CN102250941B - 基于p16启动子的药物筛选方法 - Google Patents

Abstract

一种药物制备技术领域的基于p16启动子的药物筛选方法，所涉及的p16^INK4a启动子-荧光素酶真核表达载体，其序列如Seq ID No.1所示，该序列全长3300bp，其中138～1478之间为p16^INK4a启动子，1535～3187为荧光素酶阅读框，该真核表达载体可用于检测的化合物的抗癌活性。

Description

基于p16启动子的药物筛选方法

技术领域

本发明涉及的是一种药物制备技术领域的筛选方法及其制备和应用，具体是一种在骨肉瘤U2OS细胞株中基于p16^INK4a(细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4抑制因子)启动子的荧光素酶(luciferase)抗肿瘤药物筛选方法及其构建方法与应用。

背景技术

癌症是一群细胞偏离了正常的生长周期，这样的细胞其中就有很多的基因发生了改变。实验中选取在癌症发生时有重大变化并对癌症的发生有重大影响的抑癌基因p16^INK4a。扩增启动子部分，并在其下游连接一个易于观察的信号蛋白基因——荧光素酶基因(luciferase)。瞬时转染U2OS或其他癌细胞株24h后，加入一定浓度的化合物，通过检测荧光素酶活性变化判定该化合物对于P16启动子活性的影响，从而初步预测该化合物潜在的抗癌功能。

真核细胞的分裂必须经过两个关键环节，G1/S期和G2/M期，CDK是细胞周期调节的中心，其成员的激活或磷酸化能够促进细胞周期中G1→S和G2→M的转变，已经发现有4种CDK(CDK25)与G1→S期的调节有关。CDK4和D型周期蛋白形成的复合物能促进G1→S的转变，从而促进细胞的增生，并可能是肿瘤发生的主要因素。p16^INK4a基因编码的p16^INK4a蛋白能与CDK4结合，抑制CDK4周期蛋白D复合物的催化活性，从而抑制细胞增生和恶性转化。一旦p16基因缺失或突变失活，细胞将向恶性转化。

目前的药物筛选技术主要基于两种方法：一种是基于表型的筛选，另一种是基于靶标的筛选。后一种是目前应用比较广泛的，作为药物筛选靶标的可以是某种酶，细胞表面或细胞内某种受体等，这类方法的靶标单一，而以启动子作为筛选靶标，建立启动子-报告基因方法来表征启动子活性强弱，由于启动子的活性受多种因子影响，所以可扩大筛选范围提高筛选效率。p16^INK4a基因作为细胞信号网络中的节点基因，在许多肿瘤细胞中表达异常，其启动子的活性直接影响该基因的表达量，而以该启动子作为靶标进行抗肿瘤药物筛选的报道很少。并且荧光素酶luciferase作为报告基因的体外检测相比β-半乳糖苷酶(β-gal)、EGFP等报告基因更加灵敏，且由于其半衰期短，所以更能直接反应化合物在该方法中的作用。

经过对现有技术的检索，中国专利文献号CN101275157，公开日2008-10-1，记载了一种p21启动子去乙酰化酶抑制剂筛选模型的构建及其应用，该技术公开了一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂筛选方法，还提供了利用该方法筛选组蛋白去乙酰化酶抑制剂的方法。该筛选方法是将p21WAF1基因启动子与荧光素酶报告基因连接，然后用连接后的重组质粒转入体外培养的细胞系，得到稳定转染的细胞株。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种基于p16启动子的药物筛选方法，能够用于发现具有肿瘤抑制潜力的化合物。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种p16^INK4a启动子-荧光素酶真核表达载体，其序列如Seq ID No.1所示，该序列全长3300bp，其中138～1478之间为p16^INK4a启动子，1535～3187为荧光素酶阅读框。

本发明涉及上述荧光素酶抗肿瘤药物筛选方法的构建方法，包括以下步骤：

第一步、采用热启动两步法以0.7μg/μL的人类基因组HOSE细胞DNA为模版，进行第一次PCR反应，然后以第一次PCR反应得到的样品为模版，进行第二次PCR反应；

