CN101647801A - 一种四环三萜化合物在制备抑制血管新生药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种四环三萜化合物葫芦素E在制备抑制血管新生药物中的应用。所述葫芦素E可以抑制肿瘤血管新生,关节炎病变组织血管新生,新生血管性眼病,血管瘤病变组织血管新生,银屑病病变组织血管新生,实体瘤病变组织血管新生,血管瘤,Kaposi’s肉瘤病变组织血管新生,白血病、淋巴瘤、骨髓瘤血液癌症,Paget’s疾病血管新生。还提供了含有有效量的葫芦素E以及药学可接受成分的组合物在制备抑制血管新生药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种四环三萜类化合物葫芦素E(Cucurbitacin E)的新用途,具体涉及葫芦素E在制备抑制血管新生药物中的应用。
背景技术
血管新生,是在已有血管基础上生成新血管的过程。血管新生多个步骤:血管内皮细胞的增殖、迁移、侵袭以及微管形成、血管周细胞的补充和新基质膜的获得。
血管新生通常只发生在胚胎和胚胎发育后期,生殖周期和伤口愈合期。在病理状况下(固体肿瘤侵袭、迁移,糖尿病视网膜病,血管瘤,关节炎,银屑病和动脉硬化症等等),疾病与持续性的血管新生有关。
恶性肿瘤长期对人类健康造成极大威胁,肿瘤的生长分为血管前期与血管期,在血管前期,肿瘤主要依靠弥散作用获得营养,一般只能长至2~3立方毫米,如果长期不能获得更多营养,将处于休眠状态;肿瘤如果与血管相连,肿瘤获得更多的营养,肿瘤便以几何级数迅速生长并通过新生血管转移到其他器官,引起肿瘤转移,最终引起患者死亡。所以肿瘤生长和转移依赖于新生血管,抑制血管新生可以抑制肿瘤。
与传统的手术、化疗、放疗等治疗方式相比,抗血管新生疗法具有靶定于肿瘤灶的微血管内皮细胞而不是肿瘤本身、具有疗效明显、毒副作用小等诸多优点。它可以直接通过阻止血管新生蛋白与内皮细胞的作用而起效,也可以抑制内皮细胞增殖及其活性;直接通过抑制肿瘤的血管新生相关因子的产生,或者中和这些因子的作用。
世界上已经有多种血管新生抑制剂用于临床治疗恶性肿瘤,并有多种该类抑制剂处于临床前研究,利用血管新生抑制剂治疗肿瘤已经成为第四种治疗肿瘤的方法,具有广阔的前景。
由于血管新生与多种重大疾病相关,血管新生抑制剂也可以用来治疗其他血管新生相关疾病。
葫芦素E(Cucurbitacin E)为一种四环三萜化合物,主要分布于葫芦科植物中,在十字花科、玄参科等高等植物及一些大型真菌中也有发现。已有研究表明,葫芦素E具有抗肿瘤的作用,可以抑制糖尿病综合症,抑制抗体相关的肾小球炎,还可以治疗急性骨髓性白血病,但是目前还没有葫芦素E作为抑制血管新生药的报道。
发明内容
本发明的要解决的技术问题在于葫芦素E作为制备抑制血管新生药物中的新应用。本发明的葫芦素E(C32H44O8),分子量为540.7,白色六方品(甲醇),熔点、232~233℃。旋光度[α]D-59°,分子结构如式(1)所示。
本发明中所用的葫芦素E购于上海展舒科技有限公司。本发明在于葫芦素E在制备血管新生抑制药物中的应用,尤其是葫芦素E在制备抑制乳腺癌、结肠癌、淋巴瘤、急性骨髓性白血病、类风湿性关节炎、牛皮癣、糖尿病综合症、血管瘤等血管新生依赖性疾病中的相关应用。
本发明所述的抑制血管新生药物可以抑制肿瘤血管新生,关节炎病变组织血管新生,新生血管性眼病,血管瘤病变组织血管新生,银屑病病变组织血管新生,实体瘤病变组织血管新生,血管瘤,Kaposi’s肉瘤病变组织血管新生,白血病、淋巴瘤、骨髓瘤血液癌症,Paget’s疾病血管新生。
