CN111494439B - 鸦胆子脂溶性提取物在制备促进周围神经再生药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鸦胆子脂溶性提取物在制备促进周围神经再生药物中的应用。所述鸦胆子脂溶性提取物采用无水乙醇和乙酸乙酯混合溶液提取得到。本发明研究发现鸦胆子脂溶性提取物能促进周围DRG神经元神经突起生长，以及促进周围神经系统胶质细胞施万细胞的分裂增殖，提示鸦胆子脂溶性提取物具有促进周围神经再生的作用。

Description

鸦胆子脂溶性提取物在制备促进周围神经再生药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种鸦胆子脂溶性提取物，其成份具有促进周围神经再生的作用。

背景技术

苦木科植物鸦胆子(Brucea javanica L.Merr)为高2m左右的小乔木或落叶灌木，我国主要分布于南方沿海海南、两广与云南等地区的热带和亚热带。其干燥成熟的果实即为鸦胆子，外壳呈灰黑色质硬而脆，整体为长6-10mm两头稍尖的长圆卵形。破开后内有长4-7毫米直径3-5毫米，呈卵形的黄白色种仁，光滑而富有油性，无臭，味极苦，性寒。传统中医认为其功能主治：清热解毒，截疟，止痢，腐蚀赘疣。在《医学衷中参西录》中记载有治疟疾作用，在《广西中草药》中记载有治疗早期血吸虫病、治痔作用，在《纲目拾遗》书中记载有治疗治疣作用。近年来的研究多集中在其有很好的抗肿瘤作用。

苦木科植物鸦胆子主要化学成分有苦木内酯、黄酮、三萜及生物碱等多种类型。其中苦木内酯类是鸦胆子属植物的特征性成分，同时也是有效成分，主要包括：鸦胆子苦素(Bruceines A-H)，鸦胆子苦醇(Brusatol)，鸦胆子甙(Bruceosides A-G)，苦木素葡糖苷(Javanicosids A-L),苦木素(Javanicolids A-D),鸦胆子碱(Brucamarin)，鸦胆子酸(Brucedic acid)等。苦木内酯类化合物通常具有较强的抗肿瘤、抗疟、抗炎等活性。从苦木内酯类化合物中分离得到的鸦胆苦醇、双氢鸦胆苦醇、鸦胆子苷、双氢鸦胆子苷等是水溶性的有苦味的成分，是众多学者主要的研究对象。值得注意的是，水溶性苦木内酯类化合物也被认为是鸦胆子主要毒性的物质基础。

鸦胆子种子的油，在传统的草药学中被认为有抗肿瘤的作用。鸦胆子油的生物活性成分主要为油酸、亚油酸、四环三萜类物质和蒽醌。其脂肪酸组成主要包括棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸，目前并未见此类成分的毒性报道。有研究结果表明，鸦胆子的凋亡作用主要是通过线粒体途径和死亡受体通路进行的，通过抑制G0/G1细胞周期，抑制细胞生长。市面上常用的鸦胆子油乳口服液、注射液等主要的成分是精制鸦胆子油，以及精制豆磷酯以及甘油，用于肺癌、肺癌脑转移、消化道肿瘤以及肝癌的临床辅助治疗。

目前对苦木科植物鸦胆子的研究多集中在其抗肿瘤或皮肤科的腐蚀治疣等方面的作用，尚未发现有关于鸦胆子或其主要成份应用于神经系统相关疾病的报道。

发明内容

本发明研究发现鸦胆子脂溶性提取物能促进周围DRG神经元神经突起生长，以及促进周围神经系统胶质细胞施万细胞的分裂增殖，提示鸦胆子脂溶性提取物具有促进周围神经再生的作用。

本发明具体技术方案如下：

鸦胆子脂溶性提取物在制备促进周围神经再生药物中的应用。

本发明所述的鸦胆子脂溶性提取物为使用无水乙醇和乙酸乙酯混合溶液提取获得的活性成分。优选混合溶液中无水乙醇的体积百分为45％～85％，更优选混合溶液中无水乙醇的体积百分为75％。

