CN109010350A - 长梗冬青苷在制备抗糖尿病皮肤溃疡药物中的应用及一种治疗糖尿病皮肤溃疡的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供长梗冬青苷：五环三萜糖苷化合物在制备治疗糖尿病皮肤溃疡药物中的应用。长梗冬青苷具有促成纤维细胞和血管内皮细胞增殖以及促血管内皮细胞迁移的功效，从而有效促进糖尿病大鼠皮肤溃疡的愈合，可用于治疗糖尿病皮肤溃疡。此外，还提供一种可用于治疗糖尿病皮肤溃疡的药物组合物，这种药物组合物含有长梗冬青苷或其药学上可接受盐，可制作成各种剂型以应对不同类型、不同病程发展下的糖尿病皮肤溃疡。

Description

长梗冬青苷在制备抗糖尿病皮肤溃疡药物中的应用及一种治 疗糖尿病皮肤溃疡的药物组合物

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及长梗冬青苷在制备抗糖尿病皮肤溃疡药物中的应用以及一种治疗糖尿病皮肤溃疡的药物组合物。

背景技术

糖尿病是一种严重威胁人类健康的代谢性疾病，而糖尿病皮肤溃疡是糖尿病最常见的并发症之一。罹患糖尿病皮肤溃疡的患者，其溃疡创面反复发作、经久不愈，严重者可出现肢端坏疽、脓毒血症，甚至截肢、死亡。目前糖尿病皮肤溃疡的治疗主要依赖抗生素类药物，抗生素能够治疗溃疡处的感染，却无法促进溃疡的愈合。而市面上，也缺乏能够有效促溃疡愈合的药物。因此，开发新型促糖尿病溃疡愈合药物具有广阔应用前景和重要社会意义。

长梗冬青苷是一种提取自冬青科冬青属的药用植物，其具有抗菌、抗炎、抗病毒、降糖等药理作用，同时具有毒副作用小的优点，是一种具有潜在开发前景的天然活性化合物。

目前市面上的冬青属药材，如：四季青和救必应等，在民间常被用于治疗烧伤和下肢溃疡，但是这些药材同时含有长梗冬青苷、紫丁香苷、救必应酸、β-香树脂醇、β-谷甾醇以及其它三萜皂苷等成分，化学成分复杂，治疗溃疡的有效成分仍不明确。此外，根据文献报道(高效液相色谱法测定救必应药材中具栖冬青苷的含量，特产研究2007，4：45-47)，救必应为已知的长梗冬青苷含量最高的药材，其在救必应中的含量仅有8.8％，无法表明长梗冬青苷一定为救必应治疗溃疡的有效成分。综上所述，对于本领域内研究人员而言，长梗冬青苷的促溃疡愈合作用，尤其是对糖尿病皮肤溃疡的治疗潜力仍不清楚，而市面上也还没有一种利用长梗冬青苷治疗皮肤溃疡的药物。

发明内容

本发明的目的在于填补现有技术存在的缺点和不足，提供了长梗冬青苷在制备治疗糖尿病皮肤溃疡药物中的应用以及一种治疗糖尿病皮肤溃疡的药物组合物。

长梗冬青苷在制备抗糖尿病皮肤溃疡药物中的应用，长梗冬青苷的化学式为：

一种治疗糖尿病皮肤溃疡的药物组合物，该组合物含有长梗冬青苷或长梗冬青苷在药学上可接受的其他盐类衍生物。

优选的，长梗冬青苷或长梗冬青苷在药学上可接受的盐类衍生物占组合物总质量的1％至5％。

本发明进一步设置为，该组合物还含有抗生素类药物。

优选的，抗生素类药物为莫匹罗星、红霉素、阿莫西林、克拉维酸钾、双氯青霉素、头孢氨苄、头孢唑啉、氨苄青霉素、舒巴坦、氯林可霉素、甲硝唑、氨曲南、哌拉西林、三唑巴坦、万古霉素和头孢他啶中的一种或多种组合。

优选的，药物组合物具有如下制剂形式：软膏剂、膜剂、气雾剂、注射剂、片剂、胶囊剂、滴丸剂、控释或缓释剂和纳米制剂。本发明可以组合物的形式通过经胃肠道给药，注射给药、呼吸道给药、皮肤给药、粘膜给药和腔道给药等方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，或制成液体制剂如水、油悬浮剂，或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。

长梗冬青苷在一定的剂量范围内能促进炎症细胞浸润和成熟，加快成纤维细胞和胶原细胞的生成，促进表皮细胞再生。因此，长梗冬青苷有助于溃疡处新生血管的形成，促进成纤维细胞增殖以及胶原纤维合成，从而促进皮肤溃疡愈合；此外，长梗冬青苷具有降血糖的功效，因此可将长梗冬青苷运用在治疗糖尿病皮肤溃疡中。而以长梗冬青苷为有效成分制作的药物组合物，在治疗糖尿病所致的皮肤溃疡中具有良好效果。

