KR20230099141A

KR20230099141A - 흑법사 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20230099141A
Application number: KR1020210188253A
Authority: KR
Inventors: 김성조; 황은미
Original assignee: 호서대학교 산학협력단
Priority date: 2021-12-27
Filing date: 2021-12-27
Publication date: 2023-07-04

Abstract

본 발명은 흑법사 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료에 우수한 효과를 보이는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 흑법사 추출물은 암세포의 사멸을 유도하고, 선택적으로 암세포의 증식을 억제할 수 있으며, 암세포에 LC3 단백질 축적을 유도하고, 암세포의 리소좀 활성을 억제함에 따라 암세포의 자가포식을 억제하는 효과가 있어, 암의 예방, 개선 또는 치료 효과를 발휘하므로 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물로 사용될 수 있다.

Description

흑법사 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating cancer with Aeonium arboreum as an active ingredient}

본 발명은 흑법사(Aeonium arboreum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

종양(tumor)은 흡연, 식습관, 화합물, 방사선, 유전 등으로 인해 생긴 돌연변이로 발병한다. 빠르게 성장하면서 주변 조직에 침습하고 신체에 퍼져나가는 전이 능력을 지닌 종양을 악성종양(malignant tumor) 또는 암(cancer) 이라고 한다. 국내에서는 모든 암 중에 위암(stomach cancer), 대장암(colorectal cancer), 소장암(small bowel cancer), 십이지장암(duodenal cancer) 및 췌장암(pancreatic cancer)을 포함하는 소화기암이 가장 많이 발병하는데, 중앙암등록본부에 의하면 국내 암 발생의 12.8%가 위암인 것으로 보고되었다. 위암은 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 감염, 염증, 흡연, 음주, 가공식품, 짜거나 자극적인 음식 등 주로 식생활 습관이 주요 원인이다. 따라서, 위암을 예방하기 위해서는 식습관을 개선하고 암을 예방하는 기능성 소재를 섭취하는 것이 중요하다.

위암은 간, 췌장, 십이지장, 혈관 또는 림프관을 통해 먼 장기로 전이되어 심각한 악성종양으로 진행될 수 있는데, 위암의 증상은 소화기 염증이나 소화불량과 구별하기 어려운 등의 이유로 발견이 늦을 수 있다. 위암의 치료효율을 개선하기 위해 국가적으로 무증상 성인에게도 위내시경검사 또는 위장조영검사를 지원하고 있으며, 최근 위암 수술 후의 완치율도 73% 수준으로 높아졌으나, 전이될 경우에는 향후 5년 생존율이 6%까지 낮아진다. 따라서 위암 전이를 억제할 수 있는 기술의 개발이 시급하다.

위암의 성장과 전이는 자가포식(autophagy)과 관련되어 있다. 자가포식은 세포 내에서 당, 지질, 세포 소기관 등을 분해하는 대사과정이다. 자가포식의 활성화는 위암 세포의 성장과 전이를 촉진하고 영양분이 적은 환경에서도 살아남게 한다. 자가포식은 ULK1(Unc-51 like autophagy activating kinase) 및 BECN1(Beclin 1)과 같은 단백질이 자가포식 개시 복합체를 형성해 시작된다. 따라서, ULK1의 발현을 억제하면 위암 세포의 증식을 억제할 수 있다(Cao, Yijing, et al. “Autophagy and its role in gastric cancer.”, Clinica Chimica Acta, 489(2019):10-20).

한편, 리소좀은 생체 분자의 분해에 필요한 효소를 포함하고 있어서 자가포식에 필요한 핵심 소기관이다. 리소좀 활성을 억제하는 것은 자가포식 억제와 암 치료에 효과적이다. 현재 리소좀 활성을 억제하는 항암제는 클로로퀸(chloroquine)이 있으나 간, 눈의 망막 등에 여러 부작용이 나타나고 있다(Ochsendorf, F. R., and U. Runne. “Chloroquine and hydroxychloroquine: side effect profile of important therapeutic drugs.” Der Hautarzt; Zeitschrift fur Dermatologie, Venerologie, und verwandte Gebiete 42.3 (1991): 140-146).

