CN107419001A - Brca1、pten基因异常检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Brca1、pten基因异常检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种BRCA1、PTEN基因异常检测试剂盒以及检测方法，该试剂盒包括针对BRCA1基因的第一组和第二组探针，和/或针对PTEN基因的第三组和第四组探针；所述每组探针标记有荧光染料，同一组内的探针的荧光染料颜色相同，不同组的探针的荧光染料颜色不同；该四组探针为分别以相应BAC克隆为模板，通过扩增引物得到的扩增产物。本发明FISH探针是发明人经过反复比对挑选后利用最优的BAC克隆为模板，针对非重复且高度保守的序列设计引物扩增制备得到的，具有很强的特异性，背景噪音更低。本发明所述试剂盒能达到检测特异性和杂交时长之间的最优平衡，既能保证结果特异性和灵敏度，又能缩短杂交时间，提高了检测效率。

Description

BRCA1、PTEN基因异常检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种BRCA1、PTEN基因异常检测试剂盒及检测方法。
背景技术
BRCA1(BREAST CANCER1)基因定位于17q21，约81kb，共有23个外显子。BRCA1编码蛋白的N末端序列含有一环状结构域(ringdomain)，能够与BRCA1相关环状蛋白组成环2环异二聚体。BRCA1的N末端不仅与RNA合成酶相联系，还与S期和核点(nucleardot)形成有密切关系。去除BRCA1的N末端将会导致近98％的BRCA1失去与RNA合成酶的联系，因此认为BRCA1的N末端在调节RNA合成酶功能方面起着重要作用。
PTEN基因(gene ofphosphate and tension homology deleted on chromsometen，PTEN)定位于染色体10q23.3，由9个外显子组成，编码由403个氨基酸组成的蛋白质，具有磷酸酯酶的活性。PTEN蛋白可通过拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性而抑制肿瘤的发生发展。目前的研究已经发现，PTEN基因异常可存在于前列腺癌、胶质母细胞瘤、子宫内膜癌、肾癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、甲状腺癌、头颈部鳞状细胞癌、黑色素瘤、淋巴瘤等多种肿瘤中。
循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)是因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落，进入外周血中的各类肿瘤细胞的统称。目前认为，肿瘤微转移灶起源于侵入血液循环中的肿瘤细胞，因此，循环肿瘤细胞可能是肿瘤远处转移的一种标志。研究发现，在前列腺患者外周血液中的CTC出现BRCA1基因缺失，可能预示着前列腺癌的复发和转移；CTC中PTEN的缺失有望成为前列腺癌CTC分子标记物。因此对来自患者外周循环血液的CTCs进行BRCA1、PTEN基因异常的并行检测具有显著的临床意义，能帮助医生制定最适合每位患者的治疗方案，同时进行疗效检测和预后评估。
荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)是在原有的放射性原位杂交技术基础上发展起来分子细胞遗传学技术。其基本原理是通过荧光标记的DNA探针与待测样本的DNA进行原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，从而对染色体和基因异常的细胞、组织样本进行检测和诊断。FISH技术操作简便，检测快速，结果直观易于观察；具有有效的灵敏度和特异性，能检测到一些常规遗传学分析不能发现基因的变异，而且重复性好。因此，FISH基因已广泛应用于基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学研究等。但是，现有的BRCA1、PTEN基因异常检测FISH探针长度较大，导致检测过程中杂交时间基本都需要12-16小时，且市面上并没有针对两种基因的并行检测FISH试剂盒，故要获得患者，尤其是前列腺癌患者两种基因的异常情况需进行两次FISH检测，大大增加了检测和等待结果的时间。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种BRCA1、PTEN基因异常检测试剂盒，该检测试剂盒可用于高特异性和高准确性检测临床样品中BRCA1和/或PTEN基因异常的情况。
