CN107083420A - PML/RARα融合基因检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种PML-RARα融合基因检测试剂盒以及检测方法，该试剂盒包括有针对PML基因L型断裂热点上游基因序列的第一组探针和针对RARα全基因序列的第二组探针；每条探针标记有染料，该两组探针标记的染料的颜色彼此不同；所述两组探针为分别以人外基因组DNA为模板，通过扩增引物得到的扩增产物。本发明所述的探针具有很强的特异性，背景噪音更低，其能达到检测特异性和杂交时长之间的最优平衡，既能保证结果特异性和灵敏度，又能缩短杂交时间，使得检测能在7-8个小时内完成，提高了检测效率。

Description

PML/RARα融合基因检测试剂盒和检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种PML/RARα融合基因检测试剂盒和检测方法。

背景技术

急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)是急性髓细胞白血病的一种特殊类型，被FAB协作组定为急性髓细胞白血病M3型，其特点是骨髓及其他造血组织中有大量白血病细胞无限制地增生，并进入外周血液，而正常血细胞的制造被明显抑制，该病居年轻人恶性疾病中的首位，病因至今仍不完全清楚。95％的APL患者具有t(15；17)染色体异常，形成的PML-RARα融合基因是其分子标志。

位于15q22的PML基因与位于17q21的RARα基因相互易位，形成PML-RARα融合基因。由于PML基因的断裂点不同，而RARα断裂点恒定(2号内含子)，导致可以产生相应的3种不同PML-RARα融合基因的异构体：位于第6内含子的断裂点，形成长型(L型)融合基因，约占病人的55％；位于第3内含子的断裂点，形成短型(S型)融合基因，约占病人的40％；位于第6外显子的断裂点，形成变异型(V型)融合基因，约占病人的5％；其中以长型和短型融合基因为主。PML-RARα融合基因表达的融合蛋白干扰了正常RARα在核内的分布和对细胞分化的调控，使大量细胞阻滞在早幼细胞阶段，在APL发病机制中起重要作用。有研究报道，在复发前的3～6个月PML/RARα融合基因的转录信号显著增强；缓解1年，查PML/RARα融合基因仍可阳性。由此可见，PML/RARα融合基因的预报复发，即使经治者只含少量残留细胞同样可检测到。不同的基因异构体分型的预后有明显不同，S型患者缓解前的死亡率及缓解后的复发率均高于L型。因此，对PML/RARα融合基因进行检测和分型，能更好地指导患者分子靶向治疗及预后判断。

目前，PML-RARα融合基因的检测方法主要包括以下3种：细胞遗传学检测、基于PCR方法的检测和FISH检测。细胞遗传学检测需培养细胞，耗时较长，只能检测中期的细胞，且成功率和灵敏度低；基于PCR的检测如RT-PCR、Q-PCR等易污染，假阳性率高，只能检测已知的断裂点，对未知或含少量转录本的PML-RARα融合基因无法检出。FISH检测对病人外周血或骨髓的PML-RARα融合基因具有极高的灵敏度和检测隐匿型易位的能力，其假阳性率远远低于PCR检测，能提供相对于核型分析更为可靠的分子遗传学证据，可用于预后判断、用药疗效、微小病灶残留及移植术后效果的监测。虽然。目前FISH检测方法得到了广泛的应用和改良，但仍具有以下缺陷：(1)以BAC为模板制备的探针中存在较多的重复序列，影响杂交的特异性，同时造成较高的背景荧光；(2)检测步骤繁杂，探针序列过长，探针与样本杂交往往需要12-16h才能保证充分杂交，费时费力；(3)一些优化的探针序列过短，导致检测特异性降低且信号微弱难以被检测；(4)由于断裂点之间距离较近，现有的FISH产品不能对PML-RARα融合基因进行分型。因此，急需一种FISH检测方法，其探针不含重复序列、长度适宜，既能保证杂交反应的特异性和最佳的荧光检测强度，又能最大限度缩短FISH检测时长，提高检测特异性和检测效率，同时可区分PML-RARα融合基因类型。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高和检测效率高的PML-RARα融合基因检测试剂盒。

