CN103877129A - 抑制血管新生之医药组合物与圆柏萃取物用于制造抑制血管新生之药物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抑制血管新生之医药组合物，包括：一有效量之圆柏(Juniperus chinensis)萃取物为抑制血管新生的有效成分。上述抑制血管新生之医药组合物还可还包括一药学上可接受之载体或盐类。
Description
技术领域
本发明系关于一种抑制血管新生(angiogenesis)之医药组合物，且特别关于一种以圆柏(Juniperus chinensis)萃取物为有效成分之抑制血管新生之医药组合物。
背景技术
血管新生系指在原来已存在的血管旁附近，长出新生的血管的过程。在正常生理机制下，可以藉由促进血管新生传递讯息刺激下所产生的反应。例如，在伤口愈合或女性生理周期的过程当中，会有可控制性且大约维持1-2周的血管新生反应。然而，病理性的血管新生则不受正常生理机转所控制。血管新生的调控在人体具有相当重要平衡的角色，在强烈的血管新生的作用下，可能会造成糖尿病视网膜病变、风湿性关节炎，或是加速肿瘤的恶化与转移。此外，当过度抑制血管新生作用时，也可能会因为凝血功能的缺损导致出血、中风、心血管疾病等的出现，甚至影响病患的伤口愈合。
目前约有19种具抗血管新生的药物(angiogenesis inhibitor)在临床上使用，而这些药物所包含的适应症包含有：各种实体瘤(solid tumors)、老年性黄斑变性(age related macular degeneration)、脉络膜新生血管(choroidalneovascularization)、糖尿病性黄斑水肿(diabetic macular edema)、糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy)、眼部肿瘤(ocular neoplasm)、视网膜静脉阻塞(retinal venous occlusion)、毛细血管扩张(telangiectasis)等相关疾病。由于血管新生与多种疾病相关，因此血管新生的抑制剂开发在目前与未来都是相当重要的研究方向与开发领域。
发明内容
本发明提供一种用于抑制血管新生之医药组合物，包括：一有效量之圆柏(Juniperus chinensis)萃取物为抑制血管新生的有效成分。
本发明也提供一种圆柏萃取物用于制造抑制血管新生之药物的用途。
本发明还提供一种用于抑制血管新生之医药组合物，包括：一有效量之木脂体(lignan)为抑制血管新生的有效成分，其中该木脂体之分子式如式(I)所示：
其中R1为-H或-OCH3，R2为-H或-OH，R3为-H、-OH或β-O-葡萄糖苷(glucoside)，R4为-H或-OCH3。
附图说明
图1显示分萃物CBT-143-S-F6F7的制备流程。
图2利用层析管柱及活性导引方式将分萃物CBT-143-F6F7进行活性物质之分离纯化的制备流程。
图3A为化合物JC-5的1H光谱。
图3B为化合物JC-5的13C光谱。
图4显示亚太因之结构。
图5显示JC-5亚太因抑制血管网状结构形成之活性分析的结果。
图6A显示粗萃物CBT-143-S的HPLC指纹图谱。
图6B显示分萃物CBT-143-S-F6F7的HPLC指纹图谱。
图6C显示亚太因之标准品的HPLC指纹图谱。
图7显示粗萃物CBT-143-S对于HUVEC形成网状结构的抑制情形。
图8显示分萃物CBT-143-S-F6F7对于HUVEC形成网状结构的抑制情形。
图9显示粗萃物CBT-143-S之浓度与HUVEC之管柱形成的相对关系。
图10显示分萃物CBT-143-S-F6F7之浓度与HUVEC之管柱形成的相对关系。
图11显示分萃物CBT-143-S-F6F7对于HUVEC之移动的影响。
图12显示粗萃物CBT-143-S及分萃物CBT-143-S-F6F对于SK-Hep-1细胞之移动的影响。
图13显示粗萃物CBT-143-S及分萃物CBT-143-S-F6F7对于生长因子诱发的活体抗血管新生作用的影响。数据以平均值±标准差表示，p<0.05：*指与生长因子处理组相比较。
图14显示粗萃物CBT-143-S及分萃物CBT-143-S-F6F7对细胞培养液诱发的活体抗血管新生作用的影响。数据以平均值±标准差表示，p<0.05：*指与生长因子处理组相比较。
图15显示分萃物CBT-143-S-F6F7及粗萃物CBT-143-S对于活体内血管新生作用的影响（1.25倍放大）。
图16显示分萃物CBT-143-S-F6F7对于活体内血管新生作用的影响（4与8倍放大）。
图17显示粗萃物CBT-143-S及分萃物CBT-143-S-F6F7对于HUVEC细胞的增生的影响。
主要组件符号说明
S1～使粗萃物CBT-143-S固定于硅胶表面上；
S2～载入硅胶管柱中；
S3～以丙酮与正己烷（丙酮：正己烷＝1：2）对硅胶管柱进行冲提（F1～F7管）；
S3’～于S3之后以丙酮对硅胶管柱进行洗（F8管）；