本发明所指的关节炎是类风湿性关节炎,炎性关节炎。所述眼病为新生血管性角膜疾病,新生血管性视网膜疾病,血管新生性虹膜疾病,新生血管性青光眼,新生血管性脉络膜疾病,新生血管性结膜眼病,生成血管型白内障,新生血管性玻璃体眼病,新生血管性视神经疾病。所述视网膜病为糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉闭塞,早产儿视网膜病变,视网膜动脉闭塞。所述脉络膜病为湿性老年黄斑病变。所述实体瘤包括原发性或继发性实体瘤。所述血管瘤包括多发性血管瘤,血管母细胞瘤,良性血管增生疾病。
本发明所述的抑制血管新生药物可以含有有效量的式(I)葫芦素E以及药学可接受成分的组合物。
根据本发明可以将治疗有效量的葫芦素E和药学上允许的任意一种辅料制成药物组合物,也可以添加其他与葫芦素E没有拮抗作用的抗血管新生药物。其制剂可以是药学上的任意一种剂型,包括但不限于片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、口服液、注射剂、脂质体等。
为实施本发明的方法,葫芦素E可通过口服、肠胃外、吸入式喷雾或通过植入式贮存器给药。“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜腔内、胸骨内、鞘内、病灶内及颅内注射或输入技术。
口服可用固体或液体状的剂量单位,如末剂、散剂、片剂、糖衣剂、胶囊剂、颗粒剂、悬浮剂、溶液剂、糖浆剂、滴剂、舌下含片等剂型进行给药。
末剂是将本发明化合物磨成适当的细度而制成。散剂是将本发明化合物磨成适当的细度,然后与同样细度的医药用载体(如载体、甘露糖醇之类可食性碳水化合物等)混合制成。根据需要,也可混入矫味剂、防腐剂、分散剂、着色剂、香料等物质。
胶囊剂是将如上所述制成粉末状的末剂和散剂或入片剂部分所述的颗粒化的物质填充到如明胶胶囊外壳中而制成。也可将润滑剂和助流剂等混合到粉末状物质中,然后在胶囊中进行填充操作。若添加助溶剂和崩解剂等,如聚乙二醇,碳酸钠,可改善胶囊摄取时的药效。
本发明公开了葫芦素E在制备血管新生药物中的应用,实验表明,葫芦素E在人脐带静脉内皮细胞增殖实验、迁移实验、侵袭实验(模拟体内的垂直迁移环境)、微管形成实验以及鸡胚尿囊膜血管新生等均有明显的抑制作用,可能可以用于制备抑制血管新生的药物。
附图说明
图1:葫芦素E抑制血管内皮细胞细胞的增殖
图1中,以p<0.05表示有显著差异;其中,*表示p<0.05;**表示p<0.01;***表示p<0.001。
图2:葫芦素E抑制血管内皮细胞细胞的体外划痕迁移照片
其中:A.对照;B.10nM葫芦素E
图3:葫芦素E抑制血管内皮细胞细胞的修饰的Boyden小室迁移照片
其中:A.对照;B.10nM葫芦素E
图4:葫芦素E抑制血管内皮细胞细胞的成管照片
其中:A.对照;B.0.1nM葫芦素E
图5:葫芦素E抑制鸡胚尿囊膜新生血管形成的照片
其中:A.对照;B.5μg/disc葫芦素E
图6:葫芦素E抑制肿瘤生长和血管新生
其中:A.对照;B.葫芦素E
具体实施方式
实施例1:葫芦素E抑制内皮细胞增殖
目的和原理:细胞增殖实验采用MTS方法。MTS方法是一种在活细胞中运用比色法确定细胞增殖数量的测定方法。NADPH脱氢酶将MTS四唑盐化合物转变成一种溶于组织培养液的一种有色物质,其颜色深浅与细胞株的活细胞数目在一定范围内高度相关。通过该模型可评价药物对细胞增殖能力的影响。