实现上述目的的技术方案如下。

一种PML-RARα融合基因检测试剂盒，包括有针对PML基因L型断裂热点上游基因序列的第一组探针和针对RARα全基因序列的第二组探针；两组探针标记有染料，同一组探针的染料颜色相同，不同组探针的染料颜色不同；所述两组探针为分别以人基因组DNA为模板，通过扩增引物得到的扩增产物；

针对所述第一组探针的扩增引物为：选自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQID NO.15和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25和SEQ IDNO.26、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30中的至少一对；

针对所述第二组探针的扩增引物为：选自SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32、SEQ IDNO.33和SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38、SEQID NO.39和SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49和SEQ IDNO.50、SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55和SEQID NO.56、SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60中的至少一对。

在其中一个实施例中，得到的扩增产物的大小为100-500bp。

在其中一个实施例中，针对所述第一组探针的扩增引物选自上述引物对中的至少三对，针对所述第二组探针的扩增引物选自上述引物对中的至少三对。

在其中一个实施例中，针对所述第一组探针的扩增引物选自上述引物对中的至少六对，针对所述第二组探针的扩增引物选自上述引物对中的至少六对。

在其中一个实施例中，所述荧光染料选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750，且针对不同探针组的荧光染料互不相同。

本发明的另一目的，在于提供一种PML-RARα融合基因检测方法。

实现上述目的的技术方案如下。

一种PML-RARα融合基因检测方法，包括以下步骤：

(1)待测样本预处理和制片；

(2)使用上述PML-RARα融合基因检测试剂盒进行杂交检测；

(3)在荧光显微镜下观察荧光信号，对不同荧光信号进行观察和计数。

在其中一个实施例中，使用上述PML-RARα融合基因检测试剂盒进行杂交检测，包括以下步骤：

(2.1)探针平衡至室温；准备好具有杂交区域的切片样本；

(2.2)预变性：将切片依次置于70％、85％、100％乙醇中脱水；烘干；

(2.3)杂交：在切片样本的杂交区域加入探针溶液，进行杂交反应；

(2.4)洗涤；

(2.5)DAPI复染。

在其中一个实施例中，步骤(2.3)中杂交反应条件为，42±1℃杂交4±0.5h。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明FISH探针的长度是发明人经过大量实验，对实验结果进行比对和统计分析后得出的最优长度，能达到检测特异性和杂交时长之间的最优平衡，既能保证结果特异性和灵敏度，又能缩短杂交时间，使得检测能在7-8个小时内完成，提高了检测效率。

(2)常规的FISH探针标记方法不能实现荧光信号的放大，因此需要较长的探针才能保证检测的灵敏度，从而导致杂交时间过长。本发明采用新的探针标记方法，能将探针上的荧光信号进行放大，大大提高检测灵敏度。本发明通过信号放大的探针标记方法与探针长度的优化，极大缩短了探针与目的基因充分杂交所需时长，提高了检测灵敏度和检测效率。

(3)由于PML基因S和L型断裂点之间距离较近，常规的FISH探针不能有效区分两种断裂类型。本发明通过FISH探针的设计和新型探针标记方法，具有很强的特异性，背景噪音低，大大提高了FISH探针的分辨率，实现了S和L型PML-RARα融合基因的分型检测。

附图说明

图1是本发明信号计数指南-典型阳性细胞信号模式；

图2是本发明信号计数指南-典型阴性细胞信号模式。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1试剂盒组成

本实施例所述的PML-RARα融合基因检测试剂盒，主要包括有：

一、荧光染料标记的探针

所述探针包括有针对PML基因L型断裂热点上游基因序列的第一组探针和针对RARα全基因序列的第二组探针。所述探针以人外周血细胞DNA为模板，利用30对特异性引物对进行PCR扩增反应而得到，其制备方法如下：

1、扩增引物的设计

位于15q22的PML基因与位于17q21的RARα基因相互易位，形成PML-RARα融合基因。由于PML基因的断裂点不同，而RARα断裂点恒定(2号内含子)，导致可以产生不同的PML-RARα融合基因异构体L型融合基因、S型融合基因和V型融合基因，其中以L型和S型融合基因为主。为了检测PML-RARα融合基因，同时区分两种主要的融合类型，分别设计了2组扩增引物：针对PML基因L型断裂热点上游基因序列的第一组扩增引物和针对RARα全基因序列的第二组扩增引物。所述扩增引物组的扩增区域分别为PML和RARα基因目标检测区域中非重复且高度保守的片段，片段长度大于1000bp，扩增引物相应的扩增产物长度在100-500bp之间，分别构成了第一组和第二组探针库。扩增引物序列信息及其相应的扩增产物见表1(注：1F/1R为一对引物，分别表示正向引物和反向引物；其他以此类推)。