한편, 본 발명에서 사용된 소재인 흑법사는 대서양의 카나리아 제도와 모로코가 원산지이며, 포르투갈이나 스페인 등지 해안가 모래언덕에 자생하고 있다. 흑법사는 돌나무과 에오니움(Aeonium)속에 속하는 다육식물의 일종이다. 겨울에 이파리가 녹색인 상태로 성장하고 여름에 이파리 색이 짙은 자주색으로 변하면서 휴면한다. 이러한 흑법사의 잎에는 플라보노이드 성분이 함유되어 있고, 향수나 염료로 사용되고 있으며, 피부염에 외용제로도 사용되기도 한다.

최근 부작용 우려가 낮은 식물 유래 항암제, 예를 들어 일일초에서 발견한 빈블라스틴, 미국산 주목나무 껍질로 만든 탁솔 등이 사용되고 있으나 아직까지 위암세포에서 자가포식을 억제하여 암세포 증식과 전이를 모두 억제할 수 있는 의약품 소재는 보고된 바 없다. 이에 본 발명은 흑법사(Aeonium arboreum) 추출물의 암세포의 자가포식 억제 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였으며, 이는 암 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물로 사용될 수 있다.

KR

10-2021-0052837

A

본 발명은 흑법사 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료에 우수한 효과를 보이는 조성물을 제공하고자 한다. 상기 조성물은 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명은 흑법사 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 흑법사 추출물은, 바람직하게는 물, 탄소수 1 내지 탄소수 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 흑법사 추출물은, 바람직하게는 암세포에서 리소좀 활성을 억제하는 것이 좋다.

본 발명에 있어서, 상기 흑법사 추출물은, 바람직하게는 암세포에서 LC3 단백질의 축적을 유도하는 것이 좋다.

본 발명에 있어서, 상기 흑법사 추출물은, 바람직하게는 암세포의 자가포식을 억제하는 것이 좋다.

본 발명에 있어서, 상기 암은, 바람직하게는 위암, 대장암, 소장암, 십이지장암 및 췌장암 중 선택되는 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 흑법사 추출물은, 바람직하게는 ULK1, BECN1 유전자 발현을 감소시키고, p62 유전자 발현을 증가시키는 것이 좋다.

본 발명에 있어서, 상기 흑법사 추출물은, 바람직하게는 암세포의 전이를 억제하는 것이 좋다.

또한, 본 발명은 흑법사 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 흑법사 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료에 우수한 효과를 보이는 조성물을 제공한다. 본 발명의 흑법사 추출물은 암세포의 사멸을 유도하며, 암세포의 증식을 억제하고, 암세포의 리소좀 활성을 억제하며, 암세포에서 LC3 단백질 축적을 유도하고 ULK1, BECN1 유전자 발현을 감소시키고, p62 유전자 발현을 증가시켜 암세포의 자가포식을 억제하는 효과가 있어, 암의 예방, 개선 또는 치료 효과를 발휘한다.

도 1은 본 발명의 흑법사 추출물 처리에 따른 암세포 사멸 유도 효과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 흑법사 추출물 처리에 따른 암세포 증식 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 흑법사 추출물 처리에 따른 암세포의 리소좀 활성 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 흑법사 추출물 처리시 LC3 단백질 축적이 유도됨에 따른 암세포의 자가포식 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 흑법사 추출물 처리시 ULK1, BECN1의 발현이 감소하고, p62의 발현이 증가함에 따른 암세포의 자가포식 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 흑법사 추출물 처리에 따른 암세포 전이 억제 효과를 나타낸 도이다.

