise über Nacht
bei 37°C auf
einer Blut-Agar-Platte gezüchtet
wird). Die Reagenzien zum Durchführen
der Antigen-Extraktion sind bei einigen Ausführungsformen in dem Testsatz
enthalten.
- 2. Unter Verwendung einer Pasteur-Pipette wird ein 50 μl-Tropfen
steriler Salzlösung
in einen kleinen Kreis an der Basis eines ovalen, auf der Testkarte
markierten Reaktionsbereiches gegeben.
- 3. Ein Positiv-Kontroll-Stab wird aus der Tasche entnommen,
indem einer von den anderen an dem Streifen abgerissen wird, wobei
darauf zu achten ist, dass eine Berührung des Bereichs, in dem
die getrockneten Reagenzien angeordnet sind, vermieden wird (wenn
mehr als ein Reagens getestet wird, ist die entsprechende Zahl von
Stäben
zu entnehmen).
- 4. Der Stab wird so positioniert, dass die farbigen Reagens-Punkte
unten sind, und der Stab wird auf der Testkarte platziert, wobei
die Punkte mit der Flüssigkeit
in Kontakt treten. Der Stab wird dann nach unten gedrückt, so
dass er sich an dem Scharnier biegt. Der Stab wird kreisförmig 10
Sekunden lang bewegt, um den getrockneten Antigen-Extrakt zu rehydrieren.
- 5. Die erforderliche Anzahl an Testreagens-Stäben wird
aus der Tasche entnommen, indem diese von den anderen an dem Streifen
abgerissen werden, wobei darauf zu achten ist, dass eine Berührung des
Bereichs, in dem Reagens-Punkte angeordnet sind, vermieden wird.
Der Stab wird so positioniert, dass die farbigen Punkte unten sind,
und dann auf der Karte platziert, wobei die Punkte mit der frisch
hergestellten Antigen-Suspension in Kontakt treten. Der Stab wird
dann nach unten gedrückt,
so dass er sich an dem Scharnier biegt, und der Mischabschnitt wird
benutzt, um die Antigen-Suspension zu mischen, bis das getrocknete
Latex-Reagens vollständig
rehydriert und homogen ist.
- 6. Die Karte wird leicht hin- und herbewegt und innerhalb der
Testzeit von einer Minute auf Agglutination geprüft.
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Die Positiv-Kontrolle muss innerhalb
einer Minute Agglutination mit dem getrockneten Testreagens zeigen.
Das Testergebnis ist für
die Probe positiv, wenn innerhalb einer Minute Agglutination mit
einem Gruppierungs-Reagens auftritt, oder wenn ein Gruppierungs-Reagens
eine wesentlich stärkere
Reaktion zeigt als die anderen fünf.
Ein negatives Ergebnis liegt vor, wenn keine Agglutination auftritt
und nach einer Minute eine glatte, gleichmäßige, blaue Suspension bleibt.
Reaktionen, die nach einer Minute auftreten, sind zu ignorieren.
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Dem Fachmann wird klar sein, dass
die Testsätze,
bei denen die erfindungsgemäßen Teststäbe verwendet
werden, anders als oben beschrieben hergestellt werden können, ohne
von der Erfindung abzuweichen. Beispielsweise können die folgenden Parameter
variiert werden, ohne dass die Leistung der Erfindung wesentlich
beeinflusst wird.
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Die Größen der Latexpartikel können von Durchmessern
von 100 bis 900 nm reichen, die Partikel können andere Farben oder sogar
natürliche weiße Farbe
haben.
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Antikörper von anderen Arten wie
Ziegen, Schafen, Pferden etc. oder ein monoklonaler Antikörper können verwendet
werden. Der Antikörper
kann mittels unterschiedlicher Techniken gereinigt werden, z. B.
durch Ionenaustauschchromatographie, Protein-A-Affinitätschromatographie etc..
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Der Sensibilierungspuffer kann einer
von mehreren geeigneten Arten sein, darunter Borat, Glyzin und Tris,
und sein pH-Wert kann zwischen pH 6 und 8,5 variieren, und die Ionenstärke kann
zwischen 0,01 und 1 mol variieren. Die Sensibilierungstemperatur
kann zwischen 4°C
und 60°C
variieren. Bei hohen Temperaturen (z. B. 60°C) kann die Reaktion innerhalb
von 10–15
Minuten das Gleichgewicht erreichen, während es bei niedrigen Temperaturen
(z. B. 4°C)
nötig sein
kann, das Reaktionsgemisch 18–-24 Stunden stehen
zu lassen. Weitere Waschungen können
durchgeführt
werden, um überschüssigen ungebundenen
Antikörper
zu entfernen.
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Die BSA-Konzentration in dem wieder
suspendierten Partikelgemisch kann zwischen 0,05–3% oder mehr variieren. Die
Reagenskonzentration zum Aufbringen der Punkte kann zwischen 1%
und 20% Feststoffe variiert werden. Punktvolumen können variiert
werden, um den Anforderungen an die Konzentration und die Sichtbarkeit
der Reaktion zu entsprechen. Trockungstemperaturen und -zeiten können variiert
werden, um dem Luftstrom und der Verdampfungsgeschwindigkeit zu
entsprechen.