表1扩增引物及扩增产物

引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，合成后的每条序列分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液，并做好标记。

2、探针库构建

利用上述设计的引物对，以人类基因组DNA为模板进行PCR扩增，相应的扩增产物分别构成了第一组和第二组探针库。

(1)人基因组DNA提取：根据本领域现有技术，可参考《分子克隆实验指导-第三版》(科学出版社)或按照市售人基因组DNA提取试剂盒产品说明书进行操作。

(2)配置PCR引物工作液：针对第一组探针库，将相应的扩增引物(1F/1R-15F/15R)分为3个扩增引物组，对PML基因L型断裂热点上游基因的3个非重复且高度保守区域进展扩增：分别取相应的扩增引物(1F/1R-5F/5R、6F/6R-10F/10R、11F/11R-15F/15R)储存液50ul置于3支1.5ml离心管中，使用10mmol/L Tris Buffer配制成终浓度各为10pmol/mL的3支扩增引物工作液，相应做好标记；针对第二组探针库，将相应的扩增引物(16F/16R-30F/30R)分为3个扩增引物组，对RARα全基因的3个非重复且高度保守区域进行扩增：分别取相应的扩增引物(16F/16R-20F/20R、21F/21R-25F/25R、26F/26R-30F/30R)储存液50ul置于3支1.5ml离心管中，使用10mmol/L Tris Buffer配制成终浓度各为10pmol/mL的3支扩增引物工作液，相应做好标记。

(3)配置PCR扩增体系：分别进行上述6个体系的扩增，扩增体系试剂组成如下：

试剂	每反应(μL)
		10×缓冲液(含Mg2+)	5
10×dNTP Mix(含Biotin-dUTP)	5
		Taq DNA聚合酶	2
PCR引物工作液	10
		DNA(10ng/μl)	1
灭菌双蒸水	27
		总体积	50

(4)PCR扩增：配置好体系后轻轻混合均匀，瞬时离心5-10s，按如下程序进行扩增：95℃5min，95℃30s，58℃30s，72℃30s，从第二步开始30个循环，72℃5min，4℃保持。

(5)产物鉴定和纯化：将针对PML基因L型断裂热点上游之间基因的3个非重复且高度保守区域的扩增产物混合均匀，得到第一组探针库；将针对RARα全基因3个非重复且高度保守区域的扩增产物混合均匀，得到第二组探针库。通过2％琼脂糖凝胶电泳对两组探针库进行鉴定，切割大小在100-500bp之间的产物，并对产物进行回收，即得到第一组和第二组探针库，相应做好标记。

3、染料标记探针

本实施例优选Cy3(红色荧光)标记第一组探针，优选Alexa Fluor 488(绿色荧光)标记第二组探针。人工合成Cy3标记和Alexa Fluor 488标记的polyA序列，所述polyA序列包含1-30个碱基，优选的是包含10-20个碱基，更优选的是包含2-8个碱基，polyA序列末端修饰有链霉亲和素。将Cy3标记和Alexa Fluor 488标记的polyA序列分别与修饰有生物素的第一组和第二组探针库混合(每100ug探针库加入20uL荧光标记的polyA序列)，于37℃缓慢摇动孵育30min，得到相应荧光标记的探针。探针经纯化和沉淀，溶解在TE缓冲液中，即获得红色标记的第一组探针和绿色标记的第二组探针，将探针于-20℃避光保存。

二、试剂盒其他组分

1、SSC缓冲贮存液(20×SSC，pH5.3)：氯化钠88g、柠檬酸钠44g、超纯水400mL，充分溶解混匀，室温下将溶液pH值调至5.3，用超纯水将溶液定容至500mL，0.45μm滤器过滤。

2、乙醇溶液(70％和85％)：无水乙醇700mL/850mL、超纯水300mL/150mL，充分混匀。

3、洗涤缓冲液Ⅰ：20×SSC(pH5.3)35mL、乙基苯基聚乙二醇(NP-40)3mL、超纯水912mL，充分混匀，室温下将溶液pH值调至7.0，用超纯水将溶液定容至1000mL，0.45μm滤器过滤。

