KR102134979B1 - 생물학적 시료의 염색을 위한 식물 기반 염료, 추출 방법 및 이의 용도 - Google Patents

생물학적 시료의 염색을 위한 식물 기반 염료, 추출 방법 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102134979B1
KR102134979B1 KR1020187001944A KR20187001944A KR102134979B1 KR 102134979 B1 KR102134979 B1 KR 102134979B1 KR 1020187001944 A KR1020187001944 A KR 1020187001944A KR 20187001944 A KR20187001944 A KR 20187001944A KR 102134979 B1 KR102134979 B1 KR 102134979B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
brazillane
composition
present
dna
solvent
Prior art date
Application number
KR1020187001944A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180073547A (ko
Inventor
파티마 베나지르 자한기르 알리
알렉스 다스 폴 라비다스
한다나할 수바라오 사비트리
Original Assignee
파티마 베나지르 자한기르 알리
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 파티마 베나지르 자한기르 알리 filed Critical 파티마 베나지르 자한기르 알리
Publication of KR20180073547A publication Critical patent/KR20180073547A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102134979B1 publication Critical patent/KR102134979B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/94—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems condensed with rings other than six-membered or with ring systems containing such rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/173—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties staining/intercalating agent, e.g. ethidium bromide

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

본 발명은 DNA 및 RNA와 같은 핵산의 향상된 시각화를 위해 형광 염료로서 이용될 수 있는 브라질레인을 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 수피 시작 물질로부터 브라질레인을 추출하는 간단하고, 시간 및 비용 효과적인 방법이 본 명세서에 제공된다.