进一步的，可采用超声波提取。优选超声波频率20kHz，功率为750W，时间为60min，料液比为1∶5g/mL。

本发明所述鸦胆子脂溶性提取物有效剂量为5～30mg/kg，更优选为15mg/kg。

本发明考察了本发明所述鸦胆子脂溶性提取物对神经细胞生长的作用。结果显示体外细胞培养浓度为20ng/mL时初步显示具有促进神经细胞生长的效应，随着浓度提高，作用逐渐变强，浓度为100ng/mL效果最显著。然而，在浓度500ng/mL时，出现显著的周围DRG神经元神经突起崩解和施万细胞增殖发生抑制的情况，具体的作用机制目前并不十分清楚。

本发明进一步考察了鸦胆子脂溶性提取物对坐骨神经功能恢复的促进作用。结果显示大鼠坐骨神经缺损模型的损伤局部硅胶管内加入鸦胆子脂溶性提取物5-30mg/kg剂量范围内，对坐骨神经功能恢复具有促进作用，最佳有效剂量为15mg/kg。但是，随着剂量增大至45mg/kg时，对坐骨神经功能恢复作用与阴性对照组生理盐水相比无显著差异。进一步说明其在动物体内亦需要应用合适的药物剂量才能达到促进周围神经再生的结果。

本发明优点：

本发明首次发现鸦胆子脂溶性提取物，尤其是用一定比例的无水乙醇和乙酸乙酯混合溶液结合超声波提取的脂溶性提取物，在特定的剂量范围下，具有促进体外培养的周围DRG神经元神经突起生长和促进周围施万细胞的增殖的作用。

本发明进一步地应用于大鼠坐骨神经缺损模型，考察鸦胆子脂溶性提取物促进坐骨神经功能恢复的作用。结果证实其在特定的剂量范围下，鸦胆子脂溶性提取物具有促进周围神经再生的作用。

实验结果表明，体外细胞培养的最佳有效浓度范围为20～100ng/mL，大鼠坐骨神经损伤模型的体内最佳有效剂量范围为5～30mg/kg。本发明关于鸦胆子脂溶性提取物作用的新发现，为临床治疗神经系统相关疾病，特别是对周围神经再生提供了新的研究方向。

附图说明

图1为CCK8检测鸦胆子脂溶性提取物的细胞毒性。

图2免疫组化检测鸦胆子脂溶性提取物对DRG神经元轴突生长的作用。(图2A不同剂量的鸦胆子脂溶性提取物对DRG神经元轴突生长的免疫组化染色形态图；图2B不同剂量的鸦胆子脂溶性提取物对DRG神经元轴突生长长度的柱形统计结果图)。

图3EdU染色检测鸦胆子脂溶性提取物对施万细胞的增殖作用。(图3A不同剂量的鸦胆子脂溶性提取物对施万细胞的增殖作用的EdU染色形态图；图3B不同剂量的鸦胆子脂溶性提取物对施万细胞增殖作用的柱形统计结果图)。

图4大鼠坐骨神经缺损模型应用鸦胆子脂溶性提取物后的坐骨神经功能指数。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1鸦胆子脂溶性提取物的制备

苦木科鸦胆子购自南通市中医院中药房，用去离子水洗净，烤箱60-65℃干烤2d后碾成粉末(300g)。精确称取鸦胆子干粉50g装入提取器皿中，室温(22℃)下，在不同浓度的无水乙醇和乙酸乙酯混合溶液中浸泡48h。分组：95％无水乙醇+5％乙酸乙酯；85％无水乙醇+15％乙酸乙酯；75％无水乙醇+25％乙酸乙酯；65％无水乙醇+35％乙酸乙酯；55％无水乙醇+45％乙酸乙酯；45％无水乙醇+55％乙酸乙酯；35％无水乙醇+65％乙酸乙酯；25％无水乙醇+75％乙酸乙酯；15％无水乙醇+85％乙酸乙酯；5％无水乙醇+95％乙酸乙酯。分别将不同浓度的浸泡液进一步超声波辅助提取，超声波频率20kHz，功率为750W，时间为60min，料液比为1∶5g/mL。所得溶液用Whatman1号滤纸滤过。经过旋转蒸发仪(Buchi rotavaporR-124)在减压下进行旋蒸，40℃浓缩，将大部分溶剂除去后得到不同提取溶液提取的鸦胆子种子的提取物fraction A(约18-23g)，-20℃冰箱保存备用。