4、洗涤缓冲液Ⅱ：20×SSC(pH5.3)100mL、乙基苯基聚乙二醇(NP-40)1mL、超纯水849mL，充分混匀，室温下将溶液pH值调至7.0，用超纯水将溶液定容至1000mL，0.45μm滤器过滤。

实施例2利用实施例1试剂盒对临床样品进行检测

一、样本预处理

1、用肝素钠抗凝管采集患者外周血1-1.5ml，2000rpm离心5min；

2、弃上清，加入5-10ml 0.075M的KCl溶液，吹打均匀，37℃低渗处理30min；

3、加入1ml新鲜固定液(甲醇/冰醋酸3:1)，吹打均匀，静置5min；

4、2000rpm离心5min，弃上清；

5、加入10ml新鲜固定液(甲醇/冰醋酸3:1)，吹打均匀，静置10min；

6、2000rpm离心5min，弃上清；

7、加入10ml新鲜固定液(甲醇/冰醋酸3:1)，吹打均匀，2000rpm离心5min，弃上清；

8、重复步骤7两次，最后加10ul新鲜固定液(甲醇/冰醋酸3:1)重悬细胞；

9、将制备好的细胞悬液滴加到玻片上。

二、FISH检测

FISH检测主要包括预变性、变性、杂交和复染四个步骤，从杂交开始的操作步骤均需要在避光条件下进行：

1、准备工作：探针平衡至室温，涡旋混匀后置于微量离心机中离心2-3s；开启并预热杂交仪，将湿条浸入蒸馏水中备用(至少浸泡2h)，杂交时放入杂交仪；使用玻璃刀在切片反面圈出样本杂交区域。

2、预变性：将玻片在室温2×SSC液中浸泡2min，随后将玻片依次置于70％、85％、100％乙醇中脱水各2min。置于烤片机上2-5min烘干。

3、杂交(避光操作)：在玻片样本杂交区域加入10ul探针溶液(探针浓度15ng/ul，每一标准人份探针量，对应检测的样本面积约为20mm×20mm，样本区域较大的样本可根据实际情况增加用量)，盖上盖玻片，确保盖玻片下无气泡、探针均匀分布。使用封片胶覆盖盖玻片四周位置，形成闭合的密封圈。将切片放入已安装好湿条的杂交仪中，设置杂交反应程序：85℃变性8min，42℃杂交4h。

4、杂交后洗涤(避光操作)：开启水浴锅(76±1℃)，将洗涤缓冲液Ⅱ置于水浴锅预热。将杂交后的切片从杂交仪中取出，去除封片胶，置于室温的洗涤缓冲液Ⅰ中5min，洗掉盖玻片，再置于76±1℃的洗涤缓冲液Ⅱ中5min，期间可轻轻晃动切片1-3s；重复上述洗涤步骤1次，最后用洗涤冲液Ⅰ再重复洗涤一次，每种洗涤缓冲液重复洗涤时的时间与第一次用该缓冲液洗涤时时间相同。洗涤后将切片直立风干。

5、DAPI复染(避光操作)：在样本杂交区域加入10μL复染液，盖上盖玻片，室温避光5-10min后即可显微镜下观察荧光信号。DAPI复染后的切片也可置于-25℃至-18℃避光保存(保存时间不超过72h)，需要检测时将玻片放至室温后进行观察。

三、结果判定标准

本发明试剂盒结果判定标准如下：

1、每例样本计数100个细胞，若阳性细胞数小于3个(3/100或＜3％)，该样本判定为阴性。

2、每例样本计数100个细胞，若阳性细胞数大于5个(5/100或＞5％)，该样本判定为阳性。

3、每例样本计数100个细胞，若阳性细胞数介于3-5个(3-5％)，需另一阅片人另外计数100个细胞。汇总两位阅片人计数细胞数与阳性细胞数，即总计200个细胞中，若阳性细胞总数小于8个(＜4％)，该样本判定为阴性，若阳性细胞总数大于等于8个(≥4％)，该样本判定为阳性。