所采用的上游引物F1为：CATATTGCCAATCCTACAATGCC，下游引物R1为：CTCCCCGCCGCCCGCTGCCTGCTC；

所采用的上游引物F2为：GCTACACAGCTAATTGAGAGGTACC，下游引物R2为：CGTCCGTAACTATTCGGTGC。

所述的第一次PCR反应的反应体系(每50μL)中含有：模板HOSE DNA1μL、10μM的上、下游引物各1μL、2×GC-rich PCR buffer 22.5μL、2.5mM dNTP 4μL、ddH₂O 15.5μL以及5U/μL的Taq聚合酶1μL。

所述的第一次PCR反应的条件为：98℃变性，5min；加入Taq酶；95℃变性，5min；1循环；94℃，1min；梯度温度(55～70℃)℃，5min 35循环；72℃延伸10min，1循环；10℃，Hold。

所述的第一次PCR反应的检测方法为：1kb Marker 5μL，样品上样量为5μL，110V恒压，30min于1％琼脂糖凝胶电泳检测。

所述的第二次PCR反应的反应体系(每50μL)中含有：模板DNA1μL、10μM的上、下游引物各1μL、2×GC-rich PCR buffer 22.5μL、2.5mM dNTP 4μL、ddH₂O 15.5μL、5U/μL的Taq聚合酶1μL。

所述的第二次PCR反应的反应条件为：98℃变性，5min；加入Taq酶；95℃变性，5min；1循环；94℃，1min；梯度温度(55～70℃)℃，5min；35循环；72℃延伸10min，1循环；10℃，Hold。

所述的第二次PCR反应的检测方法：1kb Marker 5μL，样品上样量为5μL，110V恒压，30min于1％琼脂糖凝胶电泳检测。

第二步、扩增产物纯化：将二次PCR反应的产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后得到的扩增条带中的目的条带切下，用Gel Extraction Kit DNA纯化试剂盒进行纯化；

第三步、p16^INK4a启动子T载体的构建：

3.1)PCR产物磷酸化；

3.2)连接：回收的p16^INK4a启动子的片段和线性的T载体用T4连接酶进行体外连接反应；

3.3)转化大肠杆菌：将连接的产物转入大肠杆菌感受态细胞中，在含X-gal和IPTG氨苄霉素100μL/mL的LB培养基上37℃培养12-16小时；

3.4)蓝白斑筛选重组载体的阳性克隆：将菌落放大培养，纯化提取质粒；

3.5)利用Kpn1+Pst1进行酶切鉴定和测序，证实得到的L4为插入p16^INK4a启动子的重组质粒。

第四步、培养得到p16^INK4a启动子/荧光素酶(luciferase)真核表达载体：

4.1)酶切：将p16^INK4a启动子T载体用Xhol+Sac1双酶切，酶切后的载体片段经1％琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收；

4.2)酶切：含有荧光素表达基因的真核载体Xhol+Sac1双酶切，酶切后的载体片段经1％琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收；

4.3)用回收的p16^INK4a启动子片段和载体用T4连接酶进行体外连接反应；

4.4)转化大肠杆菌：将连接的产物转入大肠杆菌感受态细胞中，在含氨苄霉素100μL/mL的LB培养基上37℃培养12-16小时；

4.5)将菌落放大培养，纯化提取质粒用双酶切Xhol+Sac1鉴定并测序，证实得到p16^INK4a启动子-荧光素酶真核表达质粒。

本发明涉及上述荧光素酶抗肿瘤药物筛选方法用于检测的化合物的抗癌活性的应用：通过将所述荧光素酶抗肿瘤药物筛选方法与对照质粒通过PEI共同转染并导入骨肉瘤细胞U2OS细胞，经瞬时转染后采用双荧光检测试剂盒检测荧光吸收，用抗癌药物羟基脲进行可行性检测，最后通过根据荧光素酶与海参荧光素酶活性的比值来表征被检测的化合物的抗癌活性。