实施例2不同浓度的无水乙醇与乙酸乙酯混合溶液的提取效果

为了检测不同浓度的无水乙醇与乙酸乙酯提取得到的鸦胆子脂溶性混合物对神经细胞生长的作用，实验以神经细胞株PC12细胞为观察模型。

PC12细胞用DMEM完全培养基(含10％马血清，5％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)培养皿中培养，置于5％CO₂、37℃培养箱内培养。每两天换一次液，待细胞生长至80％融合时传代。实验取对数生长期的PC12细胞，以5×10⁴/ml接种细胞于24孔培养板中，每孔400μl。24h后换成含1％马血清，1％胎牛血清的DMEM培养基。实验分别设阴性对照组即1％马血清，1％胎牛血清的DMEM培养基，和分别用不同浓度的无水乙醇与乙酸乙酯混合溶液的提取物100ng/mL处理的实验组。提取物培养3d后，倒置显微镜下观察PC12细胞的形态学变化，每组随机取50个细胞，测量其阳性细胞率，突起长度和突起数目。

表1结果显示，在用不同浓度无水乙醇与乙酸乙酯混合溶液制备的鸦胆子脂溶性提取物，处理PC12细胞3d后，75％无水乙醇+25％乙酸乙酯的组合制备的提取物对阳性细胞率，突起长度和突起数目，与Control阴性对照组即1％马血清，1％胎牛血清的DMEM培养基组比具有最为显著的促进神经细胞生长分化的作用(**p<0.01*p<0.05)。提示75％无水乙醇+25％乙酸乙酯是最佳的提取浓度组合。

表1不同浓度无水乙醇与乙酸乙酯混合溶液制备的提取物对PC12细胞作用

实验分组	阳性细胞率/％	突起长度/μm	突起数量
				Control	0.08±0.05	7.50±0.82	0.61±0.30
95％无水乙醇+5％乙酸乙酯	0.09±0.02	7.81±0.98	0.82±0.11
				85％无水乙醇+15％乙酸乙酯	0.22±0.08	9.22±1.42	1.21±0.12*
75％无水乙醇+25％乙酸乙酯	0.85±0.09**	22.48±2.05**	2.82±0.31**
				65％无水乙醇+35％乙酸乙酯	0.42±0.11*	12.34±1.64*	0.93±0.28
55％无水乙醇+45％乙酸乙酯	0.23±0.13	10.52±1.67	0.91±0.25
				45％无水乙醇+55％乙酸乙酯	0.21±0.12	8.98±1.32	0.89±0.32
35％无水乙醇+65％乙酸乙酯	0.17±0.06	8.21±1.42	0.81±0.15
				25％无水乙醇+75％乙酸乙酯	0.13±0.07	7.98±0.95	0.79±0.23
15％无水乙醇+85％乙酸乙酯	0.11±0.07	7.62±1.12	0.71±0.23
				5％无水乙醇+95％乙酸乙酯	0.06±0.05	7.55±0.92	0.51±0.38

实施例3鸦胆子脂溶性提取物的细胞毒性检测

将实施例1制得的鸦胆子脂溶性提取物冻干过夜(EYELAFDU-1200,Tokyo)，制得的粉末装入15ml离心管中，4℃保存。用无菌去离子水配制10μg/mL的溶液，8000g离心10min，然后将溶液配制成实验所需的各浓度，之后用0.2mm nylon syringe filter(Millipore,USA)过滤除菌，用于培养的PC12细胞株中进行细胞毒性测试。CCK8试剂盒购自日本同仁化学研究所。

