CN104211640A

CN104211640A - 一种生物碱类化合物calamusine A、其制备方法、药物组合物与用途

Info

Publication number: CN104211640A
Application number: CN201310206910.0A
Authority: CN
Inventors: 于德泉; 申竹芳; 郝志友; 张庆建; 刘泉; 倪刚; 陈若芸
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2013-05-29
Filing date: 2013-05-29
Publication date: 2014-12-17

Abstract

本发明公开了一种生物碱类化合物calamusine A、其制备方法、药物组合物与用途。具体而言，公开了如式I所示的化合物Calamusine A。这种化合物的制备方法，从水菖蒲根茎中制备获得。一种药物组合物，其特征在于，含有有效剂量的式I化合物和/或药学上可接受的载体。式I化合物在制备预防、缓解或/和治疗糖尿病的药物中的应用。

Description

一种生物碱类化合物calamusine A、其制备方法、药物组合物与用途

技术领域

本发明涉及一种生物碱类化合物calamusine A，其制备方法，和其在制备预防和治疗糖尿病药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

据WHO估计，1995-2025年，全球糖尿病发病率将增至3—5%，预计达3亿患者。糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）是一种常见的内分泌疾病，是因胰岛素绝对或相对不足或靶细胞对胰岛素敏感性减低引起以糖代谢紊乱为主，继发脂肪、蛋白质、水、电解质代谢障碍。可分为胰岛素依赖性糖尿病（又称I型）和非胰岛素依赖型糖尿病（又称II型），其中后者占糖尿病患者90%以上。随着对糖尿病发病机制认识的不断深入，许多治疗糖尿病的新型药物不断问世。I型糖尿病治疗药主要是胰岛素及其类似物。II型糖尿病口服降糖药产品主要有5类：磺脲类、D-苯丙氨酸类胰岛素分泌促进剂、双胍类、α-葡萄糖糖苷酶抑制剂、胰岛素增敏剂。

PPARs（peroxisome proliferators-activated receptors，过氧化物酶体增殖物激活受体）是一类由配体激活的核转录因子，属于II型核受体家族。目前已发现3种亚型，即α、β和γ。PPARγ通过配体依赖性机制调控靶基因的表达，从而参与一系列的生理过程。PPARγ配体有内源性和外源性配体，内源性配体如花生四烯酸、LTB4、15d-PGJ2、前列腺素A1、前列腺素D2等；外源性配体如TZDs、吲哚美辛、血管紧张素II受体阻断剂（sartans）和WY-14643、ETYA等。PPARγ通过调节相关基因的表达，在糖脂代谢、脂肪形成以及在免疫系统中发挥重要作用，并与多种疾病如糖尿病、肥胖、高血压、癌症等的发生、发展密切相关。以上市的用于2型糖尿病治疗的罗格列酮和吡格列酮属于PPARγ单一受体激动剂，它通过激活PPARγ受体，直接解除II型糖尿病的主要病因—胰岛素抵抗，从而全面控制糖尿病。

与格列酮类作用于与胰岛素敏感性和血糖控制有关的PPARγ受体不同的是，“他唑类”同时作用于PPARα和PPARγ。在II型糖尿病治疗中，该类PPAR双通道激动剂不但能有效地控制血糖的异常变化，还能降低血中的甘油三酯、自由脂肪酸和低密度脂蛋白含量，同时能升高血中高密度脂蛋白浓度，从而对II型糖尿病患者的心血管并发症具有防治作用，实现II型糖尿病的全新治疗方式。关于此类药物的研发，已有很多进入临床试验，然而尚没有已经上市的药物。

GK（glucokinase，葡萄糖激酶）是己糖激酶的一种异构酶，它是催化机体糖酵解的第一步反应，主要作用底物是葡萄糖感受器，主要存在于肝细胞和胰腺的β细胞，对机体葡萄糖代谢平衡有重要的作用。研究发现，糖尿病患者体内普遍尊在GK活性下降的问题。因此，具有GK激活作用的化合物可通过调节胰岛素释放和促进肝脏葡萄糖代谢的双重机制来降低血糖，达到有效控制血糖和治疗糖尿病并发症的目的。目前已有该类药物进入临床研究。