S3”～于S3之后以甲醇对硅胶管柱进行洗（F9管）；
S4～利用正相(normal phase)薄层分析监测分段收集之冲提液，以丙酮：正己烷=2:3作为移动相，展开后利用10%H2SO4(EtOAc)染色并加热至105℃呈色，计算其主要呈色斑点之Rf值。
S4’～收集Rf为0.35～0.55之F6与F7管；
P1、P2、P3～快速效能层析；
P4～以甲醇再结晶；
P’～薄层色层分析；
1301、1401～含药滤纸。
为了让本发明之上述和其它目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图示，作详细说明如下：
具体实施方式
本发明提供一种以圆柏(Juniperus chinensis)萃取物为主要有效成分之用于抑制血管新生的医药组合物，其具有抑制血管新生之功效。
上述本发明之用于抑制血管新生的医药组合物，可包括，但不限于一有效量之圆柏萃取物，其中圆柏萃取物为抑制血管新生的活性成分。在一实施例中，本发明之用于抑制血管新生的医药组合物可还包括一药学上可接受之载体或盐类。
于本发明中，用于萃取圆柏萃取物之圆柏(Juniperus chinensis)的例子，可包括，但不限于真柏(Juniperus chinensis var.Shimpaku)、偃柏(Juniperuschinensis L.var.sargentii Henry)、圆柏（原变种）(Juniperus chinensis L.var.chinensis)、清水圆柏(Juniperus chinensis L.var.taiwanensis R.P.Adams & C.F.Hsieh)、龙柏(Juniperus chinensis L.var.kaizuka Hort.ex Endl.)、塔柏(Juniperus chinensis L.var.pyramidalis(Carr.)Hort.ex Rehd.)和/或银柏(Juniperus chinensis cv.Pfitzeriana Glauca)。在一实施例中，用于萃取圆柏萃取物之圆柏(Juniperus chinensis)为偃柏。
上述圆柏萃取物可萃取自圆柏的根、茎/干、枝、叶和/或其组合，但不限于此。在一实施例中，圆柏萃取物可萃取自圆柏的细枝叶。
于本发明中，用于萃取上述圆柏萃取物的一溶剂可包括醇类（例如，甲醇、乙醇或丙醇）、酯类（例如，乙酸乙酯）、烷类（例如，己烷）或卤烷（例如，氯甲烷、氯乙烷），但并不以此为限。在一实施例中，萃取溶剂为乙醇。
在一实施例中，本发明之圆柏萃取物的成分可至少包括一种指标成分，为亚太因(yatein)，具有抑制血管新生之功效。在另一实施例中，本发明之圆柏萃取物的成分可至少包括亚太因，具有抑制血管新生之功效。
于一实施例中，圆柏萃取物系萃取自偃柏，又此圆柏萃取物系以乙醇萃取而得。于此实施例中，上述圆柏萃取物的成分至少包括亚太因。于另一实施例中，圆柏萃取物系以乙醇萃取自偃柏的细枝叶而得。而于此实施例中，上述圆柏萃取物的成分至少包括亚太因。
本发明用于抑制血管新生之医药组合物系用于治疗一血管新生相关疾病。血管新生相关疾病的例子可包括实体瘤(solid tumors)、老年性黄斑变性(age related macular degeneration)、脉络膜新生血管(choroidalneovascularization)、糖尿病性黄斑水肿(diabetic macular edema)、糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy)、眼部肿瘤(ocular neoplasm)、视网膜静脉阻塞(retinal venous occlusion)、毛细血管扩张(telangiectasis)等，但不限于此。
本发明也提供一种以木脂体为主要有效成分之用于抑制血管新生的医药组合物。上述本发明之用于抑制血管新生的医药组合物，可包括，但不限于一有效量之木脂体，其中上述木脂体之分子式如式(I)所示：
其中R1为-H或-OCH3，R2为-H或-OH，R3为-H、-OH或β-O-葡萄糖苷(glucoside)，R4为-H或-OCH3。
在一实施例中，上述本发明之用于抑制血管新生的医药组合物，可包括还包括一药学上可接受之载体或盐类。
在一实施例中，上述木脂体可包括，但不限于亚太因、裂榄质素(5’-desmethoxyyatein或bursehernin)、7’,7’-dihydroxy bursehernin(7’,7’二羟基裂榄质素)、5’-甲氧基亚太因(5’-methoxyyatein)、西藏鬼臼脂醇(podorhizol) 及西藏鬼臼脂醇4’-o-β-D-吡喃葡萄糖苷(podorhizol4’-o-β-D-glucopyranoside)。在一示范实施例中，上述木脂体为亚太因。