取对数生长期的PC12细胞消化计数重悬，调整细胞密度为5×10⁵/mL，按每孔100μL接种于96孔板中；待细胞贴壁后，弃去培养基，0.01MPBS洗5min×2次。阴性对照组为1％马血清，1％胎牛血清的DMEM培养基组，各实验组分别加入不同浓度20ng/mL，100ng/mL和500ng/mL的鸦胆子脂溶性提取物，分别在培养细胞24h，48h和72h。轻柔弃去培养基，加入10％CCK8培养基混合液，每孔100μL CCK8(即每100μl体积培养基加入10μl的CCK8)继续培养2h。酶标仪450nm，测定各组吸光度OD值，按下列公式计算相对存活率(％)＝[(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)]×100％，每组设8个复孔。

图1为CCK8检测鸦胆子脂溶性提取物的细胞毒性结果。CCK8检测结果显示：鸦胆子脂溶性提取物低浓度20ng/mL和中浓度100ng/mL在实验观察的72h内都没有明显的细胞毒性作用，而鸦胆子脂溶性提取物高浓度500ng/mL从实验观察时间点24h即与低浓度20ng/mL和中浓度100ng/mL培养相比呈现显著的细胞毒性，提示高浓度的鸦胆子脂溶性提取物对神经细胞有细胞毒性。纵坐标显示的为实验组各浓度鸦胆子脂溶性提取物培养PC12细胞的细胞活力，均为与阴性对照组为1％马血清，1％胎牛血清的DMEM培养基组培养的PC12细胞活力的百分比。^**p<0.01。

实施例4鸦胆子脂溶性提取物对DRG神经元的促轴突生长作用

取孕15天SD大鼠，10％水合氯醛(0.2mL/100g)腹腔注射麻醉，备皮，75％的酒精喷洒消毒。将胚胎从子宫取出放入盛有预冷D-Hank’s液的无菌皿中，置于冰上，解剖显微镜下取出背根神经节，尽可能剥除神经节表面的筋膜。将背根神经节用眼科剪剪碎至约0.5mm³大小，0.25％的胰蛋白酶37℃消化15min，血清终止消化，离心后单细胞悬液以5×10⁵/mL的细胞密度种在放有圆玻片并预先包被PDL的24孔板中，置于37℃，5％CO₂培养箱，用含有10％FBS和90％DMEM培养。待细胞贴壁后换成阴性对照组为97％Neurobasal+2％B27+1％GluMAX培养基，各实验组分别加入不同浓度20ng/mL，100ng/mL和500ng/mL的鸦胆子脂溶性提取物，继续培养DRG神经元72h。

DRG神经元按上法培养72h后，吸去培养液，用0.01MPBS洗涤一次，加入4％多聚甲醛500μL，室温下固定30min，去除固定液，用0.01M PBS室温下洗涤10min×3次。用含10％羊血清、0.3％Triton X-100的0.01M PBS液在37℃条件下封闭60min，吸去封闭液。荧光免疫细胞化学分析：滴加一抗(goat anti-GAP-43polyclonal antibody，1:200)，4℃放置过夜，0.01M PBS洗涤10min×3次。滴加二抗(FITC donkey anti-goat IgG，1:200)，以Hoechst33342(5μg/ml)标记细胞核，室温、避光放置1h，0.01M PBS洗涤10min×3次。实验中设不加一抗的空白对照组，除步骤(3)以0.01M PBS代替goat anti-GAP-43polyclonalantibody，其余步骤同上。在激光共聚焦显微镜下(FITC激发波长：488nm，观察波长：500-535nm；Hoechst33342亚离子Ar激发波长：353-364nm，观察波长：460-480nm)，观察免疫荧光细胞化学检测结果。