Description

생물학적 시료의 염색을 위한 식물 기반 염료, 추출 방법 및 이의 용도
발명은 핵산 검출용 시약 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 핵산의 검출 향상을 위한 브라질레인을 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 신속하고 비용 효율적인 브라질레인의 단리 및 정제 방법이 제공된다.
염색은 생물학적 시료의 동정, 검출, 시각화, 표지, 표적화 및 정제에 이용되는 중요한 보조 기법이다. 또한, 염색은 현미경 검사에도 널리 이용되어 현미경 이미지에서 콘트라스트(contrast)를 향상시킨다. 특히, 스테인(stains) 및 염료는 조직을 검사하고 세포군 또는 개별 세포 내의 세포기관들의 분류와 같은 다양한 이유들로 인하여 조직 내의 구조를 강조하기 위하여, 화학, 생물 및 의약에 종종 이용되어 핵산, 단백질 및 또한 다른 생물학적 물질을 시각화하고 정량화한다. 스테인은 특정한 표적과 접촉되는 경우 검출가능한 반응을 보이는 화학적 화합물이다. 표적이 부재한 경우, 스테인은 검출가능한 반응을 보이지 않는다. 이러한 성질은 시료 내에서 특정한 표적의 유무의 검출에 있어서 스테인을 가치있게 한다. 검출가능한 반응은 화합물, 표적 및 분석 파라미터에 따라 정성적 또는 정량적일 수 있다.
핵산, 특히 DNA의 검출 및 정량화는 생명공학 연구에 있어서 매우 흔한 작업이다. 초기 화학적 스테인은 DNA 염색에 있어서 효과적일 뿐만 아니라 RNA를 염색한다. DNA 및 RNA는 천연 원천으로부터 단리되는 경우 종종 함께 얻어진다. DNA에 대하여 선택적이지 않은 스테인은 단리된 DNA의 정량화를 어렵게 하는데, 이는 정량화 이전에 정제 단계가 수행될 것을 요구한다. 전문 연구는 단일 표준 DNA, 이중 표준 DNA 및 플라스미드 DNA와 같은 상이한 유형의 핵산들의 분화를 필요로 한다.핵산 스크리닝 응용은 안전성을 타협함으로써 현재 이용가능한 독성 및 변이유발성 형광 스테인을 사용한다. 공정은 성가신 안전 프로토콜 및 고가의 폐기 관행을 수반한다. 특히, 형광 스테인/염료는 핵산 연구에 널리 이용되어 아가로스 겔 중의 DNA/RNA 단편을 시각화하고 정량화한다. 브롬화 에티듐(EtBr)은 낮은 비용과 충분한 민감도로 인하여 수십년 동안 핵산 스크리닝에 이용되는 지배적인 염료이다. 그러나, 오염 제거 및 폐기물 처분에 관련된 안전 위험 및 비용은 궁극적으로 염료를 비싸게 하며 연구원 및 환경을 불안전하게 한다. 스테인, 겔 레드(Gel red), 겔 그린(Gel green), 피코 그린(Pico green), 다이머릭 시아나인(Dimeric cyanines) 등의 SYBR 군과 같은 몇몇 대체 스테인들은 독성이 높은 EtBr을 대체하기 위해 개발되었다. 변함없이, 이러한 모든 염료들은 핵산을 검출하는데 민감성이 높은 합성-방향족 고리 구조이다. 이들의 더 높은 민감도에도 불구하고, 이들은 특정 수준의 독성과 돌연변이 유발성을 발현한다. 이러한 염료들에 의하여 투사된 안정성 요구는 독성이 강한 EtBr과 비교된다. 따라서, 생물학적 시료 또는 핵산의 안전한 스크리닝을 위한 이용가능한 안전한 형광 스테인은 존재하지 않는다.
화합물 브라질레인은 아시아에서 널리 발견되는 관목인 캐살피니아 사판 (Caesalpinia sappan)의 수피로부터 유래한다. 또한, 캐살피니아 사판 종으로부터 간단한 공정을 통한 브라질레인의 추출과 양호한 수율을 얻는 추출은 매우 성가시고 곤란하다. 캐살피니아 종으로부터 브라질린 및 브라질레인 화합물의 추출 및 분리에 관한 보고가 있다(WO 2007066926 A1, WO/2007/066926). 이 모든 방법들은 식품 및 직물 염색제로서의 브라질레인의 추출 및 특성화에 대하여 설명한다. 그러나, 겔계 시스템 및 관련 응용에서 브라질레인의 핵산 염색성은 시도되지 않았다. 또한, 캐살피니아 종으로부터 브라질레인 화합물을 추출하고 정제하는데 많은 상이한 방법과 전략들이 이용되어 왔다. "브라질레인의 정제 방법"이라는 제목의 CN102241660 (A)에서, 언급된 발명은 브라질 나무로부터 브라질레인의 추출 방법에 관하여 설명한다. 발명은 에탄올, 에틸 에스테르를 포함하는 용매들의 조합을 이용하여 브라질레인을 추출한다. 추출 프로토콜을 위하여 수행된 칼럼 정제 단계는 아세토니트릴, 이동상으로서 인산 및 브라질레인 용리를 위한 여과 매질로서 실리카 겔도 포함한다. 본 방법은 식물 추출물로부터 브라질레인을 정제하기 위한 예비 HPLC도 이용하였다. 이 방법은 고가이며 길고도 성가신 과정에 이르는 2 가지 정제 프로토콜들을 수반한다.
"사판(sappan) 목재로부터 브라질레인을 추출하는 방법"이라는 명칭의 CN102219771A 특허에 언급된 발명은 사판 목재로부터 브라질레인을 추출하는 방법을 청구하고 있다. 이 방법은 원료 처리 이후 브라질레인 분리를 위한 거대다공성 수지 기반 흡수를 위한 제1 용매로서 메탄올을 포함한다. 이 방법이 브라질레인 정제를 위한 용매로서 메탄올을 사용하였지만, 이용된 농도, 용매 조합 및 배양 기간은 상이하며, 또한, 이 방법은 분산을 위한 물의 첨가, 흡착을 위한 거대다공성 수지의 사용, 메탄올을 이용한 구배 용리, 결정들의 결정화, 결정들의 세척 및 용해 및 에탄올 및 에틸 에스테이트 중에서 최종 재결정화를 포함하는, 추출을 위한 다른 몇몇 단계들을 이용한다.
"캐살피니아 사판으로부터 브라질레인의 대량 생산 방법"이라는 제목의 WO 2007066926 A1에서, 발명은 대규모 생산을 위한 알코올계 브라질레인 추출 방법을 청구하고 있다. 그러나, 추출은 알코올이 브라질레인을 정제하는 유일한 용매인 2 스테이지 결정화를 수반한다.
"캐살피니아 사판으로부터 고순도 브라질레인의 신속하고 저비용의 대량 생산 방법"이라는 제목의 한국 특허 번호 제1020050120665호는 물 또는 알코올을 이용하여 브라질레인을 추출하는 방법을 개시하지만, 이는 재결정화 및 제어된 조건 및 더 긴 배양 기간의 사용을 요구하고 있다.
본 발명의 일 양태에 있어서, (a) 브라질레인(6aS,11bR)-7,11b-디히드로-6H-인데노[2,1-c]크로멘-3,6a,9,10-테트롤); (b) 적어도 하나의 용매; 및 (c) 글리세롤, 염화나트륨, 황산마그네슘, 디메틸 술폭시드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물;을 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 양태에 있어서, (a) 캐살피니아 사판으로부터 수피를 획득하는 단계; (b) 상기 수피를 처리하여 분말 수피를 획득하는 단계; (c) 상기 분말 수피를 적어도 하나의 용매와 접촉시켜 제1 혼합물을 획득하는 단계; (d) 제1 혼합물의 부피가 80 내지 95% 만큼 감소될 때까지 상기 제1 혼합물을 20 내지 90℃ 범위의 온도에 노출시켜 제2 혼합물을 획득하는 단계; (e) 제2 혼합물을 여과하여 (i) 브라질린 및 브라질레인의 혼합물을 포함하는 여과액; 및 (ii) 잔기를 획득하는 단계; 및 (f) 상기 여과액을 22 내지 85℃의 범위의 온도에서 공기 또는 적어도 하나의 산화제와 접촉시켜 잔류 용매를 증발시켜 결정 형태의 브라질레인을 획득하는 단계;를 포함하는, 결정성 브라질레인(6aS,11bR)-7,11b-디히드로-6H-인데노[2,1-c]크로멘-3,6a,9,10-테트롤)을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 양태에 있어서, (i) (a) 브라질레인; (b) 적어도 하나의 용매; 및 (c) 글리세롤, 염화나트륨, 황산마그네슘, 및 디메틸 술폭시드로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 포함하는 조성물을 획득하는 단계; 및 (ii) 상기 조성물을 상기 시료와 접촉시키는 단계;를 포함하는, 시료 내에서 핵산의 검출 방법이 제공된다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 시료 내에서 핵산의 시험관 내 또는 생체 내 검출에서 사용을 위한, (a) 브라질레인; (b) 적어도 하나의 용매; 및 (c) 글리세롤, 염화나트륨, 황산마그네슘, 및 디메틸 술폭시드로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 양태에 있어서, (a) 브라질레인(6aS,11bR)-7,11b-디히드로-6H-인데노[2,1-c]크로멘-3,6a,9,10-테트롤); (b) 적어도 하나의 용매; 및 (c) 글리세롤, 염화나트륨, 황산마그네슘, 및 디메틸 술폭시드로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 포함하는 조성물을 포함하는 핵산 염색 키트가 제공된다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 시료 내에서 핵산의 시험관 내 또는 생체 내 검출에서 사용을 위한, 브라질레인이 제공된다.
본 주제의 이 특징, 양태 및 장점과 다른 특징, 양태 및 장점은 하기 명세서 및 첨부된 청구의 범위를 참조하여 더 양호하게 이해될 것이다. 이 요약은 개념들의 정선을 간단한 형태로 도입하기 위해 제공된다. 이 요약은 청구된 주제의 핵심 특징 또는 필수 특징을 확인하는 의도가 아니며, 청구된 주제의 범위를 한정하기 위해 사용된 의도도 아니다.
당업자는 본 발명이 구체적으로 기재된 것 이외에 변형 및 수정된다는 것을 알 것이다. 본 발명은 그러한 변형 및 수정을 모두 포함한다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 본 명세서에서 언급되고 지시된 단계, 특징, 조성물 및 화합물들 모두를 개별적 또는 집합적으로 포함하고, 상기 단계 또는 특징들의 하나 이상의 임의 및 모든 조합도 포함한다.
정의
편의상, 본 발명을 더 설명하기 전에, 명세서 내에 사용된 특정 용어들 및 실시예들이 본원에 포함되어 있다. 이러한 정의는 발명의 나머지들에 비추어 독해되어야 하며, 당업자에 의한 바와 같이 이해되어야 한다. 본원에 사용된 용어들은 당업자들에게 인식되고 알려진 의미들을 가지지만, 편의와 완전성을 위해 특정 용어들과 이들의 의미들은 아래에 설명된다.
"a", "an" 및 "the"의 관사들을 이용하여 관사의 문법적 대상의 하나 또는 그 이상(즉, 적어도 하나)를 가리킨다.
"ssDNA"라는 용어는 단일 가닥 DNA를 지칭한다.
"ssRNA"라는 용어는 단일 가닥 RNA를 지칭한다.
"tm"이라는 용어는 브라질레인의 메탄올 추출물과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
"tw"라는 용어는 브라질레인의 물 추출물과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
"te"라는 용어는 브라질레인의 에탄올 추출물과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
"EtBr"이라는 용어는 브롬화 에티듐을 지칭하며, 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
"상승 활성"을 포함하는 조성물 또는 "상승 조성물"은 개별 화합물들의 생물학적 또는 기능적 활성의 비-선형 배수로서 증가된 생물학적 또는 기능적 활성을 보여주는 화합물들의 조합이다. 달리 말해서, 시험되고 있는 2 이상의 화합물들의 조합된 생물학적 또는 기능적 활성은 화합물들이 따로 시험되는 경우 화합물들의 독립적인 효과들에 기반하여 예상된 결과보다 현저하게 더 크다. 상승 효과는 일부 범위 또는 농도들에서만 명백할 수 있다. 또한, 화합물들의 상승적 조합은 시험되고 있는 상이한 종류의 생물학적 효과들에 대하여 상이할 수 있다.
"포함하다" 또는 "포함하는"이라는 용어들은 포괄적, 개방적인 의미로 이용되어, 추가적인 요소들이 포함될 수 있다는 것을 의미한다. 이는 "~만으로 구성된" 것으로 해석되는 의도는 아니다.
본 명세서를 통해, 문맥이 달리 필요로 하지 않으면, "포함하다"라는 단어 및 "포함하다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 진술된 요소 또는 단계 또는 요소들 또는 단계들의 군의 포함을 의미하지만, 임의의 다른 요소 또는 단계 또는 요소 또는 단계들의 군을 배제하지 않는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
"포함하는"이라는 용어가 사용되어 "포함하지만 여기에 한정되지 않는"을 의미한다. "포함하는" 및 "포함하지만 여기에 한정되지 않는"은 상호 교환적으로 사용된다.