水菖蒲（Acorus calamus L.）为天南星科（Araceae）菖蒲属（Acorus）植物，在我国传统医学中以根茎入药，用于治疗各种神经、精神疾患，并用于治疗胃肠疾病。该植物在印度尼西亚及美国用于糖尿病的治疗。有研究表明水菖蒲乙酸乙酯部位可以增加葡萄糖的消耗量，具有促进胰岛素分泌作用，因而具有潜在的治疗糖尿病和心血管并发症的作用（体重不增加）。并且水菖蒲乙酸乙酯部位具有促进脂细胞分裂的作用，类似于罗格列酮。因此，该植物可能具有改善II型糖尿病的作用，在治疗糖尿病的药物开发方面具有光明前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种新的预防、缓解或/和治疗糖尿病的药物，即提供了一种新的化合物calamusine A。

本发明的另一方面提供了制备化合物calamusine A的方法。

本发明的另一方面涉及以calamusine A为有效成分的药物组合物。

本发明的又一方面涉及calamusine A及其药物组合物在预防和/或治疗II型糖尿病及其并发症的药物中的应用。

发明人从水菖蒲（Acorus calamus L.）根茎中分离得到一种新的生物碱类化合物calamusine A。

本发明中所述化合物calamusine A的结构式表示为式（Ⅰ）：

本发明中所述化合物calamusine A是由水菖蒲根茎中提取得到的，该方法包括以下步骤：

1）水菖蒲根茎粉碎成粗颗粒，以体积比为50-100%乙醇，优选70-98%乙醇，95%乙醇，回流提取1-4次，优选3次，每次1-3小时，优选2小时，合并提取液，提取液减压浓缩得浸膏；

2）浸膏中加适量水分散，分别以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位；

3）其乙酸乙酯部位以硅胶柱层析分离，用CH₂Cl₂：MeOH(40:1,20:1,15:1,10:1,8:1,6:1,5:1,3:1,1:1和0:1v/v)梯度洗脱，得10个部位，命名为Et-1、Et-2、Et-3、Et-4、Et-5、Et-6、Et-7、Et-8、Et-9、Et-10；

4）Et-6部分分别以硅胶、Sephadex HP-20凝胶、C18ODS等填料反复分离，得化合物Calamusine A。

优选的方法为：

1)水菖蒲根茎粉碎成粗颗粒，以每19.8kg计以95%乙醇，120L/次回流提取3次，每次2小时，合并提取液，提取液减压浓缩得浸膏3.1kg；

2)浸膏中加适量水3L分散，分别以石油醚3L×3、乙酸乙酯3L×3、正丁醇3L×3萃取，得石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位；

3)其乙酸乙酯部位低温减压浓缩，得浸膏310g，然后以硅胶柱层析10.5×100cm分离，用CH₂Cl₂：MeOH，v/v比例依次为40:1,20:1,15:1,10:1,8:1,6:1,5:1,3:1,1:1和0:1梯度洗脱，得10个部位，命名为Et-1、Et-2、Et-3、Et-4、Et-5、Et-6、Et-7、Et-8、Et-9、Et-10；

4)Et-476g部分以硅胶柱层析分离，用石油醚：丙酮v/v比例依次为7:1,5:1,4:1,3:1,2:1,1:1和0:1梯度洗脱，得53个流分；其中流分21－29，共计10.2g进行中压C18ODS层析，以含水甲醇v/v比例依次为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%梯度洗脱，得24个流分；其中流分13－24共计2.3g进行Sephadex LH-20凝胶层析，以CHCl₃:MeOHv/v比例依次为1:1洗脱，得14个流分；其中流分9－14，共计393mg进行制备液相分离，分离条件YMCODS-Aφ20×250mm,60%甲醇，4ml/min得化合物calamusine A18mg。

本发明一方面涉及药物组合物，其中含有治疗有效量的calamusine A和药学上可接受的载体。

本发明化合物可以单独直接应用，也可以与其他药物包括植物提取物组成复方的形式使用，可以使用不同的药用辅料，制成多种固体制剂和液体制剂。本发明的给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔黏膜、眼、肺、皮肤、阴道、腹膜、直肠等。通常本发明的化合物占药物组合物总重量的0.01—95%。

本发明的化合物或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射、腹腔注射、穴位注射等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂（包括真溶液和胶体溶液）、乳剂（包括水包油型、油包水型和复乳）、混悬剂、注射剂（包括水针剂、粉针剂和输液）、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等。固体剂型可以是片剂（包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片）、胶囊剂（包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊）、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明的化合物可以制成普通制剂，也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将单位给药剂型支撑片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、残酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二丙醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以进一步将片剂制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片、或双层片和多层片。