所述的对照质粒为海参荧光素酶Renilla；

所述的瞬时转染是指：对转染后的U2OS细胞，在37℃，5％CO₂培养条件下，转染6h后铺96孔板，24h后换液并加化合物。

该体系能够对外界化合物的刺激产生明显的，有差别的反应，可用于筛选未知的有潜力的抗肿瘤药物。

附图说明

图1为本发明巢氏PCR结果；

其中：(a)为第一次PCR结果；(b)为第二次PCR结果。

图2p16^INK4a启动子/荧光素酶质粒酶切鉴定结果。

图3为本发明所构建的p16^INK4a启动子/荧光素酶质粒图谱。

图4为本发明所建立的体系在羟基脲作用下报告基因表达量的变化。

图5为本发明所建立的体系对潜在抗癌活性的化合物进行筛选。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

1.p16^INK4a启动子的克隆及鉴定。

p16^INK4a启动子/荧光素酶(luciferase)真核表达载体，其特征在于：命名为p16^INK4a-luciferase真核表达载体，其中p16^INK4a-luciferase序列全长3300bp，其中138～1478之间为p16^INK4a启动子，1535～3187为荧光素酶阅读框。

p16^INK4a启动子/荧光素酶(luciferase)真核表达载体的构建方法，其特征包括：设计引物从人类卵巢表面上皮细胞基因组(HOSE DNA)中通过PCR的方法用Taq酶在GC-rich缓冲体系中克隆得到p16^INK4a启动子，并将PCR产物插入pBS-T载体，然后经过Xhol+Sac1双酶切将启动子切下，连入同样使用了Xhol+Sac1酶切的含有荧光素酶(luciferase)真核表达载体质粒中，构建重组的p16^INK4a-luciferase真核表达载体。

p16^INK4a启动子/荧光素酶(luciferase)真核表达载体的构建方法，包括如下步骤：

A、设计引物：

根据p16^INK4a启动子序列设计引物，引物序列如下：

F1：CATATTGCCAATCCTACAATGCC

R1：CTCCCCGCCGCCCGCTGCCTGCTC

F2：GCTACACAGCTAATTGAGAGGTACC

R2：CGTCCGTAACTATTCGGTGC

B、目的片段的克隆：

以人类基因组HOSE为模板，巢氏进行PCR梯度扩增：

采用热启动两步法以HOSE细胞DNA(0.7μg/μL)为模版，上游引物为F1下游引物为R1，进行PCR。PCR反应体系(50μL)：模板HOSE DNA1μL，上下游引物(10μM)各1μL，2×GC-richPCR buffer 22.5μL，dNTP(2.5mM)4μL，ddH₂O15.5μL，Taq聚合酶(5U/μL)1μL。

PCR反应条件：98℃变性，5min；加入Taq酶；95℃变性，5min；1循环；94℃，1min；梯度温度(55～70℃)℃，5min；35循环；72℃延伸10min，1循环；10℃，Hold。检测方法：1kb Marker 5μL，样品上样量为5μL，110V恒压，30min于1％琼脂糖凝胶电泳检测。

采用热启动两步法以第一步结果中的2样品为模版，上游引物为F2下游引物为R2，进行PCR。PCR反应体系(50μL)：模板DNA1μL，上下游引物(10μM)各1μL，2×GC-rich PCR buffer22.5μL，dNTP(2.5mM)4μL，ddH₂O15.5μL，Taq聚合酶(5U/μL)1μL。PCR反应条件：98℃变性，5min；加入Taq酶；95℃变性，5min；1循环；94℃，1min；梯度温度(55～70℃)℃，5min；35循环；72℃延伸10min，1循环；10℃，Hold。检测方法：1kb Marker 5μL，样品上样量为5μL，110V恒压，30min于1％琼脂糖凝胶电泳检测。

C、扩增产物纯化：

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，可见一条约2.4kb的扩增条带，将目的条带切下，用Gel Extraction Kit DNA纯化试剂盒进行纯化；步骤如下：