细胞的阳性与阴性判定：

上下移动显微镜视野，查找所有存在于细胞核内的信号。

1、以下信号模式可判定为PML-RARα融合基因阳性细胞(详见图1)：

(1)S型融合细胞：间期核中出现的是1个红色、1绿色和2个红绿杂交信号(1R1G2F)；

(2)L型融合细胞：间期核中出现的是1个红色、2个绿色和1个红绿杂交信号(1R2G1F)。

2、以下信号模式可判定为PML-RARα融合基因阴性细胞(详见图2)：间期核中出现的是2个红色和2个绿色随机分散的4个杂交信号(2R2G)。

注：附图中黑色代表红色的，白色代表绿色点。

四、检测结果分析

利用实施例1试剂盒对15例急性早幼粒细胞白血病患者外周血样本(编号1-15)进行检测，同时选用NB4细胞株作为阳性对照、K562细胞株作为阴性对照，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取约2000个NB4和K562细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为5份，编号16-20和21-25。具体检测结果如表3：

表3样本检测结果

由上述检测结果可知，本发明试剂盒对PML-RARα融合基因的检测具有很好的灵敏度和特异性，能实现急性早幼粒细胞白血病患者外周血样本的检测和断裂位点分型，同时所有的NB4细胞均为PML-RARα融合基因阳性，而所有的K562细胞均为PML-RARα融合基因阴性。说明本试剂盒设计的探针能特异性地与目标基因序列发生杂交反应，产生的荧光信号强并且稳定，保证了检测结果的特异性和准确性。

实施例3杂交时长对试剂盒检测效果的影响

一、杂交时长

本发明试剂盒探针长度和染料标记方法的设计是发明人经过大量实验，对实验结果进行比对和统计分析后得出的最优方案，能达到检测特异性和杂交时长之间的最优平衡，既能保证结果特异性和灵敏度，又能缩短杂交时间，提高检测效率。

为验证杂交时长对本发明检测结果的影响，本实施例设置了不同杂交时长的4个实验组，具体见表4，所用检测探针和试剂与实施例1试剂盒一致。

表4杂交时长

分组	实验组1	实验组2	实验组3	实验组4
					杂交时间	2h	4h	8h	16h

二、样本检测

采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对急性早幼粒细胞白血病患者外周血样本26-40进行检测，其中各实验组杂交时间与表4杂交时间一致，具体实验结果如下：

表5杂交时长对检测结果的影响

对比4个实验组的检测结果可知，本发明试剂盒设计的探针在4h内即可与样本目标基因充分杂交，实现样本的检测并保证结果的特异性和准确性。2h的杂交时长由于探针不能与样本充分杂交，而导致一些阳性细胞漏检，造成假阴性结果，且检测结果不稳定；而8h和16h的杂交时长检测结果与4h完全一致，且荧光信号强度基本一致。说明本发明探针长度和染料标记方式能显著减短探针与目标基因的杂交时间，提高检测效果，同时保证检测的特异性和准确性。

实施例4探针长度对试剂盒检测效果的影响

一、探针长度

本发明试剂盒探针长度和染料标记方法的设计是发明人经过大量实验，对实验结果进行比对和统计分析后得出的最优方案，能达到检测特异性和杂交时长之间的最优平衡，既能保证结果特异性和灵敏度，又能缩短杂交时间，提高检测效率。

为验证探针长度对本发明检测结果的影响，本实施例设置了不同探针长度的4个实验组，具体见表6，4个实验组扩增区域位置相同。所用检测探针制备方法和试剂与实施例1试剂盒一致。

表6探针长度

分组	实验组5	实验组6	实验组7	实验组8
					探针长度	20-100bp	100-500bp	500-1000bp	＞1000bp

二、样本检测

采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对急性早幼粒细胞白血病患者外周血样本41-55进行检测，具体实验结果如下：

表7探针长度对检测结果的影响

对比4个实验组的检测结果可知，实验组6使用100-500bp的探针，在4h内即可与样本目标基因充分杂交，实现样本的检测并保证结果的特异性和准确性。探针长度过短(实验组5)，会降低检测特异性，造成较高的背景噪音，同时产生的荧光信号很弱，造成结果的误判；探针长度过长(实验组7和8)会降低细胞对探针的摄取能力，同时延长杂交所需要的时间，导致在4h探针不能与目标基因充分杂交，影响检测结果的准确性和稳定性。