于上述本发明用于抑制血管新生之医药组合物中，前述药学上可接受之载体可包括，但不限于溶剂、分散媒(dispersion medium)、套膜(coating)、抗菌与抗真菌试剂与一等渗透压与吸收延迟(absorption delaying)试剂等与药学投予相容者。对于不同的给药方式，可利用一般方法将药学组合物配置成剂型(dosage form)。
又，上述药学上可接受之盐类可包括，但不限于盐类包括无机阳离子，例如，碱金属盐类，如钠、钾或胺盐，碱土金族盐类，如镁、钙盐，含二价或四价阳离子之盐类，如锌、铝或锆盐。此外，也可是为有机盐类，如二环己胺盐类、甲基-D-葡糖胺，胺基酸盐类，如精胺酸、离胺酸、组织胺酸、麸胺酸醯胺。
本发明所制备出药物给药可以口服、非口服、经由吸入喷雾(inhalationspray)或藉由植入贮存器(implanted reservoir)的方式。非口服可包括(subcutaneous)、皮内(intracutaneous)静脉内(intravenous)、肌肉内(intramuscular)、关节内(intraarticular)动脉(intraarterial)、滑囊（腔）内(intrasynovial)、胸骨内(intrasternal)蜘蛛膜下腔(intrathecal)、疾病部位内(intralesional)注射以及灌注技术。
口服成分的形式可包括，但不限定于，药锭、胶囊、乳剂(emulsions)、水性悬浮液(aqueous suspensions)、分散液(dispersions)与溶液。
再者，本发明还提供一种圆柏萃取物用于制造用以抑制血管新生之药物的用途。
上述圆柏萃取物系萃取自一圆柏，而此圆柏可包括，真柏、偃柏、圆柏（原变种）、清水圆柏、龙柏、塔柏和/或银柏，但不限于此。在一实施例中，上述圆柏为偃柏。
于本发明中，上述圆柏的萃取部位可包括根、茎/干、枝、叶和/或其组合，但不限于此。在一实施例中，上述圆柏萃取物可萃取自圆柏的细枝叶。
此外，在一实施例中，适合用于萃取上述圆柏萃取物的溶剂的例子可包括醇类（例如，甲醇、乙醇或丙醇）、酯类（例如，乙酸乙酯）、烷类（例如，己烷）或卤烷（例如，氯甲烷、氯乙烷），但并不以此为限。在一实施例中，萃取溶剂为乙醇。
在一实施例中，上述圆柏萃取物的成分包含亚太因，其具有抑制血管新生之功效。
于一实施例中，圆柏萃取物系萃取自偃柏，又此圆柏萃取物系以乙醇萃取而得。于此实施例中，上述圆柏萃取物的成分至少包括亚太因。于另一实施例中，圆柏萃取物系以乙醇萃取自偃柏的细枝叶而得。而于此实施例中，上述圆柏萃取物的成分至少包括亚太因。
另外，本发明更提供一种木脂体用于制造用以抑制血管新生之药物的用途，其中该木脂体之分子式如式(I)所示：
式(I)，
其中R1为-H或-OCH3，R2为-H或-OH，R3为-H、-OH或β-O-葡萄糖苷，R4为-H或-OCH3；以及一药学上可接受之载体或盐类。
在一实施例中，上述木脂体可包括，但不限于亚太因(yatein)、裂榄质素(5’-desmethoxyyatein或bursehernin)、7’,7’-dihydroxy bursehernin(7’,7’二羟基裂榄质素)、5’-甲氧基亚太因(5’-methoxyyatein)、西藏鬼臼脂醇(podorhizol)及西藏鬼臼脂醇4’-o-β-D-吡喃葡萄糖苷(podorhizol4’-o-β-D-glucopyranoside)。在一示范实施例中，上述木脂体为亚太因。
【实施例】
A.偃柏(Juniperus chinensis L.var.sargentii Henry)之活性部位探讨与确认
将约10g之干燥偃柏细枝叶，润浸于8至10倍重量之溶剂（如：水、 乙醇、丙酮、乙酸乙酯或己烷）中，并将润浸之药材以沸点温度萃取1小时获得萃取液。之后，将萃取液以滤纸过滤，且浓缩到干后，混合纯水并以超音波震荡致成为悬浮液。然后将悬浮液进行冻干工程。
将上述冻干之粉末溶于适当之溶剂中，并进行体外抑制内皮细胞血管新生试验(in vitro anti-angiogenesis assay)。分析萃取物对于人类脐带静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)在细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)或生长因子减少(Growth factor reduced)Matrigel中形成网状结构的抑制能力，并根据其小管结构形成的程度进行积分以作为量化指标。结果如表1所示。
表1、以不同溶剂萃取之偃柏细枝叶部位之萃取物的指标成分含量以及抑制内皮细胞形成网状结构的活性
N.D：低于侦测极限
结果显示除了水萃取物无法抑制网状结构之形成（管柱形成(tubeformation)），其它溶剂萃取物皆可具抑制内皮细胞管柱形成的能力。
B.偃柏之乙醇萃取物的制备
1.粗萃物(CBT-143-S)萃取制程
由上述结果，选择偃柏之细枝叶作为萃取标的物，并选择乙醇作为萃取溶剂。将所获得之粗萃物命名为CBT-143-S，其制备方法如下：
(1)将偃柏细枝叶100克润浸于8至10倍重量之95%乙醇溶剂；
