CN103849680A - Foxe1基因和wnt3基因的应用及该基因的甲基化扩增引物和探针 - Google Patents
Foxe1基因和wnt3基因的应用及该基因的甲基化扩增引物和探针 Download PDFInfo
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Abstract
FOXE1基因和WNT3基因的应用及该基因的甲基化扩增引物和探针，属于生物技术领域。本发明一方面提供FOXE1基因和/或WNT3基因作为甲基化结直肠癌肿瘤标记物的应用，另一方面提供FOXE1基因和WNT3基因甲基化扩增引物和探针。本发明确定FOXE1基因和WNT3基因可以在结直肠癌中作为肿瘤标志物使用，这两个甲基化肿瘤标志物连用的话敏感性能高达79%，特异性为59%，即使I期肿瘤患者的敏感性也能达到63.3%，显示在全血DNA中寻找甲基化肿瘤标志物的可行性。本发明的甲基化扩增引物和探针能够检测到FOXE1和WNT3基因在结直肠癌患者和正常对照全血DNA中的甲基化状态有显著性差异。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种FOXE1基因和WNT3基因的应用及该基因的甲基化扩增引物和探针。
背景技术
结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其较高的发病率和死亡率对人类的健康造成了严重的威胁。目前结肠镜对结直肠癌检查的灵敏度和特异性最高，但由于费用较高、患者痛苦较大和操作要求高等原因降低了患者愿意做该项检查的程度，致使很多患者拖到晚期。肿瘤标志物具有微创、检测方便、费用低、便于普查等优点，并具有较高的敏感性和特异性，结直肠癌的发生发展是多种基因损伤的结果，目前还没找到理想的肿瘤标志物。
基因启动子过甲基化的本质是一种DNA分子异常，它与肿瘤的发生关系密切，是导致许多肿瘤相关基因表达失活的一个重要原因。在一般正常的细胞中，基因调控区CpG岛处于非甲基化的状态，而当细胞发生癌变后，这些CG区域往往呈现甲基化状态。目前DNA甲基化研究是肿瘤分子生物学研究的一个重要领域。甲基化和抑癌基因的失活有关，高水平的甲基化常常和肿瘤的高危险性相关，可以用于肿瘤的分类诊断，成为重要的分子生物学标记，异常的基因启动子甲基化多发生于肿瘤早期，这为大多数肿瘤的早期诊断及判断肿瘤预后、转归、评价疗效提供了一个非常有前景的方法。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种FOXE1基因和WNT3基因的应用及该基因的甲基化扩增引物和探针的技术方案。
所述的FOXE1基因和/或WNT3基因作为甲基化结直肠癌肿瘤标记物的应用。
所述的一种甲基化结直肠癌肿瘤的扩增引物和探针，其特征在于包括FOXE1标记引物和/或WNT3标记引物，
所述的FOXE1标记引物包括引物Foxe1
M-F、引物Foxe1 M-R和探针Foxe1
Probe，所述的Foxe1 M-F序列如SEQ
ID NO.1所示，所述的引物Foxe1 M-R序列如SEQ
ID NO.2所示，所述的探针Foxe1 Probe序列如SEQ ID NO.3所示；
所述的WNT3标记引物包括引物Wnt3
M-F、引物Wnt3 M-R和探针Wnt3
Probe，所述的引物Wnt3 M-F序列如SEQ
ID NO.4所示，所述的引物Wnt3 M-R序列如SEQ
ID NO.5所示，所述的探针Wnt3 Probe序列如SEQ
ID NO.6所示。
本发明中的FOXE1基因和WNT3基因为现有公开的基因。
本发明通过系统全面地分析Wnt基因及其拮抗基因在结直肠癌细胞株、正常结直肠粘膜、结直肠癌组织及其癌旁正常组织、结直肠癌患者及正常对照DNA中的甲基化状态，分析其与各临床资料之间的关系，确定一个具有较高灵敏度和特异性的Wnt/β-catanin通路的甲基化基因谱作为结直肠癌的肿瘤标志物，以便进一步将其开发成为具有独立自主知识产权的结直肠癌体外诊断试剂盒。
经312例结直肠癌患者和200例正常对照的验证，已确定FOXE1基因和WNT3基因可以在结直肠癌中作为肿瘤标志物使用，这两个甲基化肿瘤标志物连用的话敏感性能高达79%，特异性为59%，而且即使I期肿瘤患者的敏感性也能达到63.3%，显示在全血DNA中寻找甲基化肿瘤标志物的可行性。另外，本发明开发的FOXE1基因和WNT3基因特异性的甲基化扩增引物和探针能够检测到2个Wnt通路基因FOXE1和WNT3基因在结直肠癌患者和正常对照全血DNA中的甲基化状态有显著性差异。