달리 정의되지 않으면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에 통상의 기술을 갖는 자에 의하여 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 균등한 임의의 방법 및 물질은 발명의 수행 또는 시험에 이용될 수 있다고 하더라도, 바람직한 방법 및 물질이 이제 설명된다. 본원에 언급된 모든 간행물들은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은 예시의 목적만으로 의도된, 본원에 기재된 특정 실시형태들에 의하여 범위가 한정되지 않는다. 기능적으로-균등한 생성물, 조성물 및 방법은 본원에 기재된 바와 같이 발명의 범위 내에서 명백하다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, (a) 브라질레인(6aS,11bR)-7,11b-디히드로-6H-인데노[2,1-c]크로멘-3,6a,9,10-테트롤); (b) 적어도 하나의 용매; 및 (c) 글리세롤, 염화나트륨, 황산마그네슘, 디메틸 술폭시드, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 브라질레인 중량 백분율은 0.000284 내지 0.0284%의 범위에 있는 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 브라질레인 농도는 10 μM 내지 1 mM의 범위에 있는 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 브라질레인 중량 백분율은 0.0284%인 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 브라질레인 농도가 1 mM인 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 용매는 물, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 상기 용매 중량 백분율은 브라질레인을 용해시키는데 충분한 양인 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 화합물은 염화나트륨인 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 화합물은 황산마그네슘인 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 화합물은 글리세롤인 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 화합물은 디메틸 술폭시드(DMSO)인 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 브라질레인 대 염화나트륨 w/w 비율은 1:0.0035 내지 1:3.52의 범위에 있는 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 염화나트륨 중량 백분율은 0.0001 내지 0.001%의 범위에 있는 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 화합물 중 염화나트륨 중량 백분율은 0.001%인 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 브라질레인 대 염화나트륨 w/w 비율은 1:0.352인 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 브라질레인 중량 백분율은 0.0284%이며, 상기 조성물 중 염화나트륨 중량 백분율은 0.001%인 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 브라질레인 대 황산마그네슘 w/w 비율은 1:0.0035 내지 1:3.52의 범위에 있는 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 염화마그네슘 중량 백분율은 0.0001 내지 0.001%의 범위에 있는 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 염화마그네슘 중량 백분율은 0.001%인 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 브라질레인 대 황산마그네슘 w/w 비율은 1:0.352인 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 브라질레인 중량 백분율은 0.0284%이며, 상기 조성물 중 황산마그네슘 중량 백분율은 0.001%인 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 브라질레인 대 글리세롤 w/w 비율은 1:887 내지 1:133098의 범위에 있는 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 글리세롤 중량 백분율은 25.2 내지 37.8%의 범위에 있는 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 글리세롤 중량 백분율은 25.2%인 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 글리세롤 중량 백분율은 37.8%인 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 브라질레인 대 글리세롤 w/w 비율은 1:887.3인 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 브라질레인 대 글리세롤 w/w 비율은 1:1330.9인 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 브라질레인 중량 백분율은 0.0284%이며, 상기 조성물 중 글리세롤 중량 백분율은 25.2%인 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 브라질레인 중량 백분율은 0.0284%이며, 상기 조성물 중 글리세롤 중량 백분율이 37.8%인 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 브라질레인 대 디메틸 술폭시드 w/w 비율은 1:2464 내지 1:316901의 범위에 있는 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 DMSO 중량 백분율은 70 내지 90%의 범위에 있는 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 DMSO 중량 백분율은 70%인 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 DMSO 중량 백분율은 90%인 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 브라질레인 대 디메틸 술폭시드 w/w 비율은 1:2464.7인 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 브라질레인 대 디메틸 술폭시드 w/w 비율은 1:3169인 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 브라질레인 중량 백분율은 0.0284%이며, 상기 조성물 중 DMSO 중량 백분율은 70%인 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물로서, 상기 조성물 중 브라질레인 중량 백분율은 0.0284%이며, 상기 조성물 중 DMSO 중량 백분율은 90%인 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, (a) 캐살피니아 사판으로부터 수피를 획득하는 단계; (b) 상기 수피를 처리하여 분말 수피를 획득하는 단계; (c) 상기 분말 수피를 적어도 하나의 용매와 접촉시켜 제1 혼합물을 획득하는 단계; (d) 제1 혼합물의 부피가 80 내지 95% 만큼 감소될 때까지 상기 제1 혼합물을 20 내지 90℃ 범위의 온도에 노출시켜 제2 혼합물을 획득하는 단계; (e) 제2 혼합물을 여과하여 (i) 브라질린 및 브라질레인의 혼합물을 포함하는 여과액; 및 (ii) 잔기를 획득하는 단계; 및 (f) 상기 여과액을 22 내지 85℃의 범위의 온도에서 공기 또는 적어도 하나의 산화제와 접촉시켜 잔류 용매를 증발시켜 결정 형태의 브라질레인을 획득하는 단계를 포함하는, 결정성 브라질레인(6aS,11bR)-7,11b-디히드로-6H-인데노[2,1-c]크로멘-3,6a,9,10-테트롤)을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 캐살피니아 사판으로부터의 수피 수분 함유량은 5 내지 15%의 범위에 있는, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 캐살피니아 사판으로부터의 수피 수분 함유량은 5 내지 14%의 범위에 있는, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 캐살피니아 사판으로부터의 수피 수분 함유량은 5 내지 12%의 범위에 있는, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 캐살피니아 사판으로부터의 수피 수분 함유량은 5 내지 10%의 범위에 있는, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 캐살피니아 사판으로부터의 수피 수분 함유량은 5 내지 8%의 범위에 있는, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 캐살피니아 사판으로부터의 수피 수분 함유량은 5 내지 6%의 범위에 있는, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 용매는 물, 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 용매는 물인, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 용매는 에탄올인, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 용매는 메탄올인, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 용매는 아세톤인, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 용매는 메탄올 및 에탄올의 조합인, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 용매는 1:1의 v/v 비율의 메탄올 및 에탄올의 조합인, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 용매는 메탄올 및 물의 조합인, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 용매는 4:1의 v/v 비율의 메탄올 및 물의 조합인, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 용매는 에탄올 및 물의 조합인, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 용매는 4:1의 v/v 비율의 에탄올 및 물의 조합인, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 용매는 메탄올 및 아세톤의 조합인, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 용매는 1:1의 v/v 비율의 메탄올 및 아세톤의 조합인, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 용매는 아세톤 및 물의 조합인, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 용매는 1:1의 v/v 비율의 아세톤 및 물의 조합인, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 단계 (c)에서, 상기 제1 혼합물 중 분말 수피 대 용매 w/w 비율은 1:5 내지 1:20의 범위에 있는 것인, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 단계 (c)에서, 상기 제1 혼합물 중 분말 수피 대 용매 w/w 비율은 1:20인, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 단계 (c)에서, 분말 수피 양은 5 g이며, 용매 부피는 100 ㎖인, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 단계 (c)는 적어도 하나의 산화제를 제1 혼합물과 접촉시키는 단계를 선택적으로 더 포함하는 것인, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 단계 (c)는 적어도 하나의 산화제를 제1 혼합물과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것인, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, (a) 캐살피니아 사판으로부터 수피를 획득하는 단계; (b) 상기 수피를 처리하여 분말 수피를 획득하는 단계; (c) 상기 분말 수피를 적어도 하나의 용매 및 적어도 하나의 산화제와 접촉시켜 제1 혼합물을 획득하는 단계; (d) 제1 혼합물의 부피가 80 내지 95% 만큼 감소될 때까지 상기 제1 혼합물을 20 내지 90℃ 범위의 온도에 노출시켜 제2 혼합물을 획득하는 단계; (e) 제2 혼합물을 여과하여 (i) 브라질린 및 브라질레인의 혼합물을 포함하는 여과액; 및 (ii) 잔기를 획득하는 단계; 및 (f) 상기 여과액을 22 내지 85℃의 범위의 온도에서 공기 또는 적어도 하나의 산화제와 접촉시켜 잔류 용매를 증발시켜 결정 형태의 브라질레인을 획득하는 단계를 포함하는, 결정성 브라질레인(6aS,11bR)-7,11b-디히드로-6H-인데노[2,1-c]크로멘-3,6a,9,10-테트롤)을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 산화제는 아세톤인, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 단계 (e)로부터의 상기 잔기(ii)는 (a) 상기 잔기를 적어도 하나의 용매와 접촉시켜 제3 혼합물을 획득하는 단계; (b) 제1 혼합물의 부피가 80 내지 95% 만큼 감소될 때까지 제3 혼합물을 20 내지 90℃ 범위의 온도에 노출시켜 제4 혼합물을 획득하는 단계; (c) 제4 혼합물을 여과하여 (i) 브라질린 및 브라질레인의 혼합물을 포함하는 여과액; 및 (ii) 잔기를 획득하는 단계; 및 (d) 상기 여과액을 22 내지 85℃의 범위의 온도에서 공기 또는 적어도 하나의 산화제와 접촉시켜 잔류 용매를 증발시켜 결정 형태의 브라질레인을 획득하는 단계를 포함하는 반복된 추출을 수행하는 것인 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 반복된 추출 공정은 3 내지 5 사이클 동안 수행되는 것인, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 반복된 추출 공정은 3 사이클 동안 수행되는 것인, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 반복된 추출 공정은 4 사이클 동안 수행되는 것인, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 상기 반복된 추출 공정은 5 사이클 동안 수행되는 것인, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, (a) 캐살피니아 사판으로부터 수피를 획득하는 단계; (b) 상기 수피를 처리하여 분말 수피를 획득하는 단계; (c) 상기 분말 수피를 적어도 하나의 용매와 접촉시켜 제1 혼합물을 획득하는 단계; (d) 제1 혼합물의 부피가 80 내지 95% 만큼 감소될 때까지 상기 제1 혼합물을 20 내지 90℃ 범위의 온도에 노출시켜 제2 혼합물을 획득하는 단계; (e) 제2 혼합물을 여과하여 (i) 브라질린 및 브라질레인의 혼합물을 포함하는 여과액; 및 (ii) 잔기를 획득하는 단계; (f) 잔기를 단계 (c) 내지 (i)의 추출의 3 내지 5 사이클에 노출시키는 단계; (g) 여과액을 각각의 추출 사이클로부터 풀링(pooling)하는 단계; 및 (f) 상기 여과액을 22 내지 85℃의 범위의 온도에서 공기 또는 적어도 하나의 산화제와 접촉시켜 잔류 용매를 증발시켜 결정 형태의 브라질레인을 획득하는 단계를 포함하는, 결정성 브라질레인을 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 분말 수피 100 그램 당 결정성 브라질레인 15 내지 30 g을 산출하는 것인 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법에 있어서, 상기 방법은 분말 수피 100 g 당 브라질레인 20 g을 산출하며, 상기 용매는 메탄올인 것인 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법에 있어서, 상기 방법은 분말 수피 100 g 당 브라질레인 21.5 g을 산출하며, 상기 용매는 1:1 v/v 비율의 메탄올 및 에탄올인 것인 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법에 있어서, 상기 방법은 분말 수피 100 g 당 브라질레인 19 g을 산출하며, 상기 용매는 4:1 v/v 비율의 메탄올 및 물인 것인 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법에 있어서, 상기 방법은 분말 수피 100 g 당 브라질레인 22 g을 산출하며, 상기 용매는 4:1 v/v 비율의 에탄올 및 물인 것인 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법에 있어서, 상기 방법은 분말 수피 100 g 당 브라질레인 18 g을 산출하며, 상기 용매는 물인 것인 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법에 있어서, 상기 방법은 분말 수피 100 g 당 브라질레인 25 g을 산출하며, 상기 용매는 에탄올인 것인 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법에 있어서, 상기 방법은 분말 수피 100 g 당 브라질레인 28.5 g을 산출하며, 상기 용매는 아세톤인 것인 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법에 있어서, 상기 방법은 분말 수피 100 g 당 브라질레인 25 g을 산출하며, 상기 용매는 1:1 v/v 비율의 메탄올 및 아세톤인 것인 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 결정성 브라질레인을 획득하는 방법에 있어서, 상기 방법은 분말 수피 100 g 당 브라질레인 26 g을 산출하며, 상기 용매는 1:1 v/v 비율의 아세톤 및 물인 것인 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 시료 내에 핵산을 검출하는 방법에 있어서, 상기 방법은: (a) 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 획득하는 단계; 및 (b) 상기 조성물을 상기 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산의 검출 방법에 있어서, 브라질레인은 본원에 기재된 바와 같은 공정에 의하여 획득되는 것인 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산의 검출 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 시료 내에 DNA를 적어도 500 pg 검출하는 것인 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산의 검출 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 시료 내에 RNA를 적어도 40 pg 검출하는 것인 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산의 검출 방법에 있어서, 상기 방법은 DNA의 검출에 적합한 것인 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산의 검출 방법에 있어서, 상기 방법은 RNA의 검출에 적합한 것인 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산의 검출 방법에 있어서, 상기 방법은 ss DNA의 검출에 적합한 것인 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산의 검출 방법에 있어서, 상기 방법은 ss RNA의 검출에 적합한 것인 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산의 검출 방법에 있어서, 상기 방법은 플라스미드 DNA의 검출에 적합한 것인 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산의 검출 방법에 있어서, 상기 방법은 선형화된 플라스미드 DNA의 검출에 적합한 것인 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산의 검출 방법에 있어서, 상기 방법은 PCR 앰플리콘들의 검출에 적합한 것인 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산의 검출 방법에 있어서, 상기 방법은 살아있는 세포들 중의 DNA의 검출에 적합한 것인 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산의 검출 방법에 있어서, 상기 방법은 실시간 RCR에 적합한 것인 방법이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 시료 내에 핵산의 시험관 내 검출에서 사용을 위한, 본원에 기재된 바와 같은 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 시료 내에 DNA의 시험관 내 검출에서 사용을 위한, 본원에 기재된 바와 같은 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 시료 내에 RNA의 시험관 내 검출에서 사용을 위한, 본원에 기재된 바와 같은 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 시료 내에 플라스미드 DNA의 시험관 내 검출에서 사용을 위한, 본원에 기재된 바와 같은 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 시료 내에 선형화된 플라스미드 DNA의 시험관 내 검출에서 사용을 위한, 본원에 기재된 바와 같은 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 시료 내에 ss DNA의 시험관 내 검출에서 사용을 위한, 본원에 기재된 바와 같은 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, PCR 앰플리콘들의 시험관 내 검출에서 사용을 위한, 본원에 기재된 바와 같은 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 실시간 PCR 증폭의 시험관 내 검출에서 사용을 위한, 본원에 기재된 바와 같은 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 시료 내에 핵산의 생체 내 검출에서 사용을 위한, 본원에 기재된 바와 같은 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 살아있는 세포들 중 DNA의 생체 내 검출에서 사용을 위한, 본원에 기재된 바와 같은 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물에 있어서, 상기 조성물은 세포들에 비독성인 것인 조성물이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 포함하는 핵산 염색 키트가 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 사용 설명서를 더 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 염색 키트가 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물 및 사용 설명서를 포함하는 핵산 염색 키트가 제공된다.
본 발명의 일 실시양태에 있어서, 시료 내에서 핵산의 시험관 내 또는 생체 내 검출에서 사용을 위한, 브라질레인이 제공된다.
본 발명의 일 실시양태에 있어서, DNA의 검출에서 사용을 위한, 브라질레인이 제공된다.
본 발명의 일 실시양태에 있어서, RNA의 검출에서 사용을 위한, 브라질레인이 제공된다.
본 발명의 일 실시양태에 있어서, 플라스미드 DNA의 검출에서 사용을 위한, 브라질레인이 제공된다.
본 발명의 일 실시양태에 있어서, PCR 앰플리콘들의 검출에서 사용을 위한, 브라질레인이 제공된다.
본 발명의 일 실시양태에 있어서, 선형화된 DNA의 검출에서 사용을 위한, 브라질레인이 제공된다.
본 발명의 일 실시양태에 있어서, 단일 가닥 DNA의 검출에서 사용을 위한, 브라질레인이 제공된다.
본 발명의 일 실시양태에 있어서, 공초점 현미경법을 이용한 핵산의 검출에서 사용을 위한, 브라질레인이 제공된다.
본 발명의 일 실시양태에 있어서, 형광 활성화 세포 분류에서 사용을 위한, 브라질레인이 제공된다.
본 발명의 일 실시양태에 있어서, 형광 제자리 혼성화(fluorescence in situ hybridization)에서 사용을 위한, 브라질레인이 제공된다.
본 발명의 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산의 검출에서 사용을 위한 브라질레인에 있어서, 브라질레인은 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의하여 제조되는 것인 브라질레인이 제공된다.
하기 도면들은 본 명세서의 일부를 형성하며 본 발명의 양태들을 더 예시하기 위해 포함된다. 발명은 본원에 제시된 특정한 실시형태들의 상세한 설명과 조합하여 도면들을 참조함으로써 더 양호하게 이해될 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시형태에 따라, HPLC 크로마토그램 중의 브라질레인에 해당하는 단일 피크를 도시한다.
도 1b는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 추출된 브라질레인의 순도를 확인하는 GC-MS 중의 우세한 피크를 도시한다.
도 1c는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 브라질레인에 해당하는 284 mw의 피크를 보여주는 질량 분광 프로파일을 도시한다.
도 2a는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 메탄올 추출물의 450 ㎚(여기 파장 340 ㎚)에서 방출 최대(emission maximum)인 형광 방출 스펙트럼들을 도시한다.
도 2b는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 메탄올 추출물의 560 ㎚(여기 파장 491 ㎚)에서 방출 최대인 형광 방출 스펙트럼들을 도시한다.
도 3a는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 브롬화 에티듐에 의하여 다양한 농도로 DNA의 염색을 도시한다.
도 3b는 본 발명의 일 실시형태에 따라, SYBR®Gold에 의하여 다양한 농도로 DNA의 염색을 도시한다.
도 3c는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 브라질레인의 메탄올 추출물에 의하여 다양한 농도로 DNA의 염색을 도시한다.
도 3d는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 브라질레인의 에탄올 추출물에 의하여 다양한 농도로 DNA의 염색을 도시한다.
도 3e는 본 발명의 일 실시형태에 따라, RNA 상에서 브라질레인의 염색 능력을 도시한다.
도 3f는 본 발명의 일 실시형태에 따라, PCR 앰플리콘들 상에서 브라질레인의 염색 능력을 도시한다.
도 4a 내지 4d는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 상이한 유형의 핵산들을 염색하는데 있어서 브라질레인의 유효성을 보여주는 염색된 플라스미드 DNA (a), 유전자 DNA (b), ss DNA (c) 및 RNA (d)와 같은 다양한 핵산들의 전기영동 결과들을 도시한다.
도 5a는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 1 ng 만큼 낮은 DNA의 농도들을 검출하는 3 가지 브라질레인 추출물들(tm-메탄올, te-에탄올 및 tw-물)의 능력을 도시한다.
도 5b는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 400 pg 만큼 낮은 DNA의 농도들을 검출하는 3 가지 브라질레인 추출물들(tm-메탄올, te-에탄올 및 tw-물)의 능력을 도시한다.
도 6a는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 브라질레인의 메탄올(tm) 또는 에탄올(te) 추출물의 등가 농도와 비교하여 브롬화 에티듐의 농도 의존성 형광 스펙트럼들을 도시한다.
도 6b는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 브롬화 에티듐의 농도 의존성 형광 스텍트럼들을 도시한다.
도 6c는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 브라질레인의 메탄올 추출물의 농도 의존성 형광 스텍트럼들을 도시한다.
도 7a는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 다양한 농도들에서 브라질레인의 형광에 미치는 pH 5의 영향을 도시한다.
도 7b는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 다양한 농도들에서 브라질레인의 형광에 미치는 pH 6의 영향을 도시한다.