(2)将步骤(1)润浸之药材及溶剂以沸点温度萃取1小时，以金属筛网（孔径230网目(mesh)）过滤以获得萃取液；
(3)将步骤(2)所得之萃取液以滤纸[型号：5A(直径9CM，孔径7M，厚度0.22mm)；TOYO ROSHI CO.,LTD]过滤；
(4)将步骤(3)所得之滤液以回旋浓缩机浓缩至干，可得萃取物浸膏；
(5)将步骤(4)所得之浸膏混合纯水并以超音波震荡致成为悬浮液；
(6)将步骤(5)所得之悬浮液利用液态氮冷冻并进行冷冻干燥工程；
(7)冷冻干燥完成后收集产物，此产物即为粗萃物CBT-143-S。
2.分萃物(CBT-143-S-F6F7)之制备
为增加粗萃物的活性，将上述粗萃物CBT-143-S进行分离纯化。分离纯化方法如下，分萃物之制备流程参见图1：
(1)将CBT-143-S样品30克，利用干式充填法固定（即，CBT-143-S利用适当之溶剂溶解后，加入2倍重量（60克）之硅凝胶，混合均匀后利用真空回旋浓缩器将CBT-143-S均匀的固定至硅凝胶表面）（步骤S1）；
(2)以所含硅凝胶为CBT-143-S样品之15倍重的硅凝胶管柱（管柱硅凝胶为450克，充填于内径6公分之玻璃管柱，充填完后硅凝胶高28公分，干式充填基质充填至管柱后高4.5公分）来对CBT-143-S样品进行分离（步骤S2）；
(3)以丙酮：正己烷=1:2为起始移动相对管柱进行冲提，冲提3300mL结束，以试管每20ml分段收集冲提液（步骤S3）（F1～F7管）；
(4)以丙酮对硅胶管柱进行清洗（步骤S3’）（F8管）；
(5)以甲醇对硅胶管柱进行清洗（步骤S3”）（F9管）；
(6)利用正相(normal phase)薄层分析监测分段收集之冲提液，以丙酮：正己烷=2:3作为移动相，展开后利用10%H2SO4(EtOAc)染色并加热至105℃呈色，计算其主要呈色斑点之Rf值（步骤S4）；
(7)收集Rf值介于0.35~0.55之间之冲提液（步骤S4’）；
(8)将冲提液合并并以回旋浓缩机浓缩至干得到分萃物浸膏；
(9)将分萃物浸膏加入等重纯水，经由超音波震荡悬浮后以液态氮进行冷冻；
(10)进行冷冻干燥，产物冷冻干燥粉末即为分萃物CBT-143-S-F6F7；
(11)将所获得之分萃物CBT-143-S-F6F7进行细胞及动物活体活性评估。
3.活性成分之分离纯化与鉴定
利用层析管柱及活性导引方式将前述之分萃物CBT-143-F6F7进行活性物质的分离纯化。制备流程请参阅图2。参照流程图2，将CBT-143-S-F6F7作为原料，以条件P1进行分离并以条件P’进行检测合并浓缩干燥，可得含有JC-5活性成分的分划CBT-143-S-F6F7-A2；将此分划以条件P2进行分离并以条件P’进行检测合并浓缩干燥之后，可得主要含JC-5的分划CBT-143-S-F6F7-A2-B2；分划CBT-143-S-F6F7-A2-B2再经由条件P3的条件进行分离并以条件P’进行检测合并浓缩干燥及条件P4再结晶可得纯物质JC-5。条件P1至P4以及条件P’的说明如下：
P1：快速效能层析(flash performance liquid chromatography,FPLC)：
管柱:硅胶(silica gel)管柱(0.015~0.040μm)，2.0cm（内径）*30cm（长度）；移动相(mobile phase):乙酸乙酯(EtOAc):正己烷(n-hexane)=1:1；流速：5mL/分钟；分划收集器(fraction collector)：10mL/管。
P2：快速效能层析：
管柱：硅胶管柱(0.015~0.040μm),2.0cm（内径）*30cm（长度）；移动相：乙酸乙酯(EtOAc):正己烷=1:1.5；流速：5mL/分钟；分划收集器：10mL/管。
P3：快速效能层析：
管柱：硅胶管柱(0.015~0.040μm),1.5cm(内径)*30cm（长度）；移动相：乙酸乙酯(EtOAc):正己烷=1:1.5；流速：5mL/分钟；分划收集器：10mL/管。
P4：以甲醇再结晶。
P’：薄层色层分析(thin layer chromatography,TLC)：将正相薄层色层分析铝片(TLC Silica gel 60 F254,Merck)裁切为长度5公分，宽度7公分，并于离底部1公分之处以定量毛细管充填样品1uL。样品充填完成并干燥后置入展开槽中展开4公分（展开液：乙酸乙酯：正己烷=1：1），展开完成干燥后均匀喷洒呈色剂(10%H2SO4(EtOAc)并加热（105℃，5分钟），呈色完成后观察JC-5所在区间（Rf值：0.55~0.61，黑色斑点），收集含有此斑点的部分并进行浓缩干燥。
将纯物质JC-5以核磁共振光谱(NMR)方法进行鉴定。结果如图3A至3B所示。图3A为化合物JC-5的1H光谱，此光谱揭示化合物JC-5结构中 所含氢原子的数目，由其出现的位置(δ值)及积分值比值可推断出此结构中共含有24氢原子。而图3B为化合物JC-5的13C光谱，此光谱揭示化合物JC-5结构中共含有22碳原子。