实现上述目的的技术方案如下：
一种BRCA1、PTEN基因异常检测试剂盒，包括有针对BRCA1基因的第一组与第二组探针，和/或针对PTEN基因的第三组与第四组探针；其中所述第一组、第二组探针分别特异性针对BRCA1基因和人类17号染色体着丝粒区域；所述第三、第四组探针分别针对PTEN基因和人类10号染色体着丝粒区域；所述每组探针标记有荧光染料，同一组内的探针的荧光染料颜色相同，不同组的探针的荧光染料颜色不同；所述四组探针为分别以相应BAC克隆为模板，通过扩增引物得到的扩增产物；
针对所述第一组探针的扩增引物为：选自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQID NO.15和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20中的至少一对。
针对所述第二组探针的扩增引物为：选自SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22、SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28、SEQID NO.29和SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39和SEQ IDNO.40中的至少一对。
针对所述第三组探针的扩增引物为：选自SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42、SEQ IDNO.43和SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48、SEQID NO.49和SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59和SEQ IDNO.60中的至少一对。
针对所述第四组探针的扩增引物为：选自SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62、SEQ IDNO.63和SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68、SEQID NO.69和SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73和SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75和SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77和SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79和SEQ IDNO.80中的至少一对。
在其中一个实施例中，得到的扩增产物的大小为200-400bp。
在其中一个实施例中，针对所述第一组探针的扩增引物选自上述相应引物对中的至少三对，针对所述第二组探针的扩增引物选自上述相应引物对中的至少三对，针对所述第三组探针的扩增引物选自上述相应引物对中的至少三对，针对所述第四组探针的扩增引物选自上述相应引物对中的至少三对。
在其中一个实施例中，针对所述第一组探针的扩增引物选自上述相应引物对中的至少五对，针对所述第二组探针的扩增引物选自上述相应引物对中的至少五对，针对所述第三组探针的扩增引物选自上述相应引物对中的至少五对，针对所述第四组探针的扩增引物选自上述相应引物对中的至少五对。
在其中一个实施例中，所述荧光染料选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、DEAC、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750，且针对不同探针组的荧光染料互不相同。
本发明的另一目的是提供一种BRCA1、PTEN基因异常检测方法。
实现上述目的的技术方案如下：
一种BRCA1、PTEN基因异常检测方法，包括
(1)待检测样品预处理；
(2)利用上述BRCA1、PTEN基因异常检测试剂盒进行杂交检测；
(3)复染后在显微镜下观察荧光信号。
在其中一个实施例中，使用上述BRCA1、PTEN基因异常检测试剂盒进行杂交检测，包括以下步骤：
(2.1)探针平衡至室温，制备探针溶液；准备好具有杂交区域的切片样本；