方法:将一定数量的内皮细胞悬液接种于96孔板中,分别加入含有不同浓度葫芦素E的培养基作用48~72小时,然后每孔加入20微升显色剂,孵育1~4小时,酶标仪上490nm处读出每个孔中的光吸收值。
结果与评价:与对照组相比,加入葫芦素E后,内皮细胞的增殖能力受到抑制,说明葫芦素E可以抑制内皮细胞的增殖。
实施例2:葫芦素E抑制血管内皮细胞细胞体外划痕迁移实验
目的和原理:细胞迁移实验又叫体外划痕实验。本实验通过在培养板中达一定密度的单层内皮细胞上制造划痕,在显微镜下观察,并记录下划痕边缘细胞朝划痕部位迁移的情况,来评价药物对内皮细胞迁移能力的影响。
方法:将一定数量的细胞接种于6孔板中,待细胞长至80%左右,用微量移液器的1ml的吸头在每孔中划一条线。用PBS将死细胞洗净,再加入含有VEGF以及含有不同药物浓度的培养基,于培养箱37℃培养约24小时左右,直至VEGF165组划痕区长满细胞。
结果与评价:在显微镜下观察并拍照,结果见图2(其中A为对照组;B为10nM葫芦素E),与对照组相比,给予葫芦素E后,内皮细胞的迁移受到抑制,说明葫芦素E可以抑制内皮细胞的迁移运动。
实施例3:葫芦素E抑制血管内皮细胞细胞修饰的Boyden小室迁移实验
目的和原理:内皮细胞的小室迁移实验采用Boyden小室。修饰的Boyden小室是一类可插入细胞培养板的培养皿,底层有孔径为8μm的多聚碳酸盐滤膜,在生长因子的诱导下细胞可以透过膜的一侧粘附于含有高浓度生长因子的另一侧。此实验可以检测药物对内皮细胞有阻力迁移能力的影响。
方法:向24孔板中加入0.1%的明胶于37℃孵育30分钟,弃去明胶,用PBS洗三遍。小室下部24孔板中加入含有10%血清和VEGF165内皮细胞培养基。小室中接入细胞,之后再加入50μL不同浓度的药物,于37℃ 5%CO2培养箱中孵育四小时。
结果与评价:四小时后,将小室内外的细胞培养液吸去,下层细胞迁移的细胞用4%多聚甲醛固定20分钟,用PBS洗三遍并吸干。之后用苏木精伊红染色20分钟,再用PBS将背景多余染料洗去,室温晾干。显微镜下拍照、统计。结果见图3(其中A为对照组;B为10nM葫芦素E组)与对照组比,给予葫芦素E后,内皮细胞迁移能力受到影响,说明葫芦素E可以抑制内皮细胞有阻力的迁移的能力。
实施例4:
葫芦素E抑制HMEC-1细胞成管实验
目的和原理:Matrigel(基质胶)是从EHS(Engelbreth-Holm-Swarm)小鼠肉瘤中抽提得到的可溶性的基底膜抽提物。在室温下,此Matrigel可聚合成一种具有生物活性的基质材料,作用与哺乳动物细胞基底膜类似,对于细胞的粘附和分化有效应作用。内皮细胞可以在Matrigel上融合形成微管。可以利用内皮细胞的这种特性来研究药物对血管形成的影响。
方法:将Matrigel铺到24孔板上,于37℃,5%CO2培养箱放置30分钟待其凝固。每孔加入相同体积的细胞和含不同浓度葫芦素E的培养基各500μl,混匀。于37℃ 5%培养箱中培养16-18h后在显微镜下观察微管形成情况,计算微管形成数量并进行统计学分析。
结果与评价:内皮细胞在Matrigel中生长16-18h后,细胞由原来的多角形变成长梭形,在Matrigel中延伸生长,单个细胞卷成管状并相互连接,形成三维网状结构。结果见图4(其中A:对照组;B:0.1nM葫芦素E)与对照组相比,给予葫芦素E之后,内皮成管过程受到影响,未能形成正常三维网络结构,说明葫芦素E可以抑制内皮细胞微管形成。