将图3A及图3B所得之信息和文献[Ikeda,R.;Nagao,T.;Okabe,H.;Nakano,Y.;Matsunaga,H.;Katano,M.;Mori,M.Chem.Pharm.Bull.1998,46,871-874.]中有关亚太因的叙述及资料作比对，并将资料整理如表2，经由上述比对，确认化合物JC-5为亚太因。而亚太因之结构如图4所示。
表2、亚太因结构中所含氢原子及碳原子之分布
又，藉由使用Matrigel(BD,Cat.No.356231)作为基质，并观察HUVEC细胞于此基质上网状结构组合情形，来分析JC-5（亚太因）对于HUVEC网状结构的抑制情形。分析基准与条件如下所述。经由NIS element影像分析 软件（Nikon，代理商：国祥仪器），来计算网状结构总长，其中以未加药组所形成的网状结构作为100%，来分析JC-5对于HUVEC形成网状结构的抑制情形。
而经由上述抑制血管网状结构形成之活性分析结果发现，亚太因对于抑制管柱形成之IC50为0.335μM（图5）。因此确认亚太因为活性成份。
4.粗萃物(CBT-143-S)及分萃物(CBT-143-S-F6F7)之高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)指纹图谱
分析方法：
检品配置：将各约10mg之CBT-143-S及CBT-143-S-F6F67粉末，分别置于10ml之定量瓶中，之后添加95%乙醇定量至10ml，以超音波震荡使其完全溶解。
HPLC分析条件：
层析管柱种类：Cosmosil5C18-MS-II4.6*250；
流速：0.8ml/分钟；
观测波长:280nm；
移动相:A:0.1%H3PO4；B:CH3CN；C:MeOH
梯度：A/B/C=65/25/10（60分钟）→A/B/C=25/60/15（1分钟）→A/B/C=65/25/10（9分钟）。
分析结果：
图6A图与图6B分别显示粗萃物(CBT-143-S)及分萃物(CBT-143-S-F6F7)之HPLC品管分析图，可作为本发明标的物品管的参考。
利用上述纯化之亚太因(JC-5)纯物质，当作对照标准品，进行粗萃物(CBT-143-S)及分萃物(CBT-143-S-F6F7)之HPLC定性/定量分析方法开发，并与亚太因(yatein)对照标准品的HPLC指纹图谱（参见图6C）进行比对，由图6A与图6B可知，粗萃物(CBT-143-S)及分萃物(CBT-143-S-F6F7)皆具有JC-5活性成分之主要波峰。另外，一并对前述以不同溶剂萃取之偃柏之细枝叶的萃取物进行分析，其亚太因的含量显示于上方表1中。
5.粗萃物(CBT-143-S)及分萃物(CBT-143-S-F6F7)之体外(in vitro)活性 评估
(1)抑制血管网状结构之形成(tube formation)
藉由使用Matrigel(BD,Cat.No.356231)作为基质，并观察HUVEC细胞于此基质上网状结构组合情形，来分析粗萃物(CBT-143-S)及分萃物(CBT-143-S-F6F7)对于HUVEC网状结构的抑制情形。分析基准与条件如下所述。经由NIS element影像分析软件（Nikon，代理商：国祥仪器），来计算网状结构总长，其中以未加药组所形成的网状结构作为100%，来分析粗萃物(CBT-143-S)及分萃物(CBT-143-S-F6F7)对于HUVEC形成网状结构的抑制情形。
由实验结果显示，随着测试浓度增加，粗萃物(CBT-143-S)及分萃物(CBT-143-S-F6F7)对于抑制管柱形成(tube formation)的效果亦随之增加，并具有明显剂量依循性(dose-dependent)的效应（图7与图8）。
又，经计算后确认，粗萃物(CBT-143-S)及分萃物(CBT-143-S-F6F7)对于抑制管柱形成之IC50分别为0.221μg/ml与0.0123μg/ml（图9与图10）。此结果显示，透过纯化的方法，相较于粗萃物(CBT-143-S)，分萃物(CBT-143-S-F6F7)的活性可增加20.3倍。
(2)抑制内皮细胞移动之评估(HUVEC migration assay)
于BD transwell系统中，观察在有营养物质驱动下，HUVEC往下穿越膜(membrane)之移动情形。以不含血清物驱动为负控制组，并以含血清物趋动作为正控制组，来观察本发明萃取物对于内皮细胞移动的抑制情形，其中以结晶紫(crystal violet)进行细胞染色，以易于观察细胞移动的情形。结果显示，分萃物CBT-143-S-F6F7的确可抑制内皮细胞移动（图11）。
(3)抑制肝癌细胞移动之评估(Wound healing migration assay)
挑选具有高移动能力的肝癌细胞株SK-Hep-1进行测试。首先，将细胞接种在6-孔盘中。待细胞贴附后，利用200ul微量吸管头(tip)。于盘内刮出一条直线，且洗去直线内被刮除掉的细胞后，观察位于直线两侧细胞在24小时及48小时之后移动填补回来的情形（图12）。结果显示，在处以不同浓度的粗萃物(CBT-143-S)及分萃物(CBT-143-S-F6F7)时，细胞移动量皆会有所减少。