(2.2)预变性：将切片依次置于70％、85％、100％乙醇中脱水；烘干；
(2.3)杂交：在切片样本的杂交区域加入探针溶液，进行杂交反应；
(2.4)洗涤；
(2.5)DAPI复染。
在其中一个实施例中，步骤(2.3)中杂交反应条件为，42±1℃杂交4±0.5h。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明FISH探针是发明人经过反复比对挑选后利用最优的BAC克隆为模板，针对非重复且高度保守的序列设计引物扩增制备得到的，具有很强的特异性，背景噪音更低。
(2)本发明FISH探针的长度是发明人经过大量实验，对实验结果进行比对和统计分析后得出的最优长度，能达到检测特异性和杂交时长之间的最优平衡，既能保证结果特异性和灵敏度，又能缩短杂交时间，使得检测能在7-8个小时内完成，提高了检测效率。
(3)常规的FISH探针标记方法不能是实现荧光信号的放大，因此需要较长的探针才能保证检测的灵敏度，从而导致杂交时间过长。本发明采用新的探针标记方法，能将探针上的荧光信号进行放大，大大提高检测灵敏度。本发明通过信号放大的探针标记方法与探针长度的优化，极大缩短了探针与目的基因充分杂交所需时长，提高了检测灵敏度和检测效率。
(4)本发明所提供的循环肿瘤细胞BRCA1、PTEN基因异常检测试剂盒可用于检测BRCA1、PTEN基因异常的并行检测，通过一次FISH检测即可同时获得两种基因的检测结果。由于BRCA1、PTEN基因异常情况对前列腺癌患者个体化治疗方案制定、疗效及预后评估非常重要，因此，非常适用于前列腺癌患者临床样品的检测。此外，本发明试剂盒两种基因的检测探针之间不存在非特异性结合、反应特性互不干扰，可根据不同种类的癌症样品及实际需要，，单独实现一种基因的异常检测，也可联合使用，同时实现两者的并行检测。
(5)本发明所述试剂盒的操作简单、安全，同时减少了Cot-1DNA试剂、罗丹明抗-地高辛抗体等昂贵试剂的使用，经济高效，非常适用于临床样品检测。
附图说明
图1是本发明试剂盒BRCA1、PTEN基因缺失信号计数目标细胞选择标准；
图2是本发明试剂盒BRCA1、PTEN基因缺失信号点计数标准。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合附图、实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的保护范围不局限于下面的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1 一种BRCA1、PTEN基因异常检测试剂盒
本实施例所述的BRCA1、PTEN基因异常检测试剂盒，主要包括有：
一、设计扩增引物
分别针对BRCA1基因和人类17号染色体着丝粒区域设计第一、第二组扩增引物，其中第一组为针对BRCA1基因的扩增引物，第二组为针对人类17号染色体着丝粒区域的扩增引物，相应的扩增产物分别组成了第一组探针库和第二组探针库；分别针对PTEN基因和人类10号染色体着丝粒区域设计第三、第四组扩增引物，其中第三组为针对PTEN基因的扩增引物，第四组为针对人类10号染色体着丝粒区域的扩增引物，相应的扩增产物分别组成了第三组探针库和第四组探针库。每组扩增引物得到的扩增产物能作为检测循环肿瘤细胞BRCA1、PTEN基因异常的FISH探针，不含有重复序列，能够避免交叉反应，与染色体中BRCA1、PTEN基因目标检测片段进行特异性识别杂交。
人工合成如下引物，扩增引物及其相应的扩增产物大小具体见表1(注：1F/1R为一对引物，分别表示正向引物和反向引物；其他以此类推)。引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，合成后的每条扩增引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液，并做好标记。
表1扩增引物及扩增产物
二、探针库的构建
本实施例选用的构建探针BAC克隆以及探针相应荧光染料信息如表2所示：
表2探针相关信息
利用表1中设计的引物对，以表2中BAC克隆DNA为模板进行PCR扩增，相应的扩增产物分别构成了第一组、第二组、第三组和第四组探针库。
1、BAC克隆DNA提取：根据本领域内的文献所描述的技术和条件，如参考《分子克隆实验指导·第三版》(科学出版社)或者按照市售的基因组DNA提取试剂盒产品说明书进行。
