CN107287279A - 膀胱癌检测方法及套组 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了膀胱癌检测方法及套组。具体地，本发明涉及诊断膀胱癌或泌尿系统癌症的方法及套组，是利用分析个体的检体中一或多个目标基因甲基化状态判断膀胱或泌尿系统发生癌变的可能性，其中该目标基因是选自由PAX1、SOX1、ZNF582、NKX6‑1及PTPRR组成的群。

Description

膀胱癌检测方法及套组
技术领域
本发明涉及利用生物标记分子筛检膀胱癌或泌尿系统癌症的检测方法及套组。
背景技术
癌症是目前世界上十大死亡原因之一，各国积极研究提早预防性检测或是罹癌预后检测的方法，期能在早期癌症时提早筛检，提高治愈机率。传统检验癌症的有无，例如X光、抹片、血液肿瘤标志、超音波等等，癌症筛检率约为0.2～0.3％，但这些检验与判读往往耗工费时，方便性不足，且筛检率偏低，迄今仍无法说服大众这些一般性健康检查能有效的早期诊断癌症。
过去的研究显示，在特定基因的高度甲基化(site-specific hypermethylation)与其功能的丧失有关，从而被利用在癌症诊断，例如，台湾专利第I-329743号(亦即美国专利US 7820386 B2)，是关于一种子宫颈癌高危险性筛检的方法，利用检测一子宫颈样本检体中目标基因的CpG序列甲基化状态判断子宫颈癌的可能性，该目标基因是由SOX1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WT1及ONECUT1所组成。另一件台湾专利第I-385252号(亦即美国专利US8048634 B2)，也是利用检测受测检体细胞中目标基因甲基化的状态以筛检癌症的方法，该目标基因是由PTPRR,ZNF582,PDE8B及DBC1所组成。基因甲基化检测学理虽发展已有相当时日，亦为学术研究者广泛使用，然如欲应用于医疗检测等临床相关领域，则测试稳定度及具有重复性是非常重要，针对不同目标基因于不同癌症医疗检测的应用尚需进一步开发及验证。
在美国癌症患者排名中，膀胱癌在男性名列前四名，女性则位居第九。每年有超过47,000位男性和16,000女性被诊断出膀胱癌。而一般膀胱癌或泌尿系统癌的诊断不外乎身体检查、尿液培养、膀胱镜、静脉注射肾盂摄影术等，但尚无一可用于早期诊断的方法。
2011年Chung等教示六种特定基因的甲基化与膀胱癌有关，包括MYO3A、CA10、SOX11、NKX6-2、PENK及DBC1，可使用于尿液检体临床上的检查。(Chung等，CancerEpiodemiol Biomarkers Prev.20(7):1483-1491,2011)。另有一文献提及BRCA1,RARB及WT1可供检测膀胱癌，于尿液检体中抑制甲基化的标识基因，利用包含多个抑制甲基化的标识基因的专一于甲基化的多丛连结依赖探针(methylation-specific multiplexligation-dependent probe，MS-MLDP)检测尿液检体(Cabello等，J.Mol.Diagn.13:29-40,2011)。但其他目标基因尚无建立与膀胱癌在临床上的意义及相关验证。
发明内容
本发明的目的，即在提供针对膀胱癌或泌尿系统癌症检测，有别于已知标识基因的具高特异性及灵敏度的标识基因，检测检体中该等基因甲基化的有无，进而判断癌变发生的可能性，尤其可利用在早期诊断上。又因为方法快速且简便，且可用于尿液等检体的检测，成本低且对受检个体不会造成压力，可开发为一般消费者使用或大量筛检的检测套组。
因此，本发明一方面提供一种检测膀胱癌或泌尿系统癌症的方法，包含：分析待检测个体的检体中一或多个目标基因甲基化状态判断膀胱或泌尿系统发生癌变的可能性，其中该目标基因系选自由PAX1、SOX1、ZNF582、NKX6-1及PTPRR组成的群，如一个体的检体经检测判定该目标基因有甲基化，判定膀胱或泌尿系统有发生癌变的可能性。
根据本发明的实施例，可用于尿液、血液、粘液、泌尿系统上皮细胞、黏膜脱落细胞或手术后的癌症组织等离体的检体的检测，泌尿系统尤佳为尿液。
根据本发明的实施例，本发明方法可用于早期诊断及术后或治疗后追踪。
根据本发明的实施例所述的癌症包含膀胱癌及泌尿道细胞癌。
另一方面，本发明提供用于一种检测套组以供实施本发明方法。
附图说明
图1提供疾病组与正常组针对目标基因PAX1甲基化状态的甲基化状态分布。
图2提供疾病组与正常组针对目标基因SOX1甲基化状态的甲基化状态分布。
图3提供疾病组与正常组针对目标基因ZNF582甲基化状态的甲基化状态分布。
图4提供疾病组与正常组针对目标基因PAX1甲基化状态检测诊断膀胱癌发生可能性的ROC曲线及AUC。