附图说明
图1为甲基化芯片结果显示部分Wnt通路相关基因在5例结直肠癌患者和5例正常对照者全血DNA中的差异比较图；
图2为FOXE1的ddCt平均值在肿瘤患者和正常对照图；
图3为WNT3的ddCt平均值在肿瘤患者和正常对照图。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明本发明。
实施例
一.材料和方法：
1.材料：正常结直肠粘膜（约50例）取自肠镜活检标本，结直肠癌组织及其癌旁正常组织（约300例）取自手术切除标本，所有病例均为初治患者，术前均未行放化疗并经病理确诊，另外结直肠癌患者（312例）及正常对照（200例）的全血、血清和血浆。结直肠癌患者包括男181例，女131例。年龄38 - 8 2岁，平均61.6 土 12.3岁。 200例健康体检者入选正常对照组，其中男118例，女82例。年龄21- 71岁，平均年龄40.21土 18.05岁。标本取材获得患者知情同意并经邵逸夫医院医学伦理委员会批准。
2.方法：
2.1 DNA提取及亚硫酸氢盐修饰：采用天根公司试剂盒 TIANamp Genomic
DNA kit (Catalog no：DP304)提取样本中的DNA。取1ug DNA，采用QIAGEN公司的EpiTect Bisulfit
Kit (Catalog no：59104) 进行亚硫酸氢盐修饰。
2.2 芯片初筛甲基化状态差异的基因：5例结直肠癌患者和5例正常对照者全血DNA甲基化芯片检测委托上海康成生物工程有限公司进行。采用的是Roch-NimbleGen
CpG promoter芯片：Human DNA Methylation 2.1M Deluxe
Promoter,其覆盖31548个启动子，上游7.25kb至下游3.25kb以及28226个CpG岛。
2.3
MethyLight定量PCR方法及相关引物和探针设计：
MethyLight是一种建立在TaqMan探针法实时荧光PCR技术上的甲基化定量分析技术，它通过一对甲基化特异性扩增引物和一条覆盖若干CpG位点的探针来对对目的基金进行定量。
在本实验中通过ACTB(β-actin)参比基因来校正样品间在模板量上的差异，合成引物和探针，序列见表1。
表1. MethyLight引物和探针
| 引物 | 序列(5’-3’) |
| ACTB M-F | TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT（如SEQ ID NO.7所示） |
| ACTB Probe | FAM-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-TAMRA（如SEQ ID NO.9所示） |
| ACTB M-R | AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA（如SEQ ID NO.8所示） |
| Foxe1 M-F | TCGTAGGGTTGGAGATTTAC（如SEQ ID NO.1所示） |
| Foxe1 Probe | FAM-CGCCGTGGAGAGGACCAGCCTCAGGT-TAMRA（如SEQ ID NO.3所示） |
| Foxe1 M-R | GAAACGAAAACAACGAAATCG（如SEQ ID NO.2所示） |
| Wnt3 M-F | GCGTCGTTCGTAGTTAGATTTTCG（如SEQ ID NO.4所示） |
| Wnt3 Probe | FAM-CCGCTCTCTAACCTCTCGTCCTAACCGC-TAMRA（如SEQ ID NO.6所示） |
| Wnt3 M-R | ACTTCCAACCTCCCGAATCCG（如SEQ ID NO.5所示） |
2.4 MethyLight定量PCR体系与数据处理：