2、配制PCR引物工作液：针对第一组探针库，将相应的扩增引物(1F/1R-10F/10R)储存液50ul置于1支1.5ml离心管中，使用10mmol/L Tris Buffer配制成终浓度各为10pmol/mL的扩增引物工作液，相应做好标记；针对第二组探针库，将相应的扩增引物(11F/11R-20F/20R)储存液50ul置于1支1.5ml离心管中，使用10mmol/L Tris Buffer配制成终浓度各为10pmol/mL的扩增引物工作液，相应做好标记；针对第三组探针库，将相应的扩增引物(21F/21R-30F/30R)储存液50ul置于1支1.5ml离心管中，使用10mmol/L Tris Buffer配制成终浓度各为10pmol/mL的扩增引物工作液，相应做好标记；针对第四组探针库，将相应的扩增引物(31F/31R-40F/40R)储存液50ul置于1支1.5ml离心管中，使用10mmol/L TrisBuffer配制成终浓度各为10pmol/mL的扩增引物工作液，相应做好标记。
3、配置PCR反应体系：分别进行上述4个体系的扩增，扩增体系试剂组成如下：
试剂 每反应(μL)
10×缓冲液(含Mg2+) 5
10×dNTP Mix(含Biotin-dUTP) 5
Taq DNA聚合酶 2
PCR引物工作液 10
DNA(10ng/μl) 1
灭菌双蒸水 27
总体积 50
4、配置好体系后轻轻混合均匀，瞬时离心5-10s，按如下程序进行扩增：95℃3min；94℃20s，58℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min；4℃保存备用。
5、产物鉴定和纯化：通过2％琼脂糖凝胶电泳对上述四组探针库进行鉴定，切割大小在200-400bp之间的产物，并对产物进行回收，即得到第一组、第二组、第三组和第四组探针库，相应做好标记。
三、FISH探针标记
本实施例优选Cy3(红色荧光)标记第一组探针，优选Alexa Fluor 488(绿色荧光)标记第二组探针，优选DEAC(浅蓝色荧光)标记第三组探针，优选Alexa Fluor 750(白色荧光)标记第四组探针。人工合成Cy3标记、Alexa Fluor 488标记、DEAC标记和Alexa Fluor750标记的polyA序列，所述polyA序列包含1-30个碱基，优选的是包含10-20个碱基，更优选的是包含2-8个碱基，本实施例所用的polyA序列包含8个碱基，polyA序列末端修饰有链霉亲和素。将Cy3标记、Alexa Fluor 488标记、DEAC标记和Alexa Fluor 750标记的polyA序列分别与修饰有生物素的第一组、第二组、第三组和第四组探针库混合(每100ug探针库加入20uL荧光标记的polyA序列)，于37℃缓慢摇动孵育30min，得到相应荧光标记的探针。探针经纯化和沉淀，溶解在TE缓冲液中，即获得红色标记的第一组探针、绿色标记的第二组探针、浅蓝色标记的第三组探针和白色标记的第四组探针，将探针于-20℃避光保存。四、试剂盒的其它组分
1、SSC缓冲贮存液(20×SSC，pH5.3)的配制方法如下：
2、消化酶工作液的配制方法如下：
名称 用量 方法
消化酶 0.1mL 充分混匀
PBS 3.9mL
3、乙醇溶液(70％和85％)的配制方法如下：
4、洗涤缓冲液Ⅰ的配制方法如下：
5、洗涤缓冲液Ⅱ的配制方法如下：
实施例2 使用实施例1中的BRCA1、PTEN基因异常检测试剂盒对前列腺癌患者临床样品的检测
本实施例以检测前列腺癌患者循环肿瘤细胞中BRCA1、PTEN基因异常情况为例，利用实施例1中的BRCA1、PTEN基因异常检测试剂盒对20例前列腺癌患者外周血样品进行检查，步骤如下：
一、样本预处理：
1、循环肿瘤细胞富集：对外周血液样本用市售红细胞裂解处理以去除红细胞，血液样本与红细胞裂解液以1:3比例进行混合；将红细胞裂解后的细胞悬液加到滤膜上(滤膜孔径5～8um)，进行抽滤处理，抽滤结束后，用镊子小心取出滤膜，置于24孔板中，铁圈上有编码的一面朝上。
2、亲水：将样本置于400μL 100％乙醇中静置2min，400μL 70％乙醇2min，400μL50％乙醇中2min。去除液体，每孔加入2mL纯水洗涤三次，每次浸泡2min。
3、烤片：将滤膜正面朝上放在载玻片上，并将载玻片置于烤片机上，60℃烤膜1.5h。
4、脱水：将滤膜置于24孔板中，每孔加入1mL 100％乙醇，浸泡2min后取出，室温风干2～5min。
5、预处理液处理(NaSCN)：烤片结束前15min时，将预处理液分装至24孔板中，每孔2mL，盖上板盖，置于80℃水浴锅中备用。将滤膜浸入预处理液，80℃±2℃孵育12min。去除液体，每孔加入2mL纯水洗涤三次，每次浸泡2min，用纸巾吸干滤膜边缘多余的水。