본 발명은 흑법사(Aeonium arboreum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

흑법사(Aeonium arboreum)는 다육식물의 일종으로, 검붉은 잎이 로제트를 이루고 노란 꽃이 피기 때문에 관상용으로 사육되고 있다. 본 발명은 Aeonium arboreum Schwarzkopf 또는 Aeonium arboreum Zwarzkopf로 알려진 보라색 품종의 흑법사를 이용하였다.

본 발명에 있어서, 상기 흑법사 추출물은, 흑법사의 잎, 줄기, 수피, 뿌리, 종자, 꽃, 열매 및 송이로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 추출용매를 이용하여 추출한 것이며, 바람직하게는 흑법사의 잎을 이용하는 것이 좋다.

본 발명의 흑법사 추출물은 암세포의 사멸을 유도하며, 선택적으로 암세포의 증식을 억제하여 암 예방, 개선 또는 치료 효과가 있음을 확인하였다.

또한 본 발명의 흑법사 추출물은 암세포에서 리소좀 활성 억제 효과를 보이며, LC3 단백질의 축적을 유도함에 따라 암세포의 자가포식을 억제하였다. 리소좀은 암세포의 자가포식에 필요한 핵심 소기관으로, 리조솜 활성을 억제함에 따라 암세포의 자가포식을 억제할 수 있다.

또한 본 발명의 흑법사 추출물은 암세포에서 ULK1, BECN1 유전자 발현을 감소시키고, p62의 발현을 증가시켰는데, ULK1과 BECN1는 자가포식 개시 복합체를 형성하는 주요 요소이며, p62는 자가포식이 결핍된 세포에서 발현이 증가하므로, 본 발명의 흑법사 추출물은 암세포의 자가포식 억제 효과가 있는 것을 확인하였다.

또한 본 발명의 흑법사 추출물은 암세포의 전이를 억제하여 암의 예방, 개선 또는 치료 효과가 있음을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 암은, 바람직하게는 위암(stomach cancer), 대장암(colorectal cancer), 소장암(small bowel cancer), 십이지장암(duodenal cancer) 및 췌장암(pancreatic cancer) 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된 “추출물”은 적절한 용매를 이용하여 흑법사로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다. 상기 흑법사로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 식품학/약학/화장품학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 정제수, 메탄올(Methanol), 에탄올(Ethanol), 프로판올(Propanol), 이소프로판올(Isopropanol), 부탄올(Butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알콜, 아세톤(Acetone), 에테르(Ether), 벤젠(Benzene), 클로로포름(Chloroform), 에틸아세테이트(Ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(Methylene chloride), 헥산(Hexane) 및 시클로헥산 (Cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법, 고온고압추출법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다. 바람직하게는, 100~120℃, 35~45 kPa에서 오토클레이브 등을 이용하여 10~20분간 추출하는 것이 좋다.

본 발명의 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(Thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(High performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다. 따라서, 본 발명에 있어서 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은, 유효성분 이외에 보조제(Adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 트윈(Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.

상기 약학 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화 될 수 있다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.

또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제제이며, 주사용 제제의 용매로서 물, 링거액, 등장성 생리식염수 또는 현탁액을 들 수 있다. 상기 주사용 제제의 멸균 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용할 수 있으며 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있다.

또한, 상기 주사용 제제는 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 건강기능식품 조성물은 유효성분인 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제(타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 하기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화 되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알콜 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 유효성분인 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물은, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 '건강기능식품 조성물'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강 기능성 식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강 기능성 식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강 기능성 식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강 기능성 식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀 기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강 기능성 식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강 기능성 식품은 본 발명의 유효성분의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