C-1、从琼脂糖凝胶中将PCR产物DNA条带切下，转入离心管中，加入2倍体积的结合缓冲液，55℃下温浴7分钟使得凝胶溶解；

C-2、将离心管中溶解的凝胶溶液转移到试剂盒自带的DNA吸附柱中，13000转/分钟离心2分钟；

C-3、向DNA吸附柱中加入700μL漂洗液，13000转/分钟离心2分钟；弃去漂洗液，再加入500μL漂洗液，13000转/分钟离心2分钟；弃去漂洗液后，13000转/分钟离心2分钟，室温放置5分钟；

C-4、将DNA吸附柱加入一个新的离心管中，加入65℃预热的洗脱缓冲液70μL，13000转/分钟离心2分钟，离心管底的溶液即为回收的PCR产物DNA片段。

2.p16^INK4a启动子pBS-T重组质粒的构建。

D-1、PCR产物磷酸化；

D-2、连接：回收的p16^INK4a启动子的片段和线性的T载体用T4连接酶进行体外连接反应；

D-3、转化大肠杆菌：将连接的产物转入大肠杆菌感受态细胞中，在含X-gal和IPTG氨苄霉素100μL/mL的LB培养基上37℃培养12-16小时；

D-4、蓝白斑筛选重组载体的阳性克隆：将菌落放大培养，纯化提取质粒；

D-5、利用Kpn1+Pst1进行酶切鉴定和测序，证实得到的L4为插入p16^INK4a启动子的重组质粒。

3.p16^INK4a启动子/荧光素酶(luciferase)真核表达载体

E-1、酶切：将p16^INK4a启动子T载体用Xhol+Sac1双酶切，酶切后的载体片段经1％琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收；

E-2、酶切：含有荧光素表达基因的真核载体Xhol+Sac1双酶切，酶切后的载体片段经1％琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收；

E-3、用回收的p16^INK4a启动子片段和载体用T4连接酶进行体外连接反应；

E-4、转化大肠杆菌：将连接的产物转入大肠杆菌感受态细胞中，在含氨苄霉素100μL/mL的LB培养基上37℃培养12-16小时；

E-4、将菌落放大培养，纯化提取质粒用双酶切Xhol+Sac1鉴定并测序，证实得到序列的p16^INK4a启动子/荧光素酶(luciferase)真核表达质粒；

p16INK4a-luciferase表达载体的构建方法，D-1所述的磷酸化的方法是：在反应体系中加入10倍缓冲液2μL，PNK磷酸化酶1μL，片段5μL，去离子水12μL，37℃水浴1个小时，75℃失活10min。步骤E-1、E-2所述的酶切方法是：

在反应体系中加入10倍缓冲液2μL，Xho13μL，Sacl 3μL，载体10μL，去离子水2μL，37℃水浴2个小时；在反应体系中加入10倍缓冲液2μL，Xho1 3μL，Sacl 3μL，无离子水12μL，37℃水浴2个小时，65℃失活10min；

p16^INK4a-luciferase表达载体的构建方法，其特征包括步骤D-2所述的连接方法是：

在反应体系中加入回收的PCR产物DNA片段8μL和载体片段2μL，10倍缓冲液2μL，T4DNA连接酶1μL，去离子水6μL，PEG40001μL，16℃反应1h。步骤F-2所述的连接方法是：在反应体系中加入回收的DNA片段8μL和载体片段2μL，10倍缓冲液2μL，T4DNA连接酶1μL，去离子水7μL，16℃反应1h，PEG40001μL。

p16^INK4a-luciferase真核表达载体的构建方法，步骤D-3所述的转化大肠杆菌的方法是：

a.取连接产物10ul加到50ul的感受态细胞中，轻轻摇匀，冰浴30min.

b.42℃热激90s，快速转到冰浴2-3min，注意不要摇动管。

c.向管中加入500ul的LB培养基，150rmp，37℃，45min.

d.将菌液全部涂到LB平板上，含100ug/mL Amp.

e.将平板正置直至液体全部吸收。

f.倒置平板，于37℃培养12～16h.