6、消化：将消化酶工作液涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。将预处理过的滤膜取出，倒扣至24孔板中消化酶工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。室温(15℃-30℃)静置1h。
7、洗涤：去除液体，每孔加入2mL纯水洗涤三次，每次浸泡2min。
二、FISH检测
FISH检测包括脱水、杂交、杂交后洗涤与DAPI复染四个步骤。因为探针上的荧光基团见强光容易发生淬灭，所以杂交、杂交后洗涤及DAPI复染三个步骤均需在暗处操作(避光操作)。
1、准备工作：探针平衡至室温，涡旋混匀后置于微量离心机中离心2-3s；开启并预热杂交仪，将湿条浸入蒸馏水中备用(至少浸泡2h)，杂交时放入杂交仪；使用玻璃刀在切片反面圈出样本杂交区域。
2、脱水：将70％、85％、100％乙醇依次滴加到装有滤膜的孔中各浸泡1min，每孔1mL。置于烤片机上2-5min烘干。
3、杂交(避光操作)：将滤膜取出，置于用酒精用擦拭干净的载玻片上，注意将有细胞面朝上放置。在滤膜的中央加入10μL环肿瘤细胞BRCA1、PTEN基因异常的FISH探针溶液(探针浓度15ng/ul，每一标准人份探针量，对应检测的样本面积约为20mm×20mm，样本区域较大的样本可根据实际情况增加用量)，盖上盖玻片，确保盖玻片下无气泡、探针均匀分布。使用封片胶覆盖盖玻片四周位置，形成闭合的密封圈。将放置有滤膜的载玻片放入已安装湿条的杂交仪中，设置杂交反应程序：85℃变性8min，42℃杂交4h。
4、杂交后洗涤(避光操作)：开启水浴锅(76±1℃)，将洗涤缓冲液Ⅱ置于水浴锅预热。将杂交后的切片从杂交仪中取出，去除封片胶，置于室温的洗涤缓冲液Ⅰ中5min，洗掉盖玻片，再置于76±1℃的洗涤缓冲液Ⅱ中5min，期间可轻轻晃动载玻片1-3s；
用洗涤缓冲液Ⅰ和洗涤缓冲液Ⅱ分别重复洗涤一次；最后用洗涤冲液Ⅰ再重复洗涤一次，每种洗涤缓冲液重复洗涤时的时间与第一次用该缓冲液洗涤时时间相同。将膜取出，放在无尘纸上吸干多余水分，然后将滤膜转移到用酒精擦干净的载玻片上。
5、DAPI复染(避光操作)：在样本杂交区域加入10μL复染液，盖上盖玻片，轻轻往下压，使DAPI覆盖整张膜，于4℃避光放置20min。在DAPI通道用20倍显微镜镜检整张膜，确定滤膜正面朝上。
三、结果判定
一种BRCA1、PTEN基因异常检测试剂盒的结果判断标准为：
上下移动显微镜视野，查找所有存在于细胞核内的信号。
(1)信号点目标计数细胞选择(参见附图1)：
a、细胞核部分重叠，但信号不在重叠区域内，可进行计数；
b、细胞堆叠，且有信号分布在重叠区域时，不进行计数。
(2)信号点计数标准(参见附图2)：
a、单独分开的红/浅蓝、绿/白色信号视为单一信号(图中有4个红/浅蓝色信号点和2个绿/白色信号点)；
b、同色信号紧挨呈分裂状，或者信号分开但间距小于或等于2倍信号长度时记为一个信号；(图b1中有2个红/浅蓝色信号点和2个绿/白色信号点，图b2中有1个红/浅蓝色信号点和2个绿/白色信号点)；
c、信号边界模糊呈扩散状记为一个信号(图中有2个红/浅蓝色信号点和2个绿/白色信号点)；注：附图1和2中黑色代表红色或浅蓝色、白色代表绿色或白色。
所述BRCA1、PTEN基因异常检测试剂盒在检测前列腺癌患者CTCs时的结果判断标准为：1、统计每个样本中所有CTCs数量，10个以上(含10个)CTCs可判定样本阴性或阳性，10个以下细胞只提供阴阳性细胞数量及比例。
2、信号比值＜0.8(比值＝细胞核中浅蓝色信号总数/细胞核中白色信号总数)，样本判定为BRCA1/PTEN基因缺失阳性；
3、信号比值为0.8-2.2之间(比值＝细胞核中浅蓝色信号总数/细胞核中白色信号总数)，样本判定为BRCA1/PTEN基因缺失阴性。
四、结果检测与数据分析
利用本发明的探针对20份前列腺癌患者外周血样品进行检测，检测结果见表3-5(表中“N”表示阴性结果，“P”表示阳性结果，“--”表示由于CTC数量小于10不能判定样品阴阳性，只能提供比值)：
表3 BRCA1基因异常检测结果
表4PTEN基因异常检测结果
表5样本检测结果
根据本发明提供的FISH探针和检测方法，检测20份前列腺癌患者外周血样品，检测结果能准确地能反映BRCA1/PTEN基因异常的情况，且结果稳定可靠。由此可见，本发明的所提供的FISH具有特异性好，信号强的特点。
实施例3 不同靶标基因选择对检测结果的影响
一、检测靶基因选择