본 발명에 있어서, 실험은 개별적으로 3회 이상 수행되었으며, 3개 실험의 데이터를 mean ± Standard deviation(SD)로 표기했다. GraphPad PRISM software와 Microsoft Excel software를 사용해 데이터 분석을 수행했으며, 통계적 유의성(p 값)은 Two-tailed Student’s t-test 또는 ANOVA with Tukey’s multiple comparisons test를 사용해 계산되었다. p 값이 0.05 미만일 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하고, p 값이 0.05 미만일 경우 도면상에 *, 0.01 미만은 **, 0.001 미만은 ***, 0.0001 미만은 ****을 표시하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 보다 자세히 설명한다. 다만, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

<실시예 1> 흑법사 추출물의 제조

흑법사 잎 40 g을 증류수로 1회 세척하고, 증류수 120 ㎖를 가하여 110℃, 39.23 kPa에서 오토클레이브(Wiseclave WAC-60, Daihan Scientific, Wonju-si, Gangwon-do, Korea)로 15분간 추출한 뒤 0.2 μm syringe filter(Minisart, Sartorius, Goettingen, Germany)로 여과하여 흑법사 추출물을 제조하였다.

<실험예 1> 흑법사 추출물의 암세포 생존 억제 효과 확인

AGS 위암세포를 10%(v/v) 우태아 혈청 및 1%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 RPMI(Rosewell Park Memorial Institute) 1640을 사용하여 36.5 ℃ 및 5% CO₂ 조건에서 12시간 배양하였다.

상기 실시예 1에서 제조한 흑법사 추출물을 각각 0, 1, 3, 10, 30, 100 ㎍/㎖ 농도로 48시간 처리하였다. 배지 10%의 WST-8 cell viability assay reagent(Biomax, Seoul, Korea)를 넣고 2시간 배양한 뒤 micro plate reader(FilterMax F3; Molecular Devices, San Jose, CA, USA)로 450 nm 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 보듯이, 본 발명의 흑법사 추출물을 처리할 경우 AGS 위암세포의 생존률이 농도 의존적으로 감소하는 경향을 보였다. 특히 흑법사 추출물을 30 ㎍/㎖ 처리할 경우 AGS 위암세포의 생존률이 미처리 대조군(0 ㎍/ml) 대비 12.90 ± 3.44% 감소하였다. 즉, 본 발명의 흑법사 추출물은 암세포의 사멸을 유도하여 암 치료, 개선 또는 예방 효과가 있는 것을 확인하였다.

<실험예 2> 흑법사 추출물의 암세포 증식 억제 효과 확인

AGS 위암세포는 상기 실험예 1과 같이 12시간 배양하여 사용하였다. NIH/3T3 섬유아세포는 10%(v/v) 우태아 혈청 및 1%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)를 사용하여 36.5 ℃ 및 5% CO₂ 조건에서 12시간 배양하였다. AGS 위암세포와 NIH/3T3 섬유아세포에 상기 실시예 1의 흑법사 추출물을 30 ㎍/㎖ 농도로 처리하였다. 24시간 간격으로 새로운 배지로 교체한 뒤 다시 흑법사 추출물을 동일 농도로 처리하였다. 세포를 0.4%(w/v) trypan blue dye(Thermo Fisher Scientific)로 1분간 염색하고 혈구계산판(hemocytometer)으로 세포 수를 개수하여 세포성장곡선을 작성하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보듯이, 본 발명의 흑법사 추출물을 처리할 경우 AGS 위암세포의 세포 수가 현저하게 감소하는 것을 확인하였다. 특히 3일차에는 증류수 처리 대조군(vehicle)에 비해 세포 증식이 33.84 ± 3.15% 감소하는 것으로 나타났다. 반면 본 발명의 흑법사 추출물은 NIH/3T3 섬유아세포에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명의 흑법사 추출물은 정상세포에는 영향을 미치지 않으며, 선택적으로 암세포의 증식을 억제할 수 있음을 확인하였다.

<실험예 3> 흑법사 추출물의 리소좀 활성 억제 효과 확인

본 실험에서는 흑법사 추출물의 암세포에서 리소좀 활성 억제 효과를 확인하기 위해 LysoTracker Red DND-99 염색과 유세포분석을 통해 세포 내 리소좀 활성 수준을 측정하였다.