图2为免疫组化检测鸦胆子脂溶性提取物对DRG神经元轴突生长的作用。(图2A不同剂量的鸦胆子脂溶性提取物对DRG神经元轴突生长的免疫组化染色形态图；图2B不同剂量的鸦胆子脂溶性提取物对DRG神经元轴突生长长度的柱形统计结果图)。图2结果显示，与阴性对照组为97％Neurobasal+2％B27+1％GluMAX培养基以及低浓度提取物培养的DRG神经元相比，浓度为100ng/ml鸦胆子脂溶性提取物对DRG神经元GAP-43标记的轴突数量明显增加，长度明显增长。而高浓度500ng/ml鸦胆子脂溶性提取物对DRG神经元并没有促进作用，并且生长作用甚至于不及低浓度20ng/ml鸦胆子脂溶性提取物。提示合适浓度中浓度100ng/ml鸦胆子脂溶性提取物对DRG神经元轴突生长有明显的促进作用。(**p<0.01*p<0.05)。

实施例5鸦胆子脂溶性提取物对施万细胞的促增殖作用

1.施万细胞的培养和纯化

取新生1-2天SD大鼠，冰冻麻醉后75％酒精消毒，经股骨后外侧肌间隙暴露分离取出坐骨神经，置于预冷HBSS溶液。解剖显微镜镜下仔细剔除神经外膜，放入200μl 1mg/ml胶原酶中剪碎，37℃消化30min，去除胶原酶加入0.125％胰酶37℃消化12min，终止消化，离心弃上清，以1×10⁶细胞密度种至预先用PDL包被的培养皿中，37℃，5％CO₂培养箱中24h内换成加含有阿糖胞苷(1:1000)培养液，待细胞长至80％融合时，纯化细胞。用0.125％的胰酶消化成细胞悬液，血清终止消化后加入anti-thy1.1(1:1000)冰上孵育2h,离心弃上清，加入含有250μl rabbit complement和750μl DMEM培养液(1:3)的混合液37℃1h,重悬后以3×10⁵细胞密度种至预先用PDL包被的培养皿中，同时在皿中加入2μM forsokolin和10ng/ml HRG，每3天换一次液。

2.EdU检测细胞增殖

不同浓度20ng/mL，100ng/mL和500ng/mL鸦胆子脂溶性提取物处理96孔板中施万细胞24h，广州锐博公司Cell-LightTM EdU DNA细胞增殖试剂盒检测，实验操作按说明书步骤操作。将细胞培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50μM EdU培养基；每孔加入100μL 50μM EdU培养基37℃孵育2h，弃培养基，PBS清洗5min×3次；每孔加入50μL4％多聚甲醛室温固定细胞15min，弃固定液；每孔加入50μL 2mg/mL甘氨酸孵育5min，弃甘氨酸溶液，PBS清洗5min×3次；每孔加入100μL渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)孵育10min，PBS清洗5min×3次；每孔加入100μL的

染色反应液，避光、室温孵育30min，弃染色反应液；加入100μL渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床清洗10min×3次，弃渗透剂；每孔每次加入100μL甲醇清洗5min×3次；加入5μg/mL Hoechst 33342反应液孵育30min后，弃染色反应液，PBS清洗10min×3次；每个样本随机选取5个20倍镜头下的低倍视野，Leica DC 300采集图像Leica QWin分析软件分析。

图3为EdU染色检测鸦胆子脂溶性提取物对施万细胞的增殖作用。(图3A不同剂量的鸦胆子脂溶性提取物对施万细胞的增殖作用的EdU染色形态图；图3B不同剂量的鸦胆子脂溶性提取物对施万细胞增殖作用的柱形统计结果图)。结果显示不同浓度鸦胆子脂溶性提取物处理原代培养的施万细胞，与阴性对照组和低浓度20ng/ml相比，浓度为100ng/ml鸦胆子脂溶性提取物能显著促进施万细胞的增殖；而浓度为500ng/ml时反而对施万细胞增殖起明显的抑制作用，提示鸦胆子脂溶性提取物在合适的浓度100ng/ml能显著促进施万细胞的增殖(Scale bar 20μm)。(**p<0.01*p<0.05)。