为了检验不同靶标基因选择的选择对样品检测结果的影响，本实施例设计三个实验组，其中实验组1使用第一、第二组全部探针对BRCA1基因进行检测；实验组2使用第三、第四组全部探针对PTEN基因进行检测；实验组3使用第一、第二、第三以及第四组全部探针对BRCA1、PTEN基因异常进行并行检测。具体试验安排见表6。探针的合成、探针库的构建、探针标记和实验步骤等如实施1和实施例2所示。
表6靶基因的选择
二、样品检测
使用上述设计制备得到的试剂盒，按实施例2所述步骤和方法，分别对20例前列腺癌患者外周血样品进行检测(样品编号21～40)，具体检测结果如下(表中“N”表示阴性结果，“P”表示阳性结果，“--”表示由于CTC数量小于10不能判定样品阴阳性，只能提供比值)：
表7样品检测结果
根据上述检测结果可以看出，利用本发明提供的试剂盒，不仅能单独实现BRCA1和PTEN基因异常的检测(详见本实施例实验1、实验2检测结果)，同时本发明提供的试剂盒更能实现上述两个基因的异常情况并行检测(详见本实施例实验3检测结果)，即在一个反应体系内，实现两个基因的并行检测，提高了检测效率，大大减少临床样本的使用量，节省检测时间。根据3个实验组结果的比较可知，不管是对BRCA1和PTEN基因异常的单独检测，还是对它们进行并行检测，本发明提供的试剂盒均能取得很好的检测效果，说明本发明提供的荧光探针信号好，特异性强，能准确与基因的靶标片段进行特异性结合，从而实现对循环肿瘤细胞中BRCA1和PTEN基因异常的准确检测。
实施例4 杂交时间对试剂盒检测效果的影响
一、杂交时间设置
本发明试剂盒探针长度和染料标记方法的设计是发明人经过大量实验，对实验结果进行比对和统计分析后得出的最优方案，能达到检测特异性和杂交时长之间的最优平衡，既能保证结果特异性和灵敏度，又能缩短杂交时间，提高检测效率。
为验证杂交时长对本发明检测结果的影响，本实施例设置了不同杂交时长的4个实验组，具体见表8，所用检测探针和试剂与实施例1试剂盒一致。
表8杂交时长
分组 实验组4 实验组5 实验组6 实验组7
杂交时间 2h 4h 8h 16h
二、样品检测
采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对前列腺癌患者外周血样品41-60进行检测，其中各实验组杂交时间与表8杂交时间一致，具体实验结果如下(表中“N”表示阴性结果，“P”表示阳性结果，“--”表示由于CTC数量小于10不能判定样品阴阳性，只能提供比值)：
表9杂交时长对检测结果的影响
对比4个实验组的检测结果可知，本发明试剂盒设计的探针在4h内即可与样本目标基因充分杂交，实现样本的检测并保证结果的特异性和准确性。2h的杂交时长由于探针不能与样本充分杂交，而导致假阳性的基因缺失结果，且检测结果不稳定；而8h和16h的杂交时长检测结果与4h完全一致。说明本发明探针长度和染料标记方式能显著减短探针与目标基因的杂交时间，提高检测效果，同时保证检测的特异性和准确性。
实施例5 探针长度对试剂盒检测效果的影响
一、探针长度
本发明试剂盒探针长度和染料标记方法的设计是发明人经过大量实验，对实验结果进行比对和统计分析后得出的最优方案，能达到检测特异性和杂交时长之间的最优平衡，既能保证结果特异性和灵敏度，又能缩短杂交时间，提高检测效率。为验证探针长度对本发明检测结果的影响，本实施例设置了不同探针长度的4个实验组，具体见表10。其中，4个实验组扩增区域位置相同，根据实验需要回收相应长度的扩增产物用于制备探针库。所用检测探针制备方法和试剂与实施例1试剂盒一致。
表10探针长度
分组 实验组8 实验组9 实验组10 实验组11
探针长度 20-200bp 200-400bp 400-1000bp ＞1000bp
二、样本检测
采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对前列腺癌患者外周血样品61-80进行检测，具体实验结果如下(表中“N”表示阴性结果，“P”表示阳性结果，“--”表示由于CTC数量小于10不能判定样品阴阳性，只能提供比值)：
表11探针长度对检测结果的影响
对比4个实验组的检测结果可知，实验组9使用200-400bp的探针，在4h内即可与样本目标基因充分杂交，实现样本的检测并保证结果的特异性和准确性。探针长度过短(实验组8)，会降低检测特异性，造成较高的背景噪音，同时产生的荧光信号很弱，甚至不产生荧光，造成结果的误判；探针长度过长(实验组10和11)会降低细胞对探针的摄取能力，同时延长杂交所需要的时间，导致在4h探针不能与目标基因充分杂交，影响检测结果的准确性和稳定性。
实施例6 引物对数量的选择对样品检测结果的影响
一、引物对数量的选择