实施例5构建探针库引物对种类和数量对试剂盒检测效果的影响

一、引物对的选择

本发明试剂盒针对PML-RARα融合基因的检测和分型设计了二组探针库，每组探针库分别由15对引物扩增得到，扩增区域分别为PML和RARα基因目标检测区域中非重复且高度保守的片段，本发明针对PML和RARα基因分别优选了基因中非重复且高度保守的3个扩增区域，针对每个区域设计了5对特异性基因。

为检测构建探针库所使用的引物对种类和数量对本发明检测结果的影响，本实施例以第一组探针的构建为例，设置了3个实验组，具体见表8，所用检测探针制备方法和试剂与实施例1试剂盒一致，第二组探针使用全部的扩增引物进行建库。

表8引物对的选择

二、样本检测

采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对急性早幼粒细胞白血病患者外周血样本56-70进行检测，具体实验结果如下：

表9构建探针库引物对种类和数量对检测结果的影响

比较上述3个实验组的检测结果可知，当目标基因每个扩增区域选用1对、2对和5对扩增引物，即第一组探针库使用3对、6对和15对引物进行探针库构建时，均可完成检测。当使用6对或以上引物对进行建库时，其特异性和稳定性都很好。其中，当使用全部15条的建库引物对时，信号更强更稳定，检测效果最佳。其他针对第一组和第二组探针库建库引物对种类和数量的选择实验结果上述一致，具体数据省略。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种PML-RARα融合基因检测试剂盒，其特征在于，包括有针对PML基因L型断裂热点上游基因序列的第一组探针和针对RARα全基因序列的第二组探针；两组探针标记有染料，同一组探针的染料颜色相同，不同组探针的染料颜色不同；所述两组探针为分别以人基因组DNA为模板，通过扩增引物得到的扩增产物；

针对所述第一组探针的扩增引物为：选自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20、SEQID NO.21和SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30中的至少一对；

针对所述第二组探针的扩增引物为：选自SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32、SEQ IDNO.33和SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38、SEQID NO.39和SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49和SEQ IDNO.50、SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55和SEQID NO.56、SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60中的至少一对。

2.根据权利要求1所述的PML-RARα融合基因检测试剂盒，其特征在于，扩增产物的大小为100-500bp。

3.根据权利要求1所述的PML-RARα融合基因检测试剂盒，其特征在于，针对所述第一组探针的扩增引物选自权利要求1中相应所述扩增引物中的至少三对，针对所述第二组探针的扩增引物选自权利要求1中相应所述扩增引物对中的至少三对。

4.根据权利要求3所述的PML-RARα融合基因检测试剂盒，其特征在于，针对所述第一组探针的扩增引物选自权利要求1中相应所述扩增引物中的至少六对，针对所述第二组探针的扩增引物选自权利要求1中相应所述扩增引物中的至少六对。

5.根据权利要求4所述的PML-RARα融合基因检测试剂盒，其特征在于，针对所述第一组探针的扩增引物为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16、SEQID NO.17和SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27和SEQ IDNO.28、和SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30；

针对所述第二组探针的扩增引物为：SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38、SEQ IDNO.39和SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44、SEQID NO.45和SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55和SEQ IDNO.56、SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58、和SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60。

6.根据权利要求1-5任一项所述的PML-RARα融合基因检测试剂盒，其特征在于，所述荧光染料选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750，且针对不同探针组的荧光染料互不相同。

7.一种PML-RARα融合基因检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)待测样本预处理和制片；

(2)使用权利要求1-6任一项所述PML-RARα融合基因检测试剂盒进行杂交检测；

(3)在荧光显微镜下观察荧光信号，对不同荧光信号进行观察和计数。

8.权利要求7所述的PML-RARα融合基因检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述杂交检测，包括以下步骤：

(2.1)探针平衡至室温；准备好具有杂交区域的切片样本；

(2.2)预变性：将切片依次置于70％、85％、100％乙醇中脱水；烘干；

(2.3)杂交：在切片样本的杂交区域加入探针溶液，进行杂交反应；

(2.4)洗涤；

(2.5)DAPI复染。

9.权利要求8所述的PML-RARα融合基因检测方法，其特征在于，步骤(2.3)中杂交反应条件为，42±1℃杂交4±0.5h。