도 7c는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 다양한 농도들에서 브라질레인의 형광에 미치는 pH 7의 영향을 도시한다.
도 7d는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 다양한 농도들에서 브라질레인의 형광에 미치는 pH 8의 영향을 도시한다.
도 7e는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 다양한 농도들에서 브라질레인의 형광에 미치는 pH 9의 영향을 도시한다.
도 7f는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 다양한 농도들에서 브라질레인의 형광에 미치는 pH 10의 영향을 도시한다.
도 8은 본 발명의 일 실시형태에 따라, 브라질레인에 글리세롤을 첨가 시 형광에 미치는 향상된 효과를 도시하는 형광 스펙트럼 이미지를 도시한다.
도 9는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 브라질레인의 메탄올 추출물의 형광 세기에 미치는 다양한 금속 이온들의 영향을 도시한다.
도 10은 본 발명의 일 실시형태에 따라, 브라질레인에 염화나트륨을 첨가 시 형광에 미치는 향상된 효과를 도시하는 형광 스펙트럼 이미지를 도시한다.
도 11은 본 발명의 일 실시형태에 따라, 브라질레인에 황산마그네슘을 첨가 시 형광에 미치는 향상된 효과를 도시하는 형광 스펙트럼 이미지를 도시한다.
도 12a는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 브라질레인의 물 추출물을 포함하는 다양한 조성물들의 다양한 농도들에 노출 시에 HeLa 세포들의 세포 생존율을 도시한다.
도 12b는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 브라질레인의 메탄올 추출물을 포함하는 다양한 조성물들의 다양한 농도들에 노출 시에 HeLa 세포들의 세포 생존율을 도시한다.
도 13은 본 발명의 일 실시형태에 따라, 브라질레인에 의한 양파 상피세포 핵의 염색을 도시한다.
도 14a는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 브라질레인이 부재한 대조군 세포들의 FACS 분석을 도시한다.
도 14b는 본 발명의 일 실시형태에 따라, FACS 분석에 의하여 규명된 바와 같이 살아있는 세포들에 의한 브라질레인 섭취의 효능을 도시한다.
도 15a는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 브라질레인의 첨가 시 살아있는 세포들(녹색 필터) 중에서 핵의 시각화를 도시한다.
도 15b는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 살아있는 효모 세포들의 상 콘트라스트 이미지를 도시한다.
도 15c는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 브라질레인의 첨가 시 살아있는 세포들(적색 필터) 중에서 핵의 시각화를 도시한다.
도 15d는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 브라질레인의 첨가 시 살아있는 세포들(원적색 필터) 중에서 핵의 시각화를 도시한다.
도 15e는 본 발명의 일 실시형태에 따라, 도 15 a 내지 15d의 병합 이미지를 도시한다.
도 16은 본 발명의 일 실시형태에 따라, DNA 염료로서 브라질레인을 이용한 FISH 이미지를 도시한다.
주제를 주제의 특정 바람직한 실시형태들을 참조하여 상당히 상세히 설명하였지만, 다른 실시형태가 가능하다.
실시예
본 발명은 이제 발명의 작업을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위에 대한 임의의 제한을 제한적으로 암시하기 위한 것이 아닌, 작업예와 함께 예시될 것이다. 달리 정의되지 않으면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에 통상의 기술을 갖는 자에 의하여 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 방법 및 물질과 유사하거나 균등한 방법 및 물질이 개시된 방법 및 조성물의 실행에 이용될 수 있다고 하더라도, 예시적인 방법, 장치 및 물질은 본원에 기재된다. 본 발명은 방법 및 조건이 변할 수 있기 때문에, 특정한 방법 및 기재된 실험 조건에 한정되지 않는다는 것을 이해해야 할 것이다.
실시예 1
다양한 용매들을 이용하여 캐살피니아 사판 수피로부터 브라질레인의 단리
응달에서 건조한 캐살피니아 사판 수피 조직 100 그램을 브라질레인 추출을 위한 원천/원료로서 이용하였다. 수피 조직을 기계적으로 분말화 하였고, 이어서 용매(500 내지 2,000 ㎖)로서 증류수 중에서 혼합하며, 총 용액 부피가 최초 부피의 20%로 감소될 때까지 (80℃ 근방에서) 가열하였다. 이 용액을 여과 용지 또는 무슬린(muslin) 천 등을 사용하는 것과 같이 간단한 여과 기법에 의하여 여과하여 여과액 및 잔기를 획득하였다. 여과액을 모아서 브라질린이 브라질레인으로 산화되도록 실온(22 내지 30℃)에서 3 내지 5 일 동안 방치하였다. 용매를 증발하거나 용매를 가열시키거나 용매를 3 내지 5 일 동안 방치하여 제거함으로써 브라질린이 브라질레인으로 완전히 산화하도록 하였다. 이 기간 동안, 산화된 브라질레인도 건조시켜 결정성 분말을 형성하였다. 브라질레인 추출을 최대화하기 위하여, 여과 후 얻어진 잔기를 상기 언급된 바와 같이 반복 추출을 거쳐 제2 여과액을 획득하였다. 이 반복 추출을 3 내지 5 회 수행하여 산화된 브라질레인을 단리하기 위해 이후 풀링(pooled)시킨 다수의 여과액들을 획득하였다.
또한, 상기 언급된 바와 같은 공정을 용매(상기 주어진 바와 같이 물)를 (a) 메탄올; 또는 (b) 1:1의 v/v 비율인 메탄올 및 에탄올의 혼합물; 또는 (c) 4:1의 v/v 비율인 메탄올 및 물의 혼합물; 또는 (d) 4:1의 v/v 비율인 에탄올 및 물의 혼합물; 또는 (e) 에탄올; 또는 (f) 아세톤; 또는 (g) 1:1의 v/v 비율인 아세톤 및 메탄올의 혼합물; 또는 (h) 1:1의 v/v 비율인 아세톤 및 물의 혼합물로 치환함으로써 수행하였다.
다양한 공정들을 이용한 단리 후 브라질레인 수율은 하기 표 1에 주어진 바와 같다. 표 1은 가열 시간도 제공한다. 분말 수피 대 용매 w/v 비율을 20:1로 유지하였다. 가열 시간은 용매 부피 및 선택에 따라 변한다는 것을 알 것이다.
용매 수피 분말 수율/100 그램 80℃에서의 시간
메탄올 100 g 20 g 4- 5 h
메탄올 : 에탄올(1:1) 100 g 21. 5 g 4 h
메탄올 : 물(4:1) 100 g 19 g 5-6 h
에탄올 : 물(4:1) 100 g 22 g 5- 6 h
물 100 g 18 g 12 h
에탄올 100g 25 g 4 -5 h
아세톤 100 g 28.5 g 3-4 h
메탄올 : 아세톤(1:1) 100g 25 g 3-4 h
아세톤 : 물(1:1) 100g 26 g 3-4 h
상기 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 다양한 용매들을 이용한 수율은 분말 수피 100 g 당 18 내지 28.5 g의 범위에 이른다. 분말 수피 100 g이 브라질레인 28.5 g을 제공하는, 브라질레인의 아세톤 추출물의 경우 최대 수율을 관찰할 수 있다.
브라질레인의 순도 및 열 안정성을 HPLC(도 1a, 브라질레인의 물 추출물) 및 20 ul의 기준 부피를 이용한 GC 분석(도 1b, 브라질레인의 메탄올 추출물)으로 확인하였다. 정제된 결정을 용매에 재용해하였고 HPLC, GC-MS 및 MS-MS(도 1c)를 거쳤는데, 여기서 브라질레인의 분자량에 해당한 단일 주요 피크를 산출하였다. HPLC 프로파일 내의 각각의 피크의 면적 적분을 이용하여 생성물 농도를 추정하였다. 정제된 화합물의 구조를 도시된 바와 같이 GC 및 질량 분광 분석에 의하여 확인하였다.
실시예 2
브라질레인의 형광 방출 스펙트럼
도 2a에 도시된 바와 같이, 브라질레인의 메탄올 추출물은 450 ㎚(여기 파장 340 ㎚)에서 방출 최대인 형광 방출 스펙트럼을 갖는다. 도 2b는 브라질레인의 메탄올 추출물이 560 ㎚(여기 파장 491 ㎚)에서 방출 최대인 형광 방출 스펙트럼을 갖는 것을 도시한다. 이 데이터는 브라질레인을 이용한 핵산 검출을 자외선 투과조명기 및 겔 다큐멘테이션 시스템(gel documentation system)과 같은 기존 기술을 이용하여 효과적으로 촬영할 수 있다는 것을 암시한다. 형광 스펙트럼은 생체 내 이미징 및 공초점 현미경법에서 응용될 수도 있다.
실시예 3
브라질레인의 핵산 염색 활성
DNA의 형광 보조 시각화(fluorescence aided visualization)에서 브라질레인의 유용성을 규명하기 위하여, 50 내지 250 ng에 이르는 다양한 양의 DNA 사다리를 브롬화 에티듐(EtBr)(염색 부피 50 ㎖ 당 50 ㎍)(도 3a), 또는 SYBR® Gold(도 3b), 또는 tm(브라질레인의 메탄올 추출물)(1 mM 브라질레인)(도 3c) 또는 te(브라질레인의 에탄올 추출물)(1 mM 브라질레인)(도 3d)로 염색하였다. 도 3a 내지 3d로부터 tm 또는 te가 100 내지 250 ng의 DNA 농도인 EtBr 또는 SYBR® Gold보다 DNA를 더 밝게 염색한다는 것을 추정할 수 있다. 그러나, te 및 tm은 EtBr 또는 SYBR® Gold에 의하여 염색되지 않은 25 내지 50 ng의 DNA 농도를 효과적으로 염색할 수 있는데, 이는 시험된 농도에서의 브라질레인은 DNA의 형광 시각화를 위해 DNA를 염색하는데 효과적일 뿐만 아니라, 시험된 농도에서의 EtBr 또는 SYBR® Gold보다 더 민감하다는 사실을 암시하는 것이다.
브라질레인(tm)은 도 3e에 도시된 바와 같이 RNA(40 ng의 최소 RNA 농도, 최대 320 ng)를 염색할 수도 있다. 또한, 도 3e에서 알 수 있는 바와 같이, 브롬화 에티듐의 염색 민감도와 비교하여, tm은 (1 mM) RNA를 더 강렬하게 염색함을 알 수 있다(RNA는 TRIZOL 방법을 이용하여 대장균(E. coli)로부터 단리하였다; A260/A280 = 2.04; 수량 = 3000 ng/㎖).
브라질레인(염색 부피 50 ㎖ 당 1 mM)의 다양한 추출물들(tw: 브라질레인의 물 추출물; te: 브라질레인의 에탄올 추출물; tm: 브라질레인의 메탄올 추출물)은 도 3f에 도시된 바와 같이 PCR에 의하여 발생된 DNA 단편들을 효율적으로 염색할 수도 있다. 도 3f에서 알 수 있는 바와 같이, 브라질레인의 다양한 추출물들(tw, 또는 te, 또는 tm)은 100 내지 300 ng에 이르는 농도에서 2 kb 앰플리콘을 염색할 수 있는데(액면), 이는 브롬화 에티듐의 염색 효과에 필적할 만하다.
브라질레인은 도 4a 내지 4c에 도시된 바와 같이, 다양한 종류/형태의 핵산을 염색할 수도 있다. 도 4a는 0.2 내지 1 ㎎/㎖에 이르는 DNA 농도에서의 플라스미드 DNA의 염색을 도시한다. 도 4b는 브라질레인이 유전자 DNA(250 내지 500 ng가 시험됨)를 효과적으로 염색할 수 있다는 것을 보여준다. 브라질레인은 도 4c에 도시된 바와 같이 ssDNA를 염색할 수도 있다. 또한, 브라질레인(1 mM 브라질레인 저장 용액 1 ㎕/염색 용액 50 ㎖)은 도4d에 도시된 바와 같이 RNA를 염색할 수도 있다(레인 당 200 ㎍ RNA. 크기의 차이는 2 개의 상이한 RNA 제형들로 인한 것이다). 브라질레인 염료의 사용량은 1 mM였다.
실시예 4
브라질레인의 염색 민감도
아가로스 겔 중에서 브라질레인의 염색 민감도를 본 발명에서 이전에 기재된 바와 같이 메탄올(tm), 에탄올(te) 또는 물(tw)을 이용하여 추출된 브라질레인을 이용한 아가로스 겔 중에서 200 pg 내지 4 ng에 이르는 다양한 양의 DNA 단편들을 염색함으로써 측정하였다.
도 5a에서 알 수 있는 바와 같이, te(1 mM)(브라질레인의 에탄올 추출물) 및 tw(브라질레인의 물 추출물)은 1 ng DNA를 검출할 수 있다. 그러나, 브라질레인의 메탄올 추출물(tm)은 DNA 1 ng을 검출할 수 없다.
200 내지 800 pg에 이르는 더 낮은 DNA 농도에서(도 5b), tm, te, 또는 tw에 대하여 400 pg 정도의 낮은 DNA 농도에 대하여 밴드들을 볼 수 있지만, 더 낮은 농도에서는 신뢰할 수 있게 염색되지 않았는데, 이는 염료의 민감도는 약 200 pg 라는 것을 암시한다.
실시예 5
브라질레인 및 브롬화 에티듐(EtBr)의 형광 비교
널리 공통적으로 사용되는 화합물인 EtBr보다 더 나은 DNA 시각화 작용제로서 브라질레인의 우월성을 규명하고 입증하기 위하여, 다양한 브라질레인 추출물들 및 EtBr의 농도 의존성 형광을 평가하였다.
도 6a는 1 내지 20 μM에 이르는 농도에서 EtBr의 형광 세기를 도시하는데, 그 결과는 아래 표 2에서 표 형식으로 제시되어 있다.
EtBr 농도(μM) 형광 세기(AU)
1 <20
5 ~60
10 ~10
15 ~180
20 ~230
도 6b는 1 내지 20 μM에 이르는 농도에서 브라질레인의 메탄올 추출물의 형광 세기를 도시하는데, 그 결과는 아래 표 3에서 표 형식으로 제시되어 있다.
EtBr 농도(μM) 형광 세기(AU)
1 <50
5 ~200
10 ~380
15 ~520
20 ~800
도 6c는 1 내지 20 μM에 이르는 농도에서 브라질레인의 에탄올 추출물의 형광 세기를 도시하는데, 그 결과는 아래 표 4에서 표 형식으로 제시되어 있다.
EtBr 농도(μM) 형광 세기(AU)
1 <50
5 ~150
10 ~350
15 ~500
20 ~650
도 6a 내지 6c 및 표 2 내지 표 4로부터 알 수 있는 바와 같이, 브롬화 에티듐에 필적할 만한 농도의 브라질레인은 현저히 더 높은 형광 세기를 제공한다는 것을 용이하게 알 수 있는데, 이는 브라질레인이 브롬화 에티듐에 대한 우월한 대체물이라는 것을 암시하는 것이다.
실시예 6
브라질레인 형광에 미치는 pH의 영향
다양한 pH 조건 하에서 염료로서 브라질레인의 응용을 결정하기 위하여, 형광 세기에 미치는 5 내지 10에 이르는 pH 변화의 영향을 조사하였다(도 7a 내지 7f).