定量PCR使用ABI7500型荧光定量PCR仪进行，反应条件按照QIAGEN公司的EpiTect MethyLight PCR + ROX™ Vial Kit (Catalog no：59496)说明：95℃预变性5分钟，95℃变性15秒,60℃退火1分钟,重复45个循环。反应采用20ul体系，包括各0.4uM正向、反向引物及探针。分别根据样本、标准品中 Foxe1、Wnt3和ACTB基因实时定量甲基化PCR扩增的Ct值计算甲基化比例（percentage of
methylated reference，PMR）：dCt样本＝(Ct检测基因-Ct参比基因)样本 , dCt标准品＝(Ct检测基因-Ct参比基因)标准品，ddCt= dCt样本- dCt标准品，PMR=100×2-ddCt。PMR＜4 定义为非甲基化，PMR≥4 定义为甲基化阳性。其中标准品和阴性对照使用QIAGEN公司的Human
control DNA set (containing both bisulfite converted methylated and
unmethylated DNA and unconverted unmethylated DNA) (Catalog no：59695)。
2.5 提取总RNA和逆转录：采用Trizol抽提法提取细胞或组织总RNA，逆转录反应采用美国Promega公司试剂说明书进行，得到cDNA 产物保存于-20℃备用。
2.6 统计学分析: 本研究的统计学分析应用SPSS16.0完成。计量数据采用均数±标准差（SD）描述，组间比较采用two-tailed
Chi-square和Mann-Whitney U完成。P＜0.05时认为差异具有统计学意义。
二．结果分析
1. 首先我们在收集各种样本的同时比较了各种公司的DNA的提取试剂盒以及得到DNA的质量，结果发现如果按照有些文献上方法使用500ul-2ml血清提取到的DNA量很少，无法往下继续实验，而如果按少数文献上使用3-5ml甚至更多血清量来提DNA并不适合今后的临床检测。用粪便提取DNA也存在同样的问题，因此我们决定用全血样本提取DNA，检测肿瘤患者和正常对照全血DNA中Wnt通路相关的基因甲基化程度的不同并希望从中找到能用于早期诊断的甲基化肿瘤标志物。但是由于Wnt通路相关的基因比较多，我们就先采用甲基化芯片检测初筛那些甲基化程度差异大的基因作为候选基因进行深入的验证。在本实施例中我们重点对其中的Wnt通路相关的基因甲基化的差异状态进行分析，结果显示部分基因在肿瘤样本中比正常对照的甲基化程度明显增高（见图1），其中我们选取了FOXE1和WNT3作为进一步验证的对象。
2.我们一共提取了312例结直肠患者和200例正常对照的全血DNA, 亚硫酸氢盐修饰后分别行FOXE1和WNT3两个基因的MethyLight甲基化定量分析。结果显示在肿瘤患者中FOXE1、WNT3的ddCt平均值为7.022、7.941，而在正常对照中为8.679、9.422（见图2和图3）。
3.根据甲基化比例数值定义甲基化和非甲基化: PMR＜4 定义为非甲基化，PMR≥4 定义为甲基化阳性。我们统计了FOXE1、WNT3以及两者合并作为肿瘤标志物的话对诊断结直肠癌的敏感性和特异性（见表2）：如果FOXE1和WNT3单独使用的话敏感性分别是58.3%和32.7%，特异性是79%和86.5%，当它们两者合并使用（即只要有一个基因甲基化就算作阳性），则敏感性能提高到72.4%，但是特异性下降为59%。
表2. FOXE1、WNT3以及两者合并作为肿瘤标志物的话对诊断结直肠癌的敏感性和特异性
4.为了分析甲基化肿瘤标志物对早期诊断的价值，我们比较了其中199例结直肠癌患者FOXE1、WNT3合并使用与CEA诊断价值的比较，发现甲基化肿瘤标志物在各期肿瘤患者中的敏感性相当，I期就达到62%，而CEA在I期的敏感性只有26.7%（见表3）：
表3. FOXE1、WNT3以及两者合并作为肿瘤标志物的话对诊断结直肠癌的敏感性和特异性
三．讨论
结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其较高的发病率和死亡率对人类的健康造成了严重的威胁。目前结肠镜对结直肠癌检查的灵敏度和特异性最高，但由于费用较高、患者痛苦较大和操作要求高等原因降低了患者愿意做该项检查的程度，致使很多患者拖到晚期。肿瘤标志物具有微创、检测方便、费用低、便于普查等优点，并具有较高的敏感性和特异性，结直肠癌的发生发展是多种基因损伤的结果，目前还没找到理想的肿瘤标志物。