以下结合附图对本发明进行更进一步详细的说明。

附图说明

附图标记：DM：糖尿病溃疡空白乳膏处理组；2％PE：普通溃疡2％长梗冬青苷处理；5％PE：普通溃疡5％长梗冬青苷处理；control：糖尿病溃疡空白乳膏处理组；DM+2％PE：糖尿病溃疡2％长梗冬青苷处理；DM+5％PE：糖尿病溃疡5％长梗冬青苷处理；blood glucose：血糖；diabetes：糖尿病；HUVEC：人脐静脉内皮细胞；NIH-3T3细胞：成纤维细胞。

图1为长梗冬青苷对NIH-3T3细胞增殖的影响，与对照组相比：标注**表示为P＜0.01，标注***表示为P＜0.001；

图2为长梗冬青苷对人脐静脉内皮细胞增殖的影响，与对照组相比：标注 ***表示为P＜0.001；

图3为长梗冬青苷对人脐静脉内皮细胞迁移的影响(40×)；

图4为长梗冬青苷对人脐静脉内皮细胞迁移的促进作用，与对照组相比：标注*表示为P＜0.05，标注**表示为P＜0.01；

图5为注射STZ后大鼠体重变化；

图6为注射STZ后大鼠血糖变化；

图7为大鼠创面愈合情况；

图8为7d、14d、21d不同给药组大鼠创面愈合情况比较，与糖尿病溃疡空白乳膏处理组(DM)相比：标注*表示为P＜0.05，标注**表示为P＜0.01；与普通溃疡2％长梗冬青苷处理(2％PE)组相比：标注#表示为P＜0.05；

图9为大鼠皮肤溃疡组织HE染色比较(×100)；

图10为大鼠皮肤溃疡组织Masson染色比较(×100)；

图11为长梗冬青苷的化学结构式。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的实质，下面用实施例的形式提供长梗冬青苷治疗糖尿病皮肤溃疡的药理实验结果，说明其在制药领域的新用途。同时必须说明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

长梗冬青苷在制备抗糖尿病皮肤溃疡药物中的应用，长梗冬青苷的化学式为：

一种治疗糖尿病皮肤溃疡的药物组合物，该组合物含有长梗冬青苷或长梗冬青苷在药学上可接受的盐类衍生物。

优选的，组合物含有长梗冬青苷或长梗冬青苷在药学上可接受的盐类衍生物。长梗冬青苷可占药物制剂总质量的1％-99％，优选的，占组合物总质量的 1％至5％。

优选的，组合物还含有抗生素类药物。

优选的，抗生素类药物为莫匹罗星、红霉素、阿莫西林、克拉维酸钾、双氯青霉素、头孢氨苄、头孢唑啉、氨苄青霉素、舒巴坦、氯林可霉素、甲硝唑、氨曲南、哌拉西林、三唑巴坦、万古霉素和头孢他啶中的一种或多种组合。

优选的，药物组合物具有如下制剂形式：软膏剂、膜剂、气雾剂、注射剂、片剂、胶囊剂、滴丸剂、控释或缓释剂和纳米制剂。

以下提供实施例1至实施例3以说明长梗冬青苷对细胞增殖、细胞迁移的影响。

实施例1：长梗冬青苷对成纤维细胞的促增殖作用

取对数生长期的成纤维细胞，调整细胞浓度为1×10⁵个/mL，接种于96孔培养板中，每孔100μL，在37℃含5％CO2的培养箱中常规培养24h。细胞同步化接种后，给药组加入不同浓度的化合物，分别为5μg/mL、12.5μg/mL、25 μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL，空白对照组加相同体积的DMSO。

继续培养24h后，尽量在避光的条件下每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL。 37℃继续培养4h后，吸弃各孔中培养基与MTT混合液，加入每孔DMSO 150μL，室温振荡混匀10min，使结晶充分溶解，用酶联免疫检测仪于490nm波长处测定其吸光度，其吸光度为A值。空白孔调零。每组浓度设3个复孔，实验重复3 次，计算细胞增殖率：增值率＝实验组A值/对照组A值×100％。

如图1所示，在一定浓度范围内长梗冬青苷对成纤维细胞均有促增殖作用，且在50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL浓度下，细胞存活率分别为123.40％，131.94％，138.56％，作用显著且呈浓度相关性。故而，长梗冬青苷可显著促进成纤维细胞增殖。