도 7a는 pH 5에서 브라질레인의 추출물(te)의 다양한 농도들(5 내지 25 μM)의 형광 세기를 도시한다. 도 7a에서 알 수 있는 바와 같이, pH 5에서, te의 형광 세기는 시험된 모든 농도들에서 매우 빈약한데, 이는 브라질레인은 적어도 시험된 다양한 농도에서 pH 5에서 지시약 염료로서 신뢰할 만큼 이용될 수 없다는 것을 암시한다.
도 7b는 pH 6에서 브라질레인의 에탄올 추출물(te)의 다양한 농도들(5 내지 25 μM)의 형광 세기를 도시한다. 도 7b에서 알 수 있는 바와 같이, pH 6에서, 약 40 AU의 최대 세기는 25 μM의 농도의 te에 대하여 관찰된다. 20 μM 농도에서의 te는 약 30 AU의 형광 세기를 나타낸 반면에, 나머지는 20 AU 미만의 세기를 나타낸다.
도 7c은 pH 7에서 브라질레인의 에탄올 추출물(te)의 다양한 농도들(5 내지 25 μM)의 형광 세기를 도시한다. 도 7c에서 알 수 있는 바와 같이, 25 μM 농도의 te는 약 110 AU의 세기를 나타낸 반면에, 20 μM 농도의 te는 약 80 AU의 세기를 나타낸다.
도 7d는 pH 8에서 브라질레인의 에탄올 추출물(te)의 다양한 농도들(5 내지 25 μM)의 형광 세기를 도시한다. 도 7d에서 알 수 있는 바와 같이, 25 μM 농도의 te는 약 250 AU의 세기를 나타낸 반면에, 20 μM 농도의 te는 약 180 AU의 세기를 나타낸다. 15 μM 농도의 te는 약 120 AU의 세기를 나타낸다.
도 7e는 pH 9에서 브라질레인의 에탄올 추출물(te)의 다양한 농도들(5 내지 25 μM)의 형광 세기를 도시한다. 도 7e에서 알 수 있는 바와 같이, 25 μM 농도의 te는 약 450 AU의 세기를 나타낸 반면에, 20 μM 농도의 te는 약 350 AU의 세기를 나타낸다. 15 μM 농도의 te는 약 250 AU의 세기를 나타낸 반면에, 10 μM 농도의 te는 약 150 AU의 세기를 나타낸다.
도 7f는 pH 10에서 브라질레인의 에탄올 추출물(te)의 다양한 농도들(5 내지 25 μM)의 형광 세기를 도시한다. 도 7f에서 알 수 있는 바와 같이, 25 μM의 농도의 te는 약 200 AU의 세기를 나타낸 반면에, 20 μM의 농도의 te는 약 150 AU의 세기를 나타내며, 15 μM의 농도의 te는 약 110 AU의 세기를 나타낸다.
종합적으로, 도 7a 내지 7f에 기초하여, 브라질레인(te)은 20 내지 25 μM의 농도에서 5 내지 10에 이르는 pH의 넓은 범위에 걸쳐서 사용을 위한 적당한 형광 염료라는 것을 이해할 수 있다. 브라질레인은 7 내지 9의 범위의 pH에서 가장 효과적인데, 이에 의하여 높은 형광 세기는 시험된 바와 같이 더 낮은 농도에서도 관찰된다.
실시예 7
브라질레인의 향상된 형광 활성
글리세롤과 같은 특정 분자들 또는 나트륨염 또는 마그네슘 염의 존재로 인하여, 형광 세기가 향상된다는 것을 놀랍게 그리고 예상외로 알게 되었다. 도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 브라질레인의 5 μM 메탄올 추출물(tm)은 약 200 AU의 최대 형광 세기를 부여했던 반면에, tm의 조합(브라질레인 및 글리세롤의 메탄올 추출물로서, wt% 에이지(age)는 약 25%이며, 브라질레인 wt%는 약 0.00003%이다)에서, 관찰된 형광 세기는 약 550 AU였는데, 이는 브라질레인 단독의 효과보다 약 2.75 배이다. 이러한 관찰된 향상은 글리세롤만 있을 때 DNA의 검출에 대하여 어떠한 현저한 형광 활성을 갖지 않기 때문에 예상 밖이며 놀라운 것이다.
또한, 금속 이온들이 보조제로서 작용하는 것으로 알려져 있으며, 안정한 착체들을 형성하거나 전하를 변경함으로써 분자들 내에서 형광을 향상시킴에 따라 브라질레인의 형광 세기에 미치는 이들의 영향에 대하여 다양한 금속 이온들을 평가하였다. 도 9에서 알 수 있는 바와 같이, (1 mM)의 농도의 브라질레인과 더불어, 100 μM의 농도에서 시험된 다양한 금속 이온들 중에서, 나트륨 및 마그네슘을 제외하고, 시험된 다른 이온들 중 어느 것도 tm(브라질레인의 메탄올 추출물)의 형광 활성을 향상시키지 않는다는 것이 관찰되었다. 사실상, 다른 이온들의 존재는 브라질레인의 형광 세기를 억제시키는 역할을 하는 것을 알 수 있다.
도 10에서 더 명백히 알 수 있는 바와 같이, 브라질레인(tm: 브라질레인의 메탄올 추출물) 농도가 1 mM인 10 μM의 농도의 나트륨 이온들(염화나트륨)의 존재 하에서, 형광 세기는 약 3 배 이상이다. 유사하게도, 도 11에 도시된 바와 같이 마그네슘 이온들(황산마그네슘)의 존재 하에서, 형광 세기는 tm(브라질레인의 메탄올 추출물)만으로 발생된 세기에 비하여, 약 4 배를 초과한다. 나트륨 또는 칼륨은 핵산의 검출을 보조할 수 있는 임의의 현저한 형광 성질을 부여한다는 것이 알려져 있지 않다.
이 수치들은 글리세롤 또는 나트륨 또는 칼륨 이온들의 존재가 예상외로 놀랍게도 브라질레인의 형광 세기에 있어서 명백한 상승적 증가를 일으킨다는 것을 전체적으로 보여주고 있다.
실시예 8
브라질레인의 세포 독성
돌연변이 유도물인 브롬화 에티듐에 대한 적당한 대체물로서 브라질레인의 안전성을 평가하기 위하여, 브라질레인 또는 브라질레인의 글리세롤과의 조합 또는 금속 이온들의 다양한 농도들을 HeLa 세포 생존율에 대하여 시험하였다.
MTT 검사는 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. 우선, 배양된 HeLa 세포들을 트립신 처리 후에 배지 중에 수집하였다. 배양액을 다른 20 ㎖ 배지들로 희석시켜 100 ㎕ 당 대략 10000 세포들까지 세포 수를 감소시켰다. 세포들을 혈색소계를 이용하여 계수하였다. 배양액 100 ㎕를 96-웰 플레이트의 각각의 웰 내에 취하여 하룻밤 동안 부착하도록 하였다. 다음날, HeLa 세포들을 상이한 농도의 브라질레인 (0.152 내지 10 μM)으로 24 시간 동안 처리한 이후에 37℃에서 4 시간 동안 MTT (브롬화 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸리움) 처리(4 ㎎/㎖)를 수행하였다. 자주색 결정이 생성한 것을 관찰하였고, 웰들로부터 배지를 서서히 흡인하였다. DMSO 200 ㎕를 첨가하여 결정을 용해시켰다. 암소에서 15 분 배양한 후에, 흡광도 측정은 540 ㎚에서 자외선-가시광선 분광광도계에서 수행하였다. 사용된 염료의 농도에 대하여 각각의 설정(미처리 및 처리)에 대한 세포 생존율을 플롯팅하였다.
도 12a에서, tw는 브라질레인의 물 추출물을 지칭하고, tw(글리세롤)는 브라질레인 및 글리세롤의 물 추출물을 지칭하고, tw+Na는 브라질레인 및 나트륨염의 물 추출물을 지칭한 반면에, tw+Mg는 브라질레인 및 마그네슘염의 물 추출물을 지칭한다. 도 12a에서 알 수 있는 바와 같이, 0.156 내지 10 μM에 이르는 농도에서 다양한 조합들을 시험하였다. 시험된 최대 농도(10 μM)에서도, 시험된 조합들 모두는 안전하였고, 세포 생존율에 현저히 영향을 주지 않는 것을 관찰할 수 있다.
도 12b에서, tm은 브라질레인의 메탄올 추출물을 지칭하고, tm(글리세롤)은 브라질레인 및 글리세롤의 메탄올 추출물을 지칭하고, tm+Na는 브라질레인 및 나트륨염의 메탄올 추출물을 지칭한 반면에, tm+Mg는 브라질레인 및 마그네슘염의 메탄올 추출물을 지칭한다. 도 12b에서 알 수 있는 바와 같이, 0.156 내지 10 μM에 이르는 농도에서 다양한 조합들을 시험하였다. 시험된 최대 농도(10 μM)에서도, 시험된 조합들 모두는 안전하였고, 세포 생존율에 현저히 영향을 주지 않는 것을 관찰할 수 있다. 도 12a 및 도 12b에 도시된 데이터는 브라질레인이 시험된 농도들에서 어떠한 세포 독성 효과 없이 사용될 수 있는 안전한 염료인 것을 보여주고 있다.
실시예 9
생물학적 시료들의 염색 방법
본 발명에 기재된 바와 같은 브라질레인 조성물(스테인)을 자외선 투과조명기 시스템(UV) 내에서 시각화를 위한 아가로스 겔 중에 DNA의 염색을 위해 이용할 수 있다. 로딩 전에 DNA로 스테인을 직접 로딩하거나; 또는 겔화 전에 아가로스에 스테인을 첨가하거나; 또는 전기영동 후에 겔에 스테인을 첨가함으로써 염색을 수행할 수 있다. DNA 이동 후 겔에 스테인(500 ng/㎖)을 첨가한 경우, 효과적인 DNA 결합을 위해 10 내지 30 분 정도 소요되는 브롬화 에티듐보다 현저히 빠른, 배양에 걸리는 30 내지 60초 내에 시각화를 수행할 수 있다는 것이 관찰되었다. 로딩 전 DNA와 직접 첨가되는 경우 DNA를 결합하는데 소요된 최적 스테인양은 250 pg DNA 당 50 ng인 것을 알게 되었다.
실시예 10
형광/공초점 현미경법
양파 상피 세포들 내에서 브라질레인으로 살아있는 세포 염색을 분석하기 위해 형광 현미경법을 이용하였다. 요약하면, 양파 껍질을 천천히 제거하여 투과성 세포 및 비투과성 세포의 2 개 부분으로 나누었다. 비투과성을 위해, 세포들을 물에 10 분 동안 침적한 반면에, 투과성을 위해, 세포들을 포르말린에 10 분 동안 침적하였다. 껍질들을 취하여 상이한 농도(500 nM 내지 1 mM)의 브라질레인의 메탄올 추출물에 담그고 암소에서 15 분 동안 배양되도록 하였다. 배양된 시료들을 취해 글래스 슬라이드 상에 놓고, 그 위에 커버슬립을 놓고 밀봉하여 시료의 건조를 회피하였다. 형광 현미경 하에서 슬라이드들을 시각화하였다. 도 13에서 알 수 있는 바와 같이, 10 μM 브라질레인은 양파 상피 세포의 핵들을 염색할 수 있는데, 이는 브라질레인은 세포들을 침투할 수 있고, 구체적으로는 최소한의 배경으로 세포 핵들을 균일하고 신뢰할 수 있게 염색할 수 있음을 나타내는 것이다. 세포 투과성은 브라질레인이 비투과성 세포에서 핵도 염색할 수 있기 때문에 필수 요건이 아니라는 것도 관찰하였다. 또한, 브라질레인의 모든 추출물들(앞에서 기재된 바와 같이 물, 에탄올, 아세톤 또는 이의 조합들)은 세포에서 핵을 염색할 수 있는 반면에, 도 13의 대표적 이미지는 최상의 결과들을 나타냈기 때문에 브라질레인의 메탄올 추출물을 도시하고 있다. 세포의 핵의 염색을 위해 요구되는 브라질레인의 농도에 대하여, 10 μM 브라질레인이 최적이라는 것을 추론하였다. 10 μM 미만의 농도는 희미한 형광 신호를 제공한 반면에, 10 μM 초과의 농도는 더 강한 노이즈와 배경을 제공한다.
실시예 11
형광 활성화 세포 분류(FACS)
FACS 분석을 이용하여 세포 사이클 연구에 적용할 수 있는 바와 같이, 고정 및 비고정 세포들로 염료 입수를 분석하였다. 살모넬라 세포들을 트립신을 이용한 적절한 방식으로 수거하였다. 세포 배양액 중 트립신처리된 세포들을 1300 rpm에서 5 분 동안 원심분리하여 세포들을 펠릿화하였다. 세포들을 고정시키기 위하여, 냉각된 70% 에탄올을 세포들에 첨가하였다. 4℃에서 30 분 동안 고정을 수행하였다. 200 ㎕의 브라질레인(메탄올 추출물)(저장 용액 1 ㎖ 당 50 ㎍ 부터). 세포들을 상온 1300 rpm으로 5 분 동안 다시 회전시키고 상청액을 따라 내었다. 세포들을 투과시키기 위하여, 1X 인산염 완충 식염수(PBS) 및 사포닌(0.1%)의 혼합물을 첨가하고 5 분 동안 배양하였다. 세포들을 원심분리하고 세포에 주어진 PBS로 세척하여 사포닌을 제거하였다. 세포들을 리보뉴클레아제(100 ㎍/㎖)의 1 ㎍/㎖ 작업 농도로 처리하여 DNA만이 염색되고, RNA는 염색되지 않음을 확인하였다. 에탄올 및 사포닌을 세포에 첨가한 것을 제외하고는, 비고정 세포들에 대하여 동일한 공정을 수행하였다. 상이한 농도의 브라질레인(500 nM 내지 10 μM)을 첨가하였고 상온에서 15 분 동안 배양하였으며, 튜브들을 FACS 분석을 거쳤다. 도 14b에 도시된 바와 같은 데이터는 브라질레인(5 μM)(포화 농도)은 전체 살아있는 박테리아 세포들의 96.8%에 들어가서, FACS 연구를 위한 브라질레인의 사용의 효능을 보여주었다는 것을 밝히고 있다(도 14a는 임의의 염료로 처리되지 않은 대조군 세포이다).
실시예 12
브라질레인을 이용한 살아있는 세포 염색
살아있는 세포들의 염색에서 브라질레인의 유용성을 결정하기 위하여, 효모 세포들을 1 mM 브라질레인으로 염색하고 40 X 배율의 공초점 현미경 하에서 관찰하였다. 세포들을 다양한 필터들 하에서 시각화하여 최적의 시각화 조건들을 규명하였다. 도 15a에 도시된 바와 같이, 녹색 필터는 세포들의 핵 물질의 희미한 시각화를 보여주고 있다. 도 15b는 세포들의 상 콘트라스트 이미지이다. 도 15c는 적색 필터를 이용하여 시각화된 세포들을 도시한 반면에, 도 15d는 원적색 필터를 이용한 세포들을 도시하고 있다. 도 15a, 15c 및 15d로부터, 적색 필터는 세포들(핵 물질)을 시각화하는데 가장 적절하다는 것을 암시하고 있다. 도 15e는 도 15a 내지 15d의 잠긴 이미지이다. 전체적으로, 이러한 일련의 도면들은 브라질레인이 살아있는 세포들 중에서 핵들을 염색하는 염료로서 이용될 수 있으며, 공초점 현미경의 적색 채널 내에서 시각화될 수 있음을 밝히고 있다.
실시예 13
형광 제자리 혼성화(FISH)
도 16에 도시된 바와 같이, 브라질레인은 FISH(업계에 알려진 표준 프로토콜)에 이용될 수도 있다. 도 16으로부터 추정되는 바와 같이, 10 μM 브라질레인은 인간 세포들의 염색체들을 효과적으로 염색할 수 있다.
전체적으로, 본 발명은 겔 염색, 살아있는 세포 염색, FISH, FACS 및 형광 현미경법과 같은 다양한 방법들을 이용하여, DNA 및 RNA와 같은 핵산의 시각화를 위한 염료로서 사용을 위한 브라질레인을 제공한다. 본 발명은 선행 기술에서 이용가능한 원천으로 보고되지 않은 캐살피니아 사판의 수피로부터 브라질레인의 용매 매개 추출의 비용 및 시간 효율적인 방법도 제공한다. 추가적으로, 놀랍게 그리고 예상밖으로, 본원에서 글리세롤, DMSO 또는 금속 염들과 같은 특정한 첨가제들의 존재 하에서, 브라질레인의 형광 세기는 상승적으로 향상됨이 관찰되고 개시되기도 하였다. 당해 명세서에 개시된 바와 같이 핵산 염료로서 브라질레인은 비독성이고, 고도로 민감하고, DNA 시각화를 위해 살아있는 세포들 중에서 이용될 수 있으며, 생존가능하고, 알려진 돌연변이 유도물인 브롬화 에티듐과 같은 다른 스테인들 또는 돌연변이 유도물이기도 하고 고가인 SYBR® Gold와 같은 스테인들보다 우월한 대체물이다. 그러므로, 본 발명의 조성물은 안전하고 더 민감한 대체물이다.