为了检验引物数量对数量的选择对样品检测结果的影响，本实施例以针对PTEN基因和人类10号染色体着丝粒区域构建探针库，分别选择不同数量的针对PTEN基因(第三组)和针对人类7号染色体着丝粒区域(第四组)扩增引物对设置4个实验组，以研究不同数量的扩增产物(即，探针)其组成相应的探针库检测效果是否一致，其中实验组12为各选择1对扩增引物对；实验组13为各选择3对扩增引物对；实验组14为各选择5对扩增引物对；实验组15为各选择10对扩增引物对。具体试验安排见表12，探针的合成、探针库的构建、探针标记和实验步骤等如实施1和实施例2所示。
表12不同数量的扩增引物对
二、样品检测
使用上述设计制备得到的试剂盒，按实施例2所述步骤和方法20例前列腺癌患者外周血样品81～100进行检测，具体检测结果如下,(表中“N”表示阴性结果，“P”表示阳性结果，“--”表示由于CTC数量小于10不能判定样品阴阳性，只能提供比值):
表13临床样品检测结果
表14选择不同数量的扩增引物的检测结果
根据以上检测结果可以看出，针对PTEN基因和人类10号染色体着丝粒区域，分别选择1、3、5、10对的第三组和第四组扩增引物对构建探针库，不同数量的扩增产物(即，探针)其组成相应的探针库均可实现检测。其中分别选择3对或以上扩增引物完成探针库的构建时，探针库的灵敏度、特异性和稳定性都很好，而使用10对扩增引物对时，可使探针库的灵敏度、特异性和稳定性达到最好。针对的BRCA1基因的分别选择不同数量的第一组和第二组扩增引物对构建探针库，不同数量的扩增产物(即，探针)其组成相应的探针库检测效果一致，具体检测结果省略。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种BRCA1、PTEN基因异常检测试剂盒，其特征在于，包括有针对BRCA1基因的第一组与第二组探针，和/或针对PTEN基因的第三组与第四组探针；所述每组探针标记有荧光染料，同一组内的探针的荧光染料颜色相同，不同组的探针的荧光染料颜色不同；所述四组探针为分别以相应BAC克隆为模板，通过扩增引物得到的扩增产物；
针对所述第一组探针的扩增引物为：选自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20中的至少一对；
针对所述第二组探针的扩增引物为：选自SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22、SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28、SEQID NO.29和SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39和SEQ IDNO.40中的至少一对；
针对所述第三组探针的扩增引物为：选自SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42、SEQ IDNO.43和SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48、SEQID NO.49和SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54、SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59和SEQ IDNO.60中的至少一对；
针对所述第四组探针的扩增引物为：选自SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62、SEQ IDNO.63和SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68、SEQID NO.69和SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73和SEQ ID NO.74、SEQ ID NO.75和SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77和SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79和SEQ IDNO.80中的至少一对。
2.根据权利要求1所述的BRCA1、PTEN基因异常检测试剂盒，其特征在于，得到的扩增产物的大小为200-400bp。