实施例2：长梗冬青苷对人脐静脉内皮细胞的促增殖作用

取对数生长期的人脐静脉内皮细胞，调整细胞浓度为1×10⁵个/mL，接种于 96孔培养板中，每孔100μL，在37℃含5％CO2的培养箱中常规培养24h。细胞同步化接种后，给药组加入不同浓度的化合物，分别为5μg/mL、12.5μ g/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL，空白对照组加相同体积的DMSO。继续培养24h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL。37℃继续培养4h后，吸弃各孔中混合液，每孔加入DMSO 150μL，室温振荡混匀10min，用酶联免疫检测仪于490nm波长处测定其吸光度，其吸光度为A值。空白孔调零。每组浓度设3个复孔，实验重复3次，计算细胞增殖率。

如图2所示，长梗冬青苷在一定范围内对人脐静脉内皮细胞生长有促进作用，且在100和200μg/mL浓度下，人脐静脉内皮细胞存活率分别为123.37％， 142.86％，增殖作用显著。可见，长梗冬青苷可有效促进血管内皮细胞增殖。

实施例3长梗冬青苷对人脐静脉内皮细胞细胞促迁移作用的测定

取人脐静脉内皮细胞用胰酶消化计数，按5×10⁴个接种于24孔板，加入含 10％胎牛血清的细胞培养液，在37℃含5％CO₂的培养箱中常规培养24h。待细胞长至90％，换含1％胎牛血清培养基饥饿处理12h，用无菌200μL的移液器枪头比对直尺在细胞层垂直做划痕，建立体外细胞创伤模型，PBS反复冲洗直至划痕区干净，加入含不同浓度长梗冬青苷的正常培养基，药物终浓度为25μ g/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL，置于37℃含5％CO2的培养箱中常规培养24h。分别在0h，24h于倒置显微镜下观察各浓度干预组细胞的迁移情况并拍照记录，利用Image pro plus软件计算指定划痕区域愈合面积，愈合率＝(初始划痕面积-现划痕面积)/初始划痕面积×100％，每个浓度设6个复孔，实验重复3次。

实验结果如图3，4所示，24h后细胞划痕区相对距离明显减小，且长梗冬青苷各剂量组划痕区域面积随浓度增加面积不断减小，呈现出明显的浓度依赖性。可见，长梗冬青苷可显著促进血管内皮细胞迁移。

为了更好地说明含有长梗冬青苷的药物组合物的制作方法，以下提供一个实施例4。。

实施例4：长梗冬青苷乳膏剂的制备

根据不同浓度要求取不同质量长梗冬青苷。再取水相成分：月桂醇硫酸钠 0.2g，尼泊金乙酯0.02g，甘油1.0g，蒸馏水适量，混合于蒸发皿中，置水浴加热至70—80℃，搅拌至完全溶解。取油相成分：硬脂醇1.8g，白凡士林 2.0g，液状石蜡1.3mL，置于蒸发皿中，置水浴加热至70—80℃，搅拌至完全溶解。在搅拌下将水相成分以细流状加入油相成分中，在水浴上继续保持恒温并搅拌均匀，再在室温下搅拌至常温，即得长梗冬青苷O/W型乳膏。

以下提供实施例5和实施例6，以表明含有长梗冬青苷的药物组合物对糖尿病溃疡愈合的显著作用。

实施例5：长梗冬青苷乳膏对SD大鼠糖尿病皮肤溃疡和正常血糖大鼠皮肤溃疡愈合的影响

SD大鼠40只，体重180～220g，适应性饲养一周后，将SD大鼠随机分成两组，其中一组常规饲养，另一组进行糖尿病模型的建立：禁食不禁水12h后，用PH4.2，0.1M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液将链脲佐菌素配制成10mg/mL的溶液，腹腔注射链脲佐菌素60mg/kg，一周后尾静脉采血测血糖，当血糖值≥ 16.7mmol/L且伴随出现“三多一少”症状的即为糖尿病造模成功，在经过一周观测大鼠饮水饮食情况并记录血糖值后，进行糖尿病皮肤溃疡模型制作。

大鼠糖尿病皮肤溃疡模型的建立：将糖尿病鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉后，剔除背部毛发，再用脱毛膏脱去残余毛发，常规消毒后，用外科手术剪剪去背部脊柱两侧对称部位直径为1.8cm的4个圆形全层缺失皮肤创面，深至筋膜，建立皮肤创伤模型。正常血糖组的溃疡，即普通溃疡的模型建立同上。皮肤溃疡模型建立后定期监测记录大鼠体重与血糖，结果如图5,6所示。

创伤第一天开始给药，空白乳膏，2％含药乳膏以及5％含药乳膏分别给予大鼠背部不同部位的创口，第4个创口随机给药。大鼠单笼隔离喂养，每天固定时间给药两次。给药前用生理盐水清洗创面，用乳膏涂抹覆盖创面。给药后每天观察创面及其周围的炎症反应，并于创面给药处理后的第7、14、21天分别对大鼠溃疡创面拍照，应用Image pro plus计算溃疡面积及愈合率。创面愈合率＝(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积×100％。