Claims (25)

  1. a. 브라질레인 ((6aS,11bR)-7,11b-디히드로-6H-인데노[2,1-c]크로멘-3,6a,9,10-테트롤);
    b. 물, 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매; 및
    c. 글리세롤, 염화나트륨, 황산마그네슘 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물을 포함하는 핵산의 검출을 위한 조성물로서,
    상기 조성물 중 염화나트륨 또는 황산마그네슘 중량 백분율은 0.0001% 내지 0.001%의 범위에 있으며,
    상기 조성물 중 글리세롤 중량 백분율은 25.2 내지 37.8%의 범위에 있는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물 중 브라질레인 중량 백분율은 0.000284 내지 0.0284%의 범위에 있는 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물 중 브라질레인 대 염화나트륨 또는 황산마그네슘 w/w 비율은 1:0.0035 내지 1:3.52의 범위에 있는 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물 중 브라질레인 대 글리세롤 w/w 비율은 1:887 내지 1:133098의 범위에 있는 조성물.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 시료 내에서 핵산의 시험관 내 또는 생체 내 검출에서 사용을 위한, 제1항에 따른 조성물.
  22. 제1항에 따른 조성물을 포함하는 핵산 염색 키트.
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
KR1020187001944A 2015-06-23 2016-06-23 생물학적 시료의 염색을 위한 식물 기반 염료, 추출 방법 및 이의 용도 KR102134979B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IN2080CH2015 2015-06-23
IN2080/CHE/2015 2015-06-23
PCT/IN2016/050196 WO2016207913A1 (en) 2015-06-23 2016-06-23 Plant based dye for staining of biological samples, extraction method and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180073547A KR20180073547A (ko) 2018-07-02
KR102134979B1 true KR102134979B1 (ko) 2020-07-17