AGS 위암세포와 NIH/3T3 섬유아세포를 상기 실험예와 같이 12시간 배양하고, 상기 실시예 1의 흑법사 추출물을 각각 0, 1, 3, 10, 30, 100 ㎍/㎖ 농도로 24시간 처리하였다. 이후 LysoTracker Red DND-99를 50 nM 농도로 가하고 30분간 배양하였다. 배양된 세포를 PBS(phosphate buffered saline; pH 7.4)로 세척하고 Guava EasyCyte 유세포분석기(Merk)와 GuavaIncyte software(Merk)를 사용하여 LysoTracker-MFI(median fluorescence intensity)를 측정하였다. 대표 결과와 형광 수치는 FlowJo software를 사용해 얻어졌다. 실험 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보듯이, AGS 위암세포에 흑법사 추출물을 처리한 경우, 리소좀 활성은 10 ㎍/㎖ 농도에서 12.33 ± 0.58% 감소하였고, 30 ㎍/㎖ 농도에서 11.47 ± 1.53% 감소하였다. NIH/3T3 섬유아세포에 흑법사 추출물을 처리한 경우, 리소좀 활성은 10 ㎍/㎖ 농도에서 11.26 ± 1.52% 감소하였으며, 30 ㎍/㎖ 농도에서는 리소좀 활성이 미처리 대조군(0 ㎍/ml)과 유사한 정도로 회복되었다. 따라서 본 발명의 흑법사 추출물을 30 ㎍/㎖ 처리할 경우 AGS 위암세포의 리소좀 활성을 선택적으로 억제할 수 있었다.

<실험예 4> 흑법사 추출물의 LC3 단백질 축적 효과 확인

AGS 위암세포를 상기 실험예와 같이 12시간 배양하고, 상기 실시예 1의 흑법사 추출물을 30 ㎍/㎖ 농도로 24시간 처리하였다. 배양된 세포를 PBS로 세척하고 포름알데히드(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 고정 후 메탄올 처리를 하였다. 0.1%(v/v) Triton X-100으로 5분 동안 투과화하고 PBS로 세척하였다. 1%(w/v) bovine serum albumin을 포함한 PBS로 처리한 다음 anti-LC3 I/II antibody(sc-398822, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 처리하였다. PBS로 세척 한 후, 이차항체(A21424, Invitrogen)로 처리하였다. 다시 PBS로 세척한 다음, DAPI로 염색하였다. 형광현미경으로 형광을 확인하였으며, 결과를 도 4에 나타냈다.

도 4에서 보듯이, 본 발명의 흑법사 추출물은 AGS 위암세포에서 LC3 단백질의 축적을 유도하였다. LC3 단백질의 축적은 자가포식 결핍의 특징이므로, 본 발명의 흑법사 추출물은 암세포의 자가포식 억제 효과가 있는 것으로 판단하였다.

<실험예 5> 흑법사 추출물의 리조솜 활성 유전자 억제 효과 확인

본 실험에서는 흑법사 추출물의 위암세포에 대한 자가포식 관련 유전자 발현 억제 효과를 확인하였다.

AGS 위암세포를 상기 실험예와 같이 12시간 배양하고, 상기 실시예 1의 흑법사 추출물 30 ㎍/㎖와 vehicle(증류수)를 각각 24시간 처리하였다. 세포에서 총 RNA를 분리하기 위해 Trizol Reagent를 사용했으며, cDNA 합성은 WizScript cDNA synthesis kit을 사용해 제조사의 지침에 따라 수행하였다. mRNA 발현 분석은 qRT-PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction) 방법으로 측정하였다. StepOnePlus Real-Time PCR System, StepOne software 및 BioFACT SYBR Green qPCR Master Mix를 사용해 qRT-PCR을 수행하였다. ACTB(β-Actin) mRNA에 대비한 mRNA fold change는 2^(-ΔΔCt) 방법으로 계산되었다. qPT-PCR에서 자가포식 관련 유전자 증폭을 위한 프라이머 서열을 하기 표 1에 나타내었으며, 리소좀 활성 관련 유전자의 발현 결과를 도 5에 나타내었다.