p16^INK4a-luciferase重组真核表达载体的构建方法，步骤D-4所述筛选重组真核表达载体阳性克隆的方法是：

a.挑取转化后的单菌落，接种到2mL含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基中，37℃，150rpm，摇床培养12～16hr。

b.取1-1.5mL培养物倒入1.5mL离心管中，4℃，13000rpm离心30s，弃上清，然后再短暂离心，用枪头将离心管底部少量残液吸出弃掉。剩余菌液4℃保存。

c.将细胞沉淀漩涡震荡打散后，重悬于100μL冰预冷的碱裂解液I中，漩涡震荡，使细菌悬浮均匀。

d.细菌重悬液中加入200μL碱裂解液II，上下翻转离心管5次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，置于冰上(＜5min)。

e.加入150μL冰预冷的碱裂解液III，上下翻转离心管8次，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，并将离心管置于冰上1～3min，4℃，13000rpm离心5min，将～400μL的上清转移至另一个离心管中。

f.加400μL酚∶氯仿(V∶V＝1∶1)，震荡充分混合有机相和水相，13000rpm离心2min，取300μL上清于新离心管中。

g.用2～2.5体积的乙醇(750μL)室温沉淀核酸，混合均匀，室温静置2min。13000rpm离心5min。小心的把上清倒掉；然后再短暂离心，用枪头把离心管底部少量残液小心的吸出弃掉。

h.加1mL左右70％乙醇于沉淀中，颠倒离心管数次，洗涤管壁与沉淀，如沉淀偏离管底需13000rpm离心1min。小心的把上清倒掉，然后再短暂离心，用枪头把离心管底部少量残液小心的吸出(若沉淀漂浮，用枪头将其置于离心管底部)。

i.打开离心管，室温静置3～5min，使乙醇充分挥发，直至离心管内没有可见的液体存在。

j.加50μLTE缓冲液(含20μg/mLRNaseA)于离心管中，静置5min，温和震荡混匀。贮存于-20℃。

p16^INK4a-luciferase重组真核表达载体的构建方法，其特征包括步骤D-5酶切鉴定和测序的方法是：

在反应体系中加入提取的重组真核表达载体5μL，10倍缓冲液2μL，限制性内切酶Xho11μL和Kpn1 1μL，去离子水13μL，37℃反应2h；

经1％琼脂糖凝胶电泳分离后鉴定p16^INK4a-luciferase的目的条带，酶切后可切出约1.3kb和4.8kb的两个片段，与预期相符，表明目的片段已正确的插入载体中；否则，反向插入为6.1kb单条带，没有插入为4.8kb单条带。

4.p16^INK4a启动子/荧光素酶(luciferase)质粒可行性检测。

5.p16^INK4a启动子/荧光素酶(luciferase)质粒检测潜在抗癌活性的化合物。

使用Promega提供的双荧光检测试剂盒检测双荧光吸收

p16^INK4a-luciferase真核表达载体瞬时转染真核细胞，并以海参荧光素酶Renilla作为对照质粒，转染24h后加药，48h后裂解，荧光值分别收集10,000ms在波长为560nm，465nm下的吸收值。

转染细胞的的方法是：

F-1、准备连续传代三天的U2OS，取80％满的皿进行铺板；

F-2、加入1×Trypsin1m，润湿培养皿，吸走Typsin，在37℃，5％CO2下继续消化2～3min，加8mLDMEM完全培养基吹匀细胞，3h后等待U2OS贴壁；

F-3、取1mLDMED基本培养基加入PEI至终浓度为6μg/μL；另外取1mL基本培养基加入质粒终浓度为2μg/μL(p16^INK4a-luciferase∶Renilla＝20∶1)；混合上述两种液体，室温放置10min，作为转染液；

F-4：加入3mL基本培养基至转染液，混合均匀，加入到吸走了培养基的培养皿中；

F-5：转染6h后，加入1×Trypsin1m，润湿培养皿，吸走Typsin，在37℃，5％CO2下继续消化2～3min，加8mL培养基(DMEM+1％小牛血清+1％双抗)吹匀细胞，再加入5mLDMEM完全培养基，转移至加液槽；每孔200μL液体的量铺于96孔细胞培养板中。每次吸取细胞前，用移液管吹打混匀细胞液，以防细胞沉在管底。；