3.根据权利要求1所述的BRCA1、PTEN基因异常检测试剂盒，其特征在于，针对所述第一组探针的扩增引物选自权利要求1相应引物对中的至少三对，针对所述第二组探针的扩增引物选自权利要求1相应引物对中的至少三对，针对所述第三组探针的扩增引物选自权利要求1相应引物对中的至少三对，针对所述第四组探针的扩增引物选自权利要求1相应引物对中的至少三对。
4.根据权利要求3所述的BRCA1、PTEN基因异常检测试剂盒，其特征在于，针对所述第一组探针的扩增引物选自权利要求1相应引物对中的至少五对，针对所述第二组探针的扩增引物选自权利要求1相应引物对中的至少五对，针对所述第三组探针的扩增引物选自权利要求1相应引物对中的至少五对，针对所述第四组探针的扩增引物选自权利要求1相应引物对中的至少五对。
5.根据权利要求1所述的BRCA1、PTEN基因异常检测试剂盒，其特征在于，包括针对BRCA1基因的第一组和第二组探针，和针对PTEN基因的第三组和第四组探针，
针对所述第一组探针的扩增引物为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20；
针对所述第二组探针的扩增引物为：SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28、SEQ IDNO.29和SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34、SEQID NO.35和SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40；
针对所述第三组探针的扩增引物为：SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48、SEQ IDNO.49和SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52、SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54、SEQID NO.55和SEQ ID NO.56、SEQ ID NO.57和SEQ ID NO.58、SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60；
针对所述第四组探针的扩增引物为：SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.63和SEQ ID NO.64、SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.66、SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.68、SEQ IDNO.69和SEQ ID NO.60、SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.72、SEQ ID NO.73和SEQ ID NO.74、SEQID NO.75和SEQ ID NO.76、SEQ ID NO.77和SEQ ID NO.78、SEQ ID NO.79和SEQ ID NO.80。
6.根据权利要求1所述的BRCA1、PTEN基因异常检测试剂盒，其特征在于，所述荧光染料选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、DEAC、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750，且针对不同探针组的荧光染料互不相同。
7.一种BRCA1、PTEN基因异常检测方法，其特征在于，包括
(1)待检测样品预处理；
(2)使用权利要求1-6任一项所述的BRCA1、PTEN基因异常检测试剂盒进行杂交检测；
(3)复染后在显微镜下观察荧光信号。
8.根据权利要求7所述的BRCA1、PTEN基因异常检测方法，其特征在于，
使用权利要求1-6任一项所述的BRCA1、PTEN基因异常检测试剂盒进行杂交检测，包括以下步骤：
(2.1)探针平衡至室温，制备探针溶液；准备好具有杂交区域的切片样本；
(2.2)预变性：将切片依次置于70％、85％、100％乙醇中脱水；烘干；
(2.3)杂交：在切片样本的杂交区域加入探针溶液，进行杂交反应；
(2.4)洗涤；
(2.5)DAPI复染。
9.根据权利要求8所述的BRCA1、PTEN基因异常检测方法，其特征在于，步骤(2.3)中杂交反应条件为：42±1℃杂交4±0.5h。
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