Genes	Sequences (5’-3’)
ACTB (β-actin)	Fwd: AAGTGTGACGTTGACATCCGTAAA Rev: GCTAGGAGCCAGAGCAGTAATC
ULK1 (Unc-51 like autophagy activating kinase)	Fwd: GCAGCAAAGACTCCTGTGACAC Rev: CCACTACACAGCAGGCTATCAG
BECN1 (Beclin1)	Fwd: CAGCCTCTGAAACTGGACACGA Rev: CTCTCCTGAGTTAGCCTCTTCC
p62	Fwd: GCTCTTCGGAAGTCAGCAAACC Rev: GCAGTTTCCCGACTCCATCTGT

도 5에서 보듯이, AGS 위암세포에 흑법사 추출물을 처리한 경우, 대조군(vehicle) 대비 ULK1, BECN1 유전자 발현이 각각 49.71 ± 5.10%, 25.08 ± 4.88% 감소하였고, p62는 39.87 ± 10.02% 증가하였다. ULK1과 BECN1는 자가포식 개시 복합체를 형성하는 주요 요소이며, p62는 자가포식이 결핍된 세포에서 발현이 증가하므로, 본 발명의 흑법사 추출물은 암세포의 자가포식을 억제하는 것으로 나타났다.

<실험예 6> 흑법사 추출물의 위암세포 전이 억제 효과 확인

본 실험에서는 Matrigel invasion assay를 통해 흑법사 추출물의 위암세포 전이 억제 효과를 확인하였다. Matrigel(354480, Corning)을 사용하였으며, 제조사의 지침에 따라 수행하였다.

AGS 위암세포를 상기 실험예와 같이 12시간 배양하고, 상기 실시예 1의 흑법사 추출물 30 ㎍/㎖, cisplatin(1 ㎍/㎖) 및 vehicle(증류수)를 24시간 처리하였다. 24-well Matrigel well plate를 2시간 동안 재수화한 뒤, 20%(v/v) FBS 및 1%(v/v) 페니실린 스트렙토마이신이 보충된 DMEM을 하단 well에 추가하고 0.5 ㎖ 무혈청 DMEM의 세포를 상단 챔버에 추가하였다. 세포를 22시간 동안 배양하고, PBS로 세척 한 다음, 3.8% 포름알데히드로 고정하고, 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 세포를 PBS로 세척하고 면봉을 이용하여 침습되지 않은 세포를 제거하였다. 침습된 세포의 수를 측정하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에서 보듯이, AGS 위암세포에 본 발명의 흑법사 추출물을 처리한 경우, vehicle(대조군) 대비 전이된 세포 수는 32.73 ± 7.17% 감소하였으며, cisplatin(양성대조군)은 vehicle(대조군) 대비 58.80 ± 1.90% 감소하였다.

따라서 본 발명의 흑법사 추출물은 기존 항암제인 cisplatin과 같이 암세포의 전이를 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.

Claims

흑법사 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 흑법사 추출물은,
물, 탄소수 1 내지 탄소수 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 흑법사 추출물은,
암세포에서 리소좀 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 흑법사 추출물은,
암세포에서 LC3 단백질의 축적을 유도하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 흑법사 추출물은,
암세포의 자가포식을 억제하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 암은,
위암, 대장암, 소장암, 십이지장암 및 췌장암 중 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 흑법사 추출물은,
ULK1, BECN1 유전자 발현을 감소시키고, p62 유전자 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 흑법사 추출물은,
암세포의 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
흑법사 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.