基因启动子过甲基化的本质是一种DNA分子异常，它与肿瘤的发生关系密切，是导致许多肿瘤相关基因表达失活的一个重要原因。高水平的基因甲基化常常和肿瘤的高危险性相关，可以用于肿瘤的分类诊断，成为重要的分子生物学标记，异常的基因启动子甲基化多发生于肿瘤早期，这为大多数肿瘤的早期诊断及判断肿瘤预后、转归、评价疗效提供了一个非常有前景的方法。近年来，对遗传性和散发性结直肠癌的研究取得了突破性进展，现已证实，结直肠癌发生的早期与Wnt信号转导通路密切相关。研究发现，90%以上的大肠癌存在Wnt经典信号传导通路的激活，更重要的是在临床上可识别的肿瘤出现之前，Wnt途径的改变就已经在干细胞动力学方面引起了重要的变化，这为肿瘤的早期预警和复发监测带来了希望。
通过本发明的研究，证明利用我们自行设计的引物和探针能够检测到2个Wnt通路基因FOXE1和WNT3基因在结直肠癌患者和正常对照全血DNA中的甲基化状态有显著性差异，FOXE1基因和WNT3基因连用的话敏感性能高达79%，而且即使I期肿瘤患者的敏感性也能达到63.3%，显示在全血DNA中寻找甲基化肿瘤标志物的可行性。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江大学医学院附属邵逸夫医院
<120> FOXE1基因和WNT3基因的应用及该基因的甲基化扩增引物和探针
<130> 1
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
tcgtagggtt
ggagatttac 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gaaacgaaaa
caacgaaatc g
21
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
cgccgtggag
aggaccagcc tcaggt 26
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gcgtcgttcg
tagttagatt ttcg 24
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
acttccaacc
tcccgaatcc g 21
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
ccgctctcta
acctctcgtc ctaaccgc 28
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
tggtgatgga
ggaggtttag taagt 25
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
aaccaataaa
acctactcct cccttaa 27
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
accaccaccc
aacacacaat aacaaacaca 30
Claims (2)
1.FOXE1基因和/或WNT3基因作为甲基化结直肠癌肿瘤标记物的应用。
2.一种结直肠癌肿瘤的甲基化扩增引物和探针，其特征在于包括FOXE1标记引物和/或WNT3标记引物，所述的FOXE1标记引物包括引物Foxe1 M-F、引物Foxe1 M-R和探针Foxe1 Probe，所述的Foxe1 M-F序列如SEQ ID NO.1所示，所述的引物Foxe1 M-R序列如SEQ ID NO.2所示，所述的探针Foxe1 Probe序列如SEQ ID NO.3所示；所述的WNT3标记引物包括引物Wnt3 M-F、引物Wnt3 M-R和探针Wnt3 Probe，所述的引物Wnt3 M-F序列如SEQ ID NO.4所示，所述的引物Wnt3 M-R序列如SEQ ID NO.5所示，所述的探针Wnt3 Probe序列如SEQ ID NO.6所示。
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-
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140611 |