在第48小时结束观察，并立即将盘内的细胞进行MTT assay确认细胞 存活率。经由将细胞移动的比率与细胞的存活率相互比较，可得知粗萃物(CBT-143-S)及分萃物(CBT-143-S-F6F7)是否有抑制SK-Hep-1移动能力的效果存在。
根据本分析方法评估的结果，可以得知，随着测试时间增加时，粗萃物(CBT-143-S)及分萃物(CBT-143-S-F6F7)对于抑制SK-Hep-1细胞移动的效果亦随之增加（图12）。
6.粗萃物(CBT-143-S)及分萃物(CBT-143-S-F6F7)之活体(in vivo)抗血管新生实验
藉由皮下注射(subcutaneous injection)至BALB/c小鼠皮下，形成Matrigel拴子(plugs)，以评估试验物质能否抑制血管生长因子或Hep-3B条件培养液所诱发的血管新生的作用。
(1)活体抗血管新生实验(Matrigel plugs assay)
Matrigel由Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤(mouse sarcoma)纯化出来，含有丰富的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白，且含有血管生长所需的多种因子。Matrigel在室温及37℃的状态下，能聚合成固态胶状，可提供血管内皮细胞较佳的生长环境。
将Matrigel与血管生长因子(FGFb+VEGF)或是Hep-3B条件培养液(conditional medium,CM)（内含多种血管生长因子）混和后，再将试验物质混合入Matrigel内。
实施方法简述如下：
(a)动物品系：雌性BALB/c小鼠（BALB/cAnNCrlBltw，购自乐斯科公司），周龄6-8周。
(b)以Matrigel混合PBS处理之组别作为负控制组，并以Matrigel混合血管生长因子FGFb(500ng/ml)+VEGF(500ng/ml)或是Hep-3B条件培养液(CM)处理之组别作为正控制组。将试验物质混合至含有血管生长因子的Matrigel后，藉由皮下注射注入小鼠(BALB/c mice)皮下，并观察试验物质是否能够抑制Matrigel拴子内的血管新生作用。
(c)实验最后以QuantiChromTM Hemoglobin Assay Kit定量Matrigel中血红素含量以评估血管新生的数量。
经过14天后取下小鼠皮下之Matrigel拴子，并加入等量中性蛋白酶(dispase)于37℃反应16小时，以溶解细胞间质胶，之后离心14,000rpm10分钟，吸取上清液至另一微量试管。将50μl上清液与200μl HemoglobinAssay Kit内附的反应试剂混合后，于室温反应5分钟后，测定OD400nm吸光值。单位浓度换算为（（OD样本-OD空白组）/（OD校准-OD空白组））×100×n(mg/dL），100是校准(calibrator)浓度100μg/dL，n是稀释的倍数。
实验结果：
(a)生长因子诱导的活体血管新生的评估试验
在上述生长因子诱导的活体血管新生的评估试验中，在仅以PBS处理的负控制组中，植入小鼠皮下14天的Matrigel拴子，其中的血红素(hemoglobin)浓度接近背景値17.68±11.64(mg/dL)；然而在加入生长因子FGFb(500ng/mL)+VEGF(500ng/mL)后，于Matrigel拴子中可以发现明显血管新生的作用，且血红素浓度可达到52.64±26.18(mg/dL)。于口服每天投与Nexavar（30mg/kg/天）之组别中，血红素的含量有明显的减少至27.09±5.88(mg/dL)。于以粗萃物(CBT-143-S)(100μg/mL)处理之组别中，在Matrigel拴子中之血红素浓度为27.92±9.62(mg/dL)。而于分别以分萃物(CBT-143-S-F6F7)30μg/mL以及100μg/mL处理之组别中，Matrigel拴子所测得的血红素含量分别为56.70±5.58(mg/dL)以及25.08±9.59(mg/dL)。
结果显示，在较高浓度中粗萃物(CBT-143-S)以及分萃物(CBT-143-S-F6F7)具有血管新生的抑制作用潜力（图13）。
(b)Hep-3B人类肝癌细胞的浓缩培养液(CM)诱导的活体血管新生的评估试验
在Hep-3B人类肝癌细胞的条件培养液(CM)诱导的活体血管新生的评估试验中，在仅以PBS处理的负控制组中，植入小鼠皮下14天的Matrigel拴子，其中的血红素浓度为16.23±11.64(mg/dL)；然而在加入条件培养液后，于Matrigel拴子中可以发现明显血管新生的作用，且血红素浓度可达到52.61 ±13.14(mg/dL)。于口服每天投与Nexavar（30mg/kg/天）之组别中，血红素的含量有明显的减少至25.05±17.59(mg/dL)。于以粗萃物(CBT-143-S)(100μg/mL)处理之组别中，在Matrigel拴子中之血红素浓度为22.91±15.95(mg/dL)。而于分别以分萃物(CBT-143-S-F6F7)30μg/mL以及100μg/mL处理之组别中，Matrigel拴子所测得的血红素含量分别为51.49±8.97(mg/dL)以及20.61±7.52(mg/dL)。