F-6、转染24h后，换液，在新的DMEM(DMEM+1％小牛血清+1％双抗)中加入化合物至终浓度为10μL；

F-7、转染48小时候，20μL/孔裂解液在37℃下摇床上剧烈震动30min，裂解细胞，吸取15μL/孔至不透明96孔板，加入底物，荧光值分别收集10,000ms在波长为560nm，465nm下的吸收值。

Claims (4)

1.一种p16^INK4a启动子-荧光素酶真核表达载体，其特征在于，其序列包含如Seq ID NO.1所示的DNA序列，该序列全长3300bp，其中138～1478之间为p16^INK4a启动子，1535～3187为荧光素酶阅读框。

2.一种根据权利要求1所述的p16^INK4a启动子-荧光素酶真核表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步、采用热启动两步法以0.7μg/μL的人类基因组HOSE细胞DNA为模板，进行第一次PCR反应，然后以第一次PCR反应得到的样品为模板，进行第二次PCR反应；

第二步、扩增产物纯化：将二次PCR反应的产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后得到的扩增条带中的目的条带切下，用Gel Extraction Kit DNA纯化试剂盒进行纯化；

第三步、p16^INK4a启动子T载体的构建；

第四步、培养得到p16^INK4a启动子-荧光素酶真核表达载体；

所述的第四步具体包括以下步骤：

4.1）酶切：将p16^INK4a启动子T载体用Xhol+Sacl双酶切，酶切后的载体片段经1％琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收p16^INK4a启动子片段；

4.2）酶切：含有荧光素酶表达基因的真核载体Xhol+Sacl双酶切，酶切后的载体片段经1％琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收；

4.3）用回收的p16^INK4a启动子片段和含有荧光素酶表达基因的载体片段用T4连接酶进行体外连接反应；

4.4）转化大肠杆菌：将连接的产物转入大肠杆菌感受态细胞中，在含氨苄青霉素100μL/mL的LB培养基上37℃培养12-16小时；

4.5）将菌落放大培养，纯化提取质粒用双酶切Xhol+Sacl鉴定并测序，证实得到p16^INK4a启动子-荧光素酶真核表达质粒；

其中，第一步第一次PCR反应中所采用的上游引物F1为：

CATATTGCCAATCCTACAATGCC，下游引物R1为：

CTCCCCGCCGCCCGCTGCCTGCTC；第二次PCR反应所采用的上游引物F2为：

GCTACACAGCTAATTGAGAGGTACC，下游引物R2为：

CGTCCGTAACTATTCGGTGC。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征是，第一步中所述的第一次PCR反应的反应体系，每46μL中含有：模板HOSE DNA1μL、10μM的上、下游引物各1μL、2×GC-rich PCR buffer22.5μL、2.5mM dNTP4μL、ddH₂O15.5μL以及5U/μL的Taq聚合酶1μL；

所述的第一次PCR反应的条件为：98℃变性，5min；加入Taq酶；95℃变性，5min；l循环；94℃，1min；梯度温度为55～70℃，5min；35循环；72℃延伸10min，1循环；10℃，静置；

第一次PCR反应的检测方法为：1kb Marker5μL，样品上样量为5μL，110V恒压，30min于1％琼脂糖凝胶电泳检测。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征是，第一步中所述的第二次PCR反应的反应体系，每46μL中含有：模板DNA lμL、10μM的上、下游引物各lμL、2×GC-rich PCR buffer22.5μL、2.5mM dNTP4μL、ddH2O15.5μL、5U/μL的Taq聚合酶1μL；

所述的第二次PCR反应的反应条件为：98℃变性，5min；加入Taq酶；95℃变性，5min；1循环；94℃，l min；梯度温度为55～70℃，5min；35循环；72℃延伸10min，1循环；10℃，静置；

所述的第二次PCR反应的检测方法：1kb Marker5μL，样品上样量为5μL，110V恒压，30min于1％琼脂糖凝胶电泳检测。

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