实验结果如图7，8所示，普通溃疡空白乳膏处理组大鼠愈合率明显快于糖尿病溃疡空白乳膏处理组，表明高血糖具有延缓创面愈合的作用。在第7、14、 21天糖尿病溃疡长梗冬青乳膏处理组大鼠的创面愈合明显快于普通溃疡组，表明长梗冬青苷可明显促进糖尿病皮肤溃疡的愈合，且5％含药乳膏组的愈合率高于2％含药乳膏组，但是两者无显著性差异。普通溃疡长梗冬青乳膏处理组大鼠创面愈合与普通溃疡空白乳膏处理组相比无显著性差异，说明长梗冬青苷对普通溃疡的治疗效果不明显，而糖尿病溃疡2％长梗冬青乳膏处理组与普通溃疡2％长梗冬青乳膏处理组相比，前者的创面愈合率明显高于后者，表明长梗冬青苷对糖尿病皮肤溃疡的促愈合效果比普通皮肤溃疡更加显著。

可见，长梗冬青苷能够有效促进糖尿病大鼠皮肤溃疡的愈合，且对糖尿病溃疡的治疗效果比对普通皮肤溃疡更加显著。

实施例6：长梗冬青苷乳膏对糖尿病溃疡大鼠皮肤组织的影响

针对糖尿病溃疡大鼠，于给药后第7、14、21天3个时间点处死6只大鼠，分别取各处理组大鼠溃疡皮肤组织，4％多聚甲醛固定48h，不同浓度乙醇梯度脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋后，垂直于皮肤表层方向对组织进行切片(5μ m)，分别进行HE及Masson染色，显微镜下检查创面组织的病理形态、肉芽组织增生情况以及上皮组织的形成。

结果如图9，10所示，空白乳膏组：创面造模后第7天，可见炎症细胞浸润，炎症细胞以巨噬细胞为主，有少量成纤维细胞，胶原纤维，新生血管不明显；第14天，可见新生表皮及肉芽组织，炎症细胞较7天时减少，但仍较多，成纤维细胞增加，胶原纤维增多；第21天，创面有新生表皮，但较薄，结构不完整。2％长梗冬青苷乳膏：创面形成第7天，有较多的炎症细胞及胶原纤维，有少量成纤维细胞，新生毛细血管较空白乳膏组多；第14天，新生表皮基本形成，但比较薄，可见较多毛细血管，炎症细胞开始消退，成纤维细胞增加；第 21天，创面基本愈合，有新生的角质层，新生表皮较空白乳膏组厚，毛细血管丰富，胶原纤维多，呈束状排列且结构致密。5％含药乳膏与2％含药乳膏相比，第21天毛细血管更加丰富，胶原纤维染色更加明显且排列更加紧密规整。

大鼠皮肤组织病理学研究进一步表明：长梗冬青苷能够有效促进糖尿病大鼠皮肤溃疡的愈合。

综上所述，长梗冬青苷在治疗糖尿病皮肤溃疡中具有显著的药用价值。而以长梗冬青苷为有效成分所制作的药物组合物，可以促进糖尿病患者的溃疡愈合，提高患者的生活质量，从而具有良好的医用价值和市场经济价值。

而本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制。本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (6)

1.长梗冬青苷在制备抗糖尿病皮肤溃疡药物中的应用，其特征在于，所述长梗冬青苷的化学式为：

2.一种治疗糖尿病皮肤溃疡的药物组合物，其特征在于，该组合物含有长梗冬青苷或长梗冬青苷在药学上可接受的盐类衍生物。

3.根据权利要求2所述的一种治疗糖尿病皮肤溃疡的药物组合物，其特征在于：长梗冬青苷或长梗冬青苷在药学上可接受的盐类衍生物占组合物总质量的1％至5％。

4.根据权利要求2所述的一种治疗糖尿病皮肤溃疡的药物组合物，其特征在于：该组合物还含有抗生素类药物。

5.根据权利要求4所述的一种治疗糖尿病皮肤溃疡的药物组合物，其特征在于：所述的抗生素类药物为莫匹罗星、红霉素、阿莫西林、克拉维酸钾、双氯青霉素、头孢氨苄、头孢唑啉、氨苄青霉素、舒巴坦、氯林可霉素、甲硝唑、氨曲南、哌拉西林、三唑巴坦、万古霉素和头孢他啶中的一种或多种组合。

6.根据权利要求2所述的一种治疗糖尿病皮肤溃疡的药物组合物，其特征在于：所述的药物组合物制剂形式为软膏剂、膜剂、气雾剂、注射剂、片剂、胶囊剂、滴丸剂、控释或缓释剂和纳米制剂中的一种。