实施例6鸦胆子脂溶性提取物促进大鼠坐骨神经缺损模型的神经功能恢复

动物实验及分组：SD大鼠随机分为4组(每组9只)：阴性对照生理盐水Control组，实验组为不同剂量鸦胆子脂溶性提取物5mg/kg，15mg/kg，30mg/kg和45mg/kg。模型制备与药物处理：复合麻醉剂(0.2-0.3ml/100g)腹腔注射麻醉，左股骨部手术区域常规备皮、消毒、铺巾。取左股后正中切口，依次切开皮肤和筋膜，游离充分暴露坐骨神经行成10mm缺损，用硅胶管桥接坐骨神经。分别在硅胶管内加入Control阴性对照组即生理盐水，以及各实验组分别加入不同剂量的鸦胆子脂溶性提取物5mg/kg，15mg/kg，30mg/kg和45mg/kg，常规缝合关闭切口。模型制备以及其后的饲养观察均在SPF级屏障系统内进行。

坐骨神经功能指数(sciatic nerve function index,SFI)是评价坐骨神经再生及神经功能恢复的一个直观且可靠的指标。分别于术后4W、8W和12W行足迹实验。将大鼠放置于宽约15cm，高约15cm，长约80cm的通道中，将白色宣纸折叠成与通道等长、等宽，置于木盒通道底部。大鼠双侧后足蘸红色印油后即放入到通道的一端，待其自行走向通道的另一端，宣纸上每侧足留下4-5个足印，选取清晰的正常侧与术侧的足印，测量足趾宽度(normaltoe spread,NTS；experimental toe spread,ETS)；足印长度(normal print length,NPL；experimental print length,NPL)；中间足趾宽度(normal intermediary toe spread,NIT；experimental intermediary toe spread,EIT)。SFI以0为正常值，－100为神经完全断离的指标。SFI计算公式如下：

SFI＝-38.3×[(EPL-NPL)/NPL]+109.5×[(ETS-NTS)/NTS]+13.3×[(EIT-NIT)/NIT]-8.8

图4为大鼠坐骨神经缺损模型在应用不同浓度的鸦胆子脂溶性提取物后的坐骨神经功能指数。结果显示，在低剂量5mg/kg时已开始显示对神经功能恢复有促进作用，在中剂量15mg/kg时具有最为显著的促神经功能恢复的作用，在剂量为30mg/kg时仍在最佳剂量范围之内，均显著优于阴性对照生理盐水组。然而，高剂量45mg/kg与阴性对照组生理盐水相比无显著差异。本发明所述鸦胆子脂溶性提取物的体内最佳促周围神经再生剂量为15mg/kg。(**p<0.01*p<0.05)。

Claims (6)

1.一种鸦胆子脂溶性提取物在制备促进周围神经再生药物中的应用，其特征在于所述鸦胆子脂溶性提取物采用无水乙醇和乙酸乙酯混合溶液提取得到，混合溶液中，无水乙醇的体积百分比为45%～85%，所述促进周围神经再生为促进周围 DRG 神经元神经突起生长，以及促进周围神经系统胶质细胞施万细胞的分裂增殖。

2.如权利要求 1所述的应用，其特征在于无水乙醇和乙酸乙酯混合溶液中，无水乙醇的体积百分比为75%。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于采用超声波提取。

4.如权利要求 3 所述的应用，其特征在于超声波频率20 kHz，功率为 750W，时间为60min，料液比为1∶5g/mL。

5.如权利要求 1 所述的应用，其特征在于所述鸦胆子脂溶性提取物有效剂量为5～30mg/kg。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述鸦胆子脂溶性提取物有效剂量为15mg/kg。

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