Family

ID=56740280

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187001944A KR102134979B1 (ko) 2015-06-23 2016-06-23 생물학적 시료의 염색을 위한 식물 기반 염료, 추출 방법 및 이의 용도

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10590466B2 (ko)
EP (1) EP3313830A1 (ko)
JP (1) JP6843774B2 (ko)
KR (1) KR102134979B1 (ko)
CN (1) CN108349928A (ko)
WO (1) WO2016207913A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102111588B1 (ko) * 2018-08-16 2020-05-15 선문대학교 산학협력단 소목으로부터 브라질레인을 제조하는 방법

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1273576A (en) * 1987-09-16 1990-09-04 Patrick A. Beauchamp Topical treatment for diseased skin disorders
AU2001296558A1 (en) * 2000-10-03 2002-04-15 Oncopharmaceutical, Inc. Inhibitors of angiogenesis and tumor growth for local and systemic administration
CN100415306C (zh) 2003-03-26 2008-09-03 宝利策尼克斯有限公司 涂覆的牙齿植入物
CN1561950A (zh) * 2004-04-09 2005-01-12 寇之虹 以洋苏木提取物为染料的染发剂
KR100742265B1 (ko) 2005-12-09 2007-07-26 한국과학기술연구원 소목으로부터 브라질레인의 대량 제조 방법
KR100750657B1 (ko) * 2005-12-09 2007-08-20 한국과학기술연구원 소목 추출물 및 이로부터 분리된 화합물의 용도
CN101861168B (zh) * 2007-05-07 2014-07-02 米迪缪尼有限公司 抗-icos抗体及其在治疗肿瘤、移植和自身免疫病中的应用
EP2401036B1 (fr) * 2009-02-27 2016-08-17 L'Oréal Composition comprenant un colorant naturel et un alcool monohydroxyle aliphatique, coloration de fibres keratiniques la mettant en oeuvre
CN102241660A (zh) 2011-05-06 2011-11-16 南京泽朗医药科技有限公司 一种巴西苏木红素的提纯方法
CN102219771A (zh) 2011-06-07 2011-10-19 南京泽朗农业发展有限公司 一种从苏木中提取巴西苏木红素的方法
EP2734185B1 (en) * 2011-07-21 2019-04-10 L'oreal Dyeing process using a natural dye on keratin fibres that have undergone permanent reshaping
KR101400975B1 (ko) * 2012-05-24 2014-05-28 한림대학교 산학협력단 소목(Ｃａｅｓａｌｐｉｎｉａ ｓａｐｐａｎ Ｌ.) 물 추출물 잔사의 유효성분인 ｂｒａｚｉｌｅｉｎ의 여드름 예방 및 치료용 조성물
CN104274489B (zh) * 2013-06-05 2017-04-12 楼兰花 一种用于治疗肿瘤的联合用药物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Interdiscip Sci Comput Life Sci, 5(1): 53-59 (2013.04.19.)*
J Phys Chem A, 117(41): 10650-10660 (2013.09.19.)*

Also Published As

Publication number Publication date
US20180195109A1 (en) 2018-07-12
JP2018521645A (ja) 2018-08-09
WO2016207913A1 (en) 2016-12-29
JP6843774B2 (ja) 2021-03-17
KR20180073547A (ko) 2018-07-02
US10590466B2 (en) 2020-03-17
EP3313830A1 (en) 2018-05-02
CN108349928A (zh) 2018-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Paz et al. Production and release of yessotoxins by the dinoflagellates Protoceratium reticulatum and Lingulodinium polyedrum in culture
Luvisi et al. Xylella fastidiosa subsp. pauca (CoDiRO strain) infection in four olive (Olea europaea L.) cultivars: profile of phenolic compounds in leaves and progression of leaf scorch symptoms.
Medini et al. Antiviral-guided fractionation and isolation of phenolic compounds from Limonium densiflorum hydroalcoholic extract
Shokrzadeh et al. Cytotoxic and genotoxic studies of essential oil from Rosa damascene Mill., Kashan, Iran.
Edziri et al. Toxic and mutagenic properties of extracts from Tunisian traditional medicinal plants investigated by the neutral red uptake, VITOTOX and alkaline comet assays
Hani et al. Antioxidant and antimicrobial activities of jordanian Simmondsia chinensis (link) ck schneid
CN106715717A (zh) 使用有机溶剂除去抑制剂的核酸提取
Singh et al. Common techniques and methods for screening of natural products for developing of anticancer drugs
KR102134979B1 (ko) 생물학적 시료의 염색을 위한 식물 기반 염료, 추출 방법 및 이의 용도
Zhou et al. Up-regulation of phenylpropanoid biosynthesis system in peach species by peach aphids produces anthocyanins that protect the aphids against UVB and UVC radiation
Deighton et al. Malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in plant tissue cultures: LC-MS determination of 2, 4-dinitrophenylhydrazone derivatives
Abert-Vian et al. A novel idea in food extraction field: study of vacuum microwave hydrodiffusion technique for by-products extraction
Li et al. Seed coat phenolics and the developing silique transcriptome of Brassica carinata
Banfi et al. Antibacterial activity of leaf extracts from Combretum micranthum and Guiera senegalensis (Combretaceae)
Boaru et al. Toxic potential of microcystin-containing cyanobacterial extracts from three Romanian freshwaters
Dixit et al. Phytochemical characterization and cells based analysis of bioactive components of Nothapodytes nimmoniana (J. Graham)
Prabakaran et al. Screening of antioxidant, antimutagenic, antimicrobial activities and phytochemical studies on Sphaeranthus amaranthoides (Burm).
Umashankar et al. Isolation, purification and in vitro cytotoxicity activities of coumarin isolated from endophytic fungi, Alternaria species of Crotalaria pallida
Abir et al. In vitro comparative analysis of antibacterial activity of different fractions of Corchorus capsularis and Corchorus olitorius leaves extracts
Shimizu-Yumoto et al. Slantingly cross loading sample system enables simultaneous performance of separation and mixture to detect molecular interactions on thin-layer chromatography
Mihai et al. Estimation of flavonoid content in propolis by two different colorimetric methods.
de Souza Borges et al. DNA extraction and anatomic characterization in dried heartwood from Fabaceae species
dos Santos Alves et al. Antimicrobial, cyto and genotoxic activities of Equisetum hyemale
JP2015014589A (ja) 天然酸性色素中のタンパク質の分析方法
El Gendy et al. Pharmacognostical and biological investigation of Dioon holmgrenii De Luca, Sabato & Vázq. Torres, Dioon mejiae Standl. & LO Williams, and Dioon meorlae De Luca, Sabato & Vázq. Torres cultivated in Egypt

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
X091 Application refused [patent]
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)