为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、月桂酸聚乙二醇甘油酯、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄菩胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。

为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。

为了将给药单元制成胶囊，将本发明化合物与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明的化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。

例如，将本发明化合物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的化合物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明的药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明药物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。本发明化合物的每天的合适剂量范围：本发明的化合物的用量为0.001—100mg/Kg体重，上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药，这取决于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。每一种治疗所需总剂量可分成多次或按一次剂量给药。本发明的化合物或药物组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。

本发明一方面涉及calamusine A的用途，即该化合物在制备预防或/和治疗糖尿病及其并发症的药物中的应用。

本发明对所述的生物碱类化合物calamusine A进行了体外PPARα和PPARγ受体转录激活实验，以及GK激活实验，实验表明calamusine A具有显著的PPARα/γ受体转录激活活性，以及显著的GK激活作用。

附图说明：

图1calamusine A的质谱图。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，本发明结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明的范围。

制备实施例

实施例1：

Calamusine A的制备：

水菖蒲根茎（19.8kg）粉碎成粗颗粒，以95%乙醇（120L/次）回流提取3次，每次2小时，合并提取液。提取液减压浓缩得浸膏（3.1kg）。浸膏中加适量水（3L）分散，分别以石油醚（3L×3）、乙酸乙酯（3L×3）、正丁醇（3L×3）萃取，得石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。其乙酸乙酯部位低温减压浓缩，得浸膏（310g），然后以硅胶柱层析（10.5×100cm）分离，用CH₂Cl₂：MeOH(40:1,20:1,15:1,10:1,8:1,6:1,5:1,3:1,1:1和0:1v/v)梯度洗脱，得10个部位，命名为Et-1、Et-2、Et-3…Et-10；

Et-4（76g）部分以硅胶柱层析分离，用石油醚：丙酮（7:1,5:1,4:1,3:1,2:1,1:1和0:1v/v）梯度洗脱，得53个流分，其中流分21－29（10.2g）进行中压C18ODS层析，以含水甲醇（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，v/v）梯度洗脱，得24个流分，其中流分13－24（2.3g）进行Sephadex LH-20凝胶层析，以CHCl3：MeOH（1:1）洗脱，得14个流分，其中流分9－14(393mg)进行制备型高效液相分离（YMC-pack ODS-A色谱柱，φ20×250mm，5μm；60%甲醇；4ml/min）得化合物calamusine A(18mg，t_R=60min)。

Calamusine A的结构鉴定数据：

黄色无定形粉末(MeOH);IRυ_max3401,1679,1499,1212,1188,1139,1044cm^-1;

¹H-NMR(600MHz,DMSO-d₆,70°C)和¹³C-NMR(150MHz,DMSO-d₆,70°C)数据,见表1；

HR-ESIMS：m/z308.0919[M+H]⁺(calcd.for C₁₈H₁₄NO₄,308.0923)和330.0737[M+Na]+(calcd.for C₁₈H₁₃NO₄Na,330.0742).（详细见附图1）

表1Calamusine A的¹H(600MHz，DMSO-d₆)和¹³C-NMR(150MHz,DMSO-d₆)数据

制剂实施例

实施例2：

按实施例1的方法制得的calamusine A，按常规方法加注射用水，精滤，灌封灭菌后可制成注射液。

实施例3：

按实施例1的方法制得calamusine A，将其溶于无菌注射用水中，用无菌漏斗过滤，分装，低温冷冻干燥后无菌熔封即得粉针剂。

实施例4：

将按实施例1的方法制得的calamusine A与赋形剂重量比9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。

实施例5：

按实施例1的方法制得calamusine A，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例6：

按实施例1的方法制得calamusine A，按常规口服液制法制成口服液。

实施例7：

按实施例1的方法制得calamusine A，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。

实施例8：

按实施例1的方法先制得calamusine A，按其与赋形剂重量比3:1的比例加入赋形剂，制成胶囊。

药理试验例

实施例9：

本发明化合物calamusine A及其与药用载体或赋形剂组成的药物组合物的体外PPARγ/α受体转录激活实验。

(1)实验方法

建构表达PPARα/γ，RXR的质粒载体,以及PPARα/γ与RXR异源二聚体的应答元件PPRE调控的荧光素酶报告基因质粒载体。用脂质体转染的方法,共转染PPARα/γ，RXR，PPRE-luciferase表达质粒进哺乳动物细胞系293E细胞。293E细胞转染24小时后，用胰酶消化，计数细胞后均分成若干份，分别与加入样品的培养基混合，在合适的培养板中培养24小时，此步须设立阴性对照(加DMSO),阳性对照(如罗格列酮)，每个样品设立平行组.根据需要样品浓度可以设置若干梯度，例如10^-9—10^-5M。加药24—48h后,用细胞裂解液充分裂解细胞，收集培养板中各孔细胞裂解液，加入荧光素酶反应底物(Luciferase Assay System，Promega)，用化学发光检测仪立即测量荧光读数。