结果显示，在较高浓度中粗萃物(CBT-143-S)以及分萃物(CBT-143-S-F6F7)具有血管新生的抑制作用潜力（图14）。
(2)活体(in vivo)抗血管新生实验(CAM assay)
将滤纸吸附待测药物或者PBS之后，放置于鸡胚胎的绒毛尿囊膜(chorioallantoic membrane,CAM)上，观察绒毛尿囊膜上血管的生长。
将无特定病原(specific-pathogen-free,SPF)之白色亨来鸡(White Leghorn)的鸡胚胎横向置于孵蛋器(37.3℃，RH55-60%)。于孵化期第4天(D4)以20G针吸出2.5mL蛋白，并于胚胎上方制造伪气室，之后将针孔及伪气室开口以3M透气胶带封住。于第七天(D7)以DMSO溶解待测药物，再以PBS稀释，各组别包括PBS对照组最终之DMSO浓度皆为1%，并以圆形滤纸 
Filter paper(直径6mm)(Toyo Roshi Kaisha,Ltd)吸附已稀释之待测药物，吸附体积为25μL。每个待测药物配制3个剂量别，分别为50、25及10μg/胚胎(embryo)。且于第七天(D7)将滤纸放置于尿绒毛膜上，而之后于第9天(D9)将尿绒毛膜以解剖显微镜SZX16(Olympus)物镜1.25倍照相。以滤纸为中心，在照片上标记4个同心圆（直径分别为7、8、9及10mm，4个同心圆圆周总长106.8mm，其即代表靠近滤纸的区域。藉由肉眼判读与同心圆交叉的血管总数（即为血管密度指数(vascular density index,VDI)）以评估血管新生。VDI越高表示血管越密集。同一照片之VDI分别由3个人判读后取平均值，各给药组之VDI分别与对照组比对以观察是否有显著差异。血管型态异常处则以物镜4倍与8倍照相观察。
实验结果：
由表2及图15得知，分萃物CBT-143-S-F6F7（25μg/胚胎）及粗萃物CBT-143-S（50μg/胚胎）皆会造成尿绒毛膜的血管新生明显减少。而由图 16发现，中、高剂量组（50及25μg/胚胎）的分萃物CBT-143-S-F6F7，的确会造成微血管结构改变。
表2、活体抗血管新生实验(CAM assay)的结果
7.粗萃物(CBT-143-S)及分萃物(CBT-143-S-F6F7)之在正常细胞之毒性测试
为探讨粗萃物(CBT-143-S)及分萃物(CBT-143-S-F6F7)之上述抑制活性效果是否因其本身的毒性所造成，将粗萃物(CBT-143-S)及分萃物(CBT-143-S-F6F7)进行正常细胞PBMC存活率分析及HUVEC之生长抑制分析，并以市售临床用药蕾莎瓦(sorafenib)等作比较，以作为参考。
(1)对PBMC正常细胞之毒性试验(Alamarblue细胞存活率试验)
Alamarblue为一种植物染剂，通常成蓝色，在细胞增殖时该染料被降解，由蓝色还原变成粉红色，在570nm可测得O.D值升高，反之，细胞死亡越多则测得之O.D值越低。
将PBMC细胞(1x105细胞/孔)接种于96孔盘，分别加入不同浓度（300、100、30、10、3与1μg/ml）之不同CBT-143-S及CBT-143-S-F6F7等样本。培养72小时后，再加入alamarblue试剂置于37℃，培养24小时，再以ELISAreader O.D570nm/600nm波长测吸光值。然后将侧得之O.D.值代入下列计算公式中，
λ1=570
λ2=600
(εOX)λ2=117,216（OX意指氧化反应）
(εOX)λ1=80,586
Aλ1=0.65测试孔洞之观察吸收值
Aλ2=0.36测试孔洞之观察吸收值
A0λ2=0.78正控制组孔洞之观察吸收值
A0λ1=0.19正控制组孔洞之观察吸收值
结果显示，在CBT-143-S及CBT-143-S-F6F7浓度为30ug/ml时，PBMC细胞的存活率(viability)仍然高于50%,显示其IC50大于30ug/ml（表3）。
表3、粗萃物CBT-143-S及分萃物CBT-143-S-F6F7对PBMC正常细胞之毒性试验
(2)对HUVEC生长之抑制分析
同样以Alarmablue分析方法评估细胞存活率。将HUVEC细胞(1x104细胞/孔)接种于96孔培养盘中。分别加入不同浓度之CBT-143-S及CBT-143-S-F6F7等样品于培养盘中，并纪录0小时及48小时后的吸光值以评估细胞生长是否受到测试物的影响。结果显示，CBT-143-S及CBT-143-S-F6F7对于HUVEC细胞生长的半抑制剂量(GI50)分别为0.52ug/ml及0.006ug/ml（图17）。根据上述可以得知，偃柏萃取物对于HUVEC的生长抑制现象甚为明显。
虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何 熟习此技艺者，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与润饰，因此本发明之保护范围当视后附之申请专利范围所界定者为准。
Claims (19)
1.一种抑制血管新生之医药组合物，包括：
一有效量之圆柏(Juniperus chinensis)萃取物为抑制血管新生的有效成分。
2.权利要求1所述之抑制血管新生之医药组合物，其中该圆柏包括真柏(Juniperus chinensis var.Shimpaku)、偃柏(Juniperus chinensis L.var.sargentiiHenry)、圆柏(Juniperus chinensis L.var.chinensis)（原变种）、清水圆柏(Juniperus chinensis L.var.taiwanensis R.P.Adams & C.F.Hsieh)、龙柏(Juniperus chinensis L.var.kaizuka Hort.ex Endl.)、塔柏(Juniperus chinensis L.var.pyramidalis(Carr.)Hort.ex Rehd.)和/或银柏(Juniperus chinensis cv.Pfitzeriana Glauca)。
3.权利要求1所述之抑制血管新生之医药组合物，其中该萃取物萃取自该真柏的根、茎/干、枝、叶和/或其组合。
4.权利要求1所述之抑制血管新生之医药组合物，其中该萃取物系以醇类、酯类、烷类或卤烷溶剂萃取而得。
5.权利要求1所述之抑制血管新生之医药组合物，其中该萃取物的成分包括亚太因(yatein)。
6.权利要求1所述之抑制血管新生之医药组合物，其中该圆柏为偃柏，而该萃取物系以乙醇萃取而得。
7.权利要求1所述之抑制血管新生之医药组合物，其中该萃取物系以乙醇萃取自该偃柏的细枝叶而得。
8.权利要求1所述之抑制血管新生之医药组合物，其中该用于抑制血管新生之医药组合物系用于治疗一血管新生相关疾病，该血管新生相关疾病包括实体瘤(solid tumors)、老年性黄斑变性(age related macular degeneration)、脉络膜新生血管(choroidal neovascularization)、糖尿病性黄斑水肿(diabeticmacular edema)、糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy)、眼部肿瘤(ocularneoplasm)、视网膜静脉阻塞(retinal venous occlusion)或毛细血管扩张(telangiectasis)。
9.权利要求1所述之抑制血管新生之医药组合物，还包括一药学上可接受之载体或盐类。
10.一种圆柏(Juniperus chinensis)萃取物用于制造抑制血管新生之药物的用途。
11.权利要求10所述之圆柏萃取物用于制造抑制血管新生之药物的用途，其中该圆柏包括真柏、偃柏、圆柏(Juniperus chinensis L.var.chinensis)（原变种）、清水圆柏、龙柏、塔柏和/或银柏。
12.权利要求10所述之圆柏萃取物用于制造抑制血管新生之药物的用途，其中该萃取物萃取自该圆柏的根、茎/干、枝、叶和/或其组合。
13.权利要求10所述之圆柏萃取物用于制造抑制血管新生之药物的用途，其中该萃取物系以醇类、酯类、烷类或卤烷溶剂萃取而得。
14.权利要求10所述之圆柏萃取物用于制造抑制血管新生之药物的用途，其中该萃取物的成分包括亚太因。
15.权利要求10所述之圆柏萃取物用于制造用以抑制血管新生之药物的用途，其中该圆柏为偃柏，而该萃取物系以乙醇萃取而得。
16.权利要求10所述之圆柏萃取物用于制造用以抑制血管新生之药物的用途，其中该萃取物系以乙醇萃取自该偃柏的细枝叶而得。
17.一种抑制血管新生之医药组合物，包括：
一有效量之木脂体(lignan)为抑制血管新生的有效成分，其中该木脂体之分子式如式(I)所示：
其中R1为-H或-OCH3，R2为-H或-OH，R3为-H、-OH或β-O-葡萄糖苷(glucoside)，R4为-H或-OCH3。
18.权利要求17所述之抑制血管新生之医药组合物，其中该木脂体包括亚太因、裂榄质素(5’-desmethoxyyatein或bursehernin)、7’,7’-dihydroxybursehernin(7’,7’二羟基裂榄质素)、5’-甲氧基亚太因(5’-methoxyyatein)、西藏鬼臼脂醇(podorhizol)或西藏鬼臼脂醇4’-o-β-D-吡喃葡萄糖苷(podorhizol4’-o-β-D-glucopyranoside)。
19.权利要求17所述之抑制血管新生之医药组合物，还包括一药学上可接受之载体或盐类。
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