实施例5:葫芦素E抑制鸡胚尿囊膜血管新生
目的和原理:在鸡胚生长早期,其机体免疫系统尚未完全建立,处于对各种外来抗原免疫耐受阶段,对所加的测试药物不会产生排斥反应。将含药物的载体置于其表面,可观察到药物对鸡胚尿囊膜新生血管的影响。目前,是一种较为理想的研究血管生成的器官水平的活体模型。
方法:用1‰的新洁尔灭消毒种蛋外壳,之后将其置于恒温恒湿培养箱中孵育5天。在超净工作台中,用酒精棉擦拭其表面,在蛋壳钝端(气室端)用镊子轻敲并小心地开一个直径约1厘米的小口。通过开出的小孔观察胚胎所在的位置,向相反的方向剥除外壳,在血管稀疏的地方用镊子撕开气室膜从而露出尿囊膜。之前准备好加入不同浓度葫芦素E,直径为5毫米并经高压灭菌的圆形滤纸片,将滤纸片加在尿囊膜上两条大血管之间无血管或血管稀疏的区域。用灭菌的透明胶带封口。(A:对照组,不加葫芦素E;B:1μg/disc葫芦素E)
结果与评价:放入滤纸片的鸡胚放入孵育箱中继续孵育两天,揭去透明胶带,剥壳将尿囊膜尽量暴露,在体视显微镜下拍照。结果见图5。与对照组比较,给予葫芦素E之后,新的微血管生成受到抑制,说明葫芦素E可以抑制鸡胚尿囊膜新血管的生成。
实施例6:葫芦素E抑制肿瘤血管新生
目的和原理:在小鼠身上荷瘤,通过对肿瘤的不同处理,以发现在不影响小鼠正常生长的情况下,处理组和对照组肿瘤体积的区别,并通过对肿瘤的免疫组化实验,可观察肿瘤内血管的数量。此模型是比较可靠的动物体内模型。
方法:将一定数量的肿瘤细胞注射到小鼠皮下,当实体瘤成功的形成时(70mm3),分别对对照组和处理组进行治疗,同时每天监测其体重和肿瘤体积,40天后将肿瘤剥离,并将其用免疫组化的方法观察肿瘤内的血管。
结果与评价:40天后,将经过葫芦素E处理的对照组的小鼠肿瘤剥离,处理组肿瘤体积明显小于对照组,同时将肿瘤切片后发现,葫芦素E处理组的肿瘤的血管明显少于对照组,如图6所示。说明葫芦素E在小鼠体内具有抑制肿瘤血管新生的作用。
Claims (6)
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述抑制血管新生药物可抑制肿瘤血管新生。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述抑制血管新生药物可抑制病变组织血管新生。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述肿瘤血管新生包括白血病、淋巴瘤、骨髓瘤血液癌症的血管新生,Kaposi’s肉瘤病变组织血管新生,Paget’s疾病血管新生,血管瘤,血管瘤病变组织血管新生,实体瘤病变组织血管新生,多发性血管瘤,血管母细胞瘤,良性血管增生疾病。
5.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述病变组织血管新生包括关节炎病变组织血管新生,新生血管性眼病,银屑病病变组织血管新生。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,含有有效量的式(I)葫芦素E以及药学可接受成分的组合物在制备抑制血管新生药物中的应用。
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