用上述建立的荧光素酶报告基因方法，比较化合物的PPARγ激活活性。计算筛选化合物的相对活性：将化合物的荧光值读数与阳性对照罗格列酮的荧光值读数相比，设罗格列酮的活性为100%，其他化合物的活性表示为相对活性，即：

样品读数/阳性对照读数×100%

比较化合物的PPARα激活活性。计算筛选化合物的相对活性：将化合物的荧光值读数与阳性对照wy14643的荧光值读数相比，设wy14643的活性为100%，其他化合物的活性表示为相对活性，即：

样品读数/阳性对照读数×100%

(2)结果

在10^-6mol/L剂量时，用上述方法测得的calamusine A对PPARγ受体转录激活倍数为3.6倍，而阳性药物罗格列酮对PPARγ受体转录的激活倍数2—3倍。一般认为，激活倍数大于1.5倍即相当于阳性药物活性的70%以上。可以看出，calamusine A对PPARγ受体转录的激活活性优于阳性药物罗格列酮。

此外，在10^-6mol/L剂量时，用上述方法测得的calamusine A对PPARα受体转录激活倍数为1.52倍，而阳性药物WY14643对PPARα受体转录的激活倍数为2—3倍。一般认为，激活倍数大于1.5倍即相当于阳性药物活性的70%以上。可以看出，calamusine A具有显著的PPARα受体转录的激活活性。

实施例10：

本发明化合物calamusine A及其与药用载体或赋形剂组成的药物组合物的体外葡萄糖激酶（GK）激活活性实验。

（1）实验方法

通过6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法测定GK活性。反应总体系为150μL，包括Tris-HCl100mM（PH7.4）、ATP25mM、NAD1mM、DTT5mM、MgCl₂2mM、KCl25mM、葡萄糖4mM、G6PDH4.5mU、GK2mU。340nm室温测定。化合物初筛浓度为10μM。以不加激活剂的Control孔的每分钟最大OD变化值作为1，化合物各孔的每分钟最大OD变化值与其相比所得结果即为该化合物的激活倍数。

（2）结果

在10^-5mol/L剂量下，用上述方法测得的calamusine A对葡萄糖激酶（GK）的激活倍数为1.6±0.3倍，EC_1.5为5.86μM。相同浓度时，阳性化合物GKA22的激活倍数为1.5倍，EC_1.5为2.06μM。从而得出结论，calamusine A具有显著的GK激活活性。

以上结果说明calamusine A具有PPARα/γ双通道激动活性，且calamusine A具有显著的GK激活活性。因其在II型糖尿病相关的多个靶点具有显著作用，且具有新颖的结构，因此该发明化合物在II型糖尿病及其并发症的预防和治疗方面具有价值。

Claims

1.如式I所示的化合物Calamusine A

2.权利要求1化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)水菖蒲根茎粉碎成粗颗粒，以体积比为50-100%乙醇，回流提取1-4次，，每次1-3小时，合并提取液，提取液减压浓缩得浸膏；

2)浸膏中加适量水分散，分别以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位；

3)其乙酸乙酯部位以硅胶柱层析分离，用CH₂Cl₂：MeOH(40:1,20:1,15:1,10:1,8:1,6:1,5:1,3:1,1:1和0:1v/v)梯度洗脱，得10个部位，命名为Et-1、Et-2、Et-3、Et-4、Et-5、Et-6、Et-7、Et-8、Et-9、Et-10；

4)Et-6部分分别以硅胶、Sephadex HP-20凝胶、C18ODS等填料反复分离，得化合物Calamusine A。

3.根据权利要求2的方法，其特征在于，包括如下步骤：

4.一种药物组合物，其特征在于，含有有效剂量的权利要求1的化合物和/或药学上可接受的载体。

5.权利要求1的化合物在制备预防、缓解或/和治疗糖尿病的药物中的应用。