图5提供疾病组与正常组针对目标基因SOX1甲基化状态检测诊断膀胱癌发生可能性的ROC曲线及AUC。
图6提供疾病组与正常组针对目标基因ZNF582甲基化状态甲基化状态检测诊断膀胱癌发生可能性的ROC曲线及AUC。
具体实施方式
本发明提供一种检测膀胱癌或泌尿系统癌的方法，包含：分析待检测个体的检体中一或多个目标基因甲基化状态判断膀胱癌或泌尿系统发生癌变的可能性，其中该目标基因系选自由PAX1、SOX1、ZNF582、NKX6-1及PTPRR组成的群，如一个体检体经检测判定目标基因有甲基化，判定膀胱或泌尿系统有发生癌变的可能性。
根据本发明，本发明方法可用以检测泌尿系统不正常细胞增生现象，包括但不限于癌前病变检测、肿瘤检测、肿瘤复发检测或肿瘤用药预测或愈后效果检测。
本文中使用的术语“泌尿系统”，系指负责尿液的产生、运送、储存与排泄的系统。人类的泌尿系统包括左右两颗肾脏、左右两条输尿管、膀胱、内外两道括约肌，以及尿道。
本文中使用的术语“检体”，系指来自待测个体的体液或组织，包含但不限于尿液、血液、泌尿系统上皮细胞或手术后的癌症组织等离体的检体。
为进行本发明目标基因及内部控制基因检测，可以连锁扩增产物的鉴定方法进行，包括但不限于荧光法、定序法(sequencing)、微数组(microarrays)、质谱仪分析(massspectrometer)、变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquidchromatography,DHPLC)、焦磷酸定序(pyrosequencing)或免疫分析法(immunoassay)。
为实施本发明方法，本发明亦提供一种检测套组，其包含：
含侦测目标基因的混合液，其至少包含有针对一或多个目标基因甲基化区域的正向引子、反向引子对或探针；其中该目标基因系选自由PAX1、SOX1、ZNF582、NKX6-1及PTPRR组成的群；
含侦测内部控制基因的混合液，其至少包含可侦测内部控制基因的正向引子、反向引子对或探针；
一聚合酶连锁扩增反应主要混合液。
可参考台湾专利第I-513822号所述方法，将该待测个体检体萃取出其gDNA，经适当前处理及化学反应，检测检体中基因CpG序列甲基化的存在与否。
根据本发明，该针对目标基因PTPRR甲基化区域的正向引子、反向引子或探针的序列系选自SEQ ID No：69-84所示的核苷酸序列，其具有至少80％或至少90％同一性的序列，与其任一序列中至少连续十个核苷酸相同的序列，及其互补序列组成的群。
根据本发明，可利用该目标基因引子对及/或探针进行侦测。其目标基因引子对及/或探针序列系选自SEQ ID No：1-84所示的核苷酸序列，其具有至少有80％或90％同一性的序列，与其任一序列中至少连续十个核苷酸相同的序列，及其互补序列组成的群。
根据本发明，其中该内部控制基因系选自于由以下至少一种或一种以上的基因：Col2A、β-Globin、GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、β-actin所组成的群。
根据本发明实施例，该可侦测内部控制基因扩增产物的正向引子、反向引子探针对及/或探针序列系选自SEQ ID No：85-94所示的核苷酸序列所示的核苷酸序列，其具有至少80％或至少90％同一性的序列，与其任一序列中连续至少十个核苷酸相同的序列，及其互补序列组成的群。
根据本发明实施例，该聚合酶连锁扩增反应主要混合液的主要成分至少包含聚合酶、dNTPs及镁盐。
根据本发明实施例，其中该侦测目标基因的混合液与侦测内部控制基因的混合液可混合成为单管核酸分子侦测混合液。
以下提供实施本发明方法的具体实施例，用以阐述本发明的技术特征与功效；但不应作为限缩或被解释为实施本发明的限制。
实施例
实施例1检验方法的建立及套组的制备
参考台湾专利第I-513822号所述方法，于检体中抽取其DNA，经重亚硫酸盐(bisulfite)的转换，并以表1至表6所示用于扩增目标基因PAX1、SOX1、ZNF582、NKX6-1、PTPRR甲基化区域及内部控制基因的引子及探针组进行甲基化检测。表1用来扩增目标基因PAX1甲基化区域的引子对及探针组
表2用来扩增目标基因ZNF582甲基化区域的引子对及探针组
序列编号 ZNF582引子及探针组
SEQ ID No:26 5’acgatttacgcggagttagaag 3’
SEQ ID No:27 5’tgacggttttttgtttattcggttattc 3’
SEQ ID No:28 5’agtgacggttttttgtttattcggttattc 3’
SEQ ID No:29 5’cggagggatattgcggcgtcggt 3’
SEQ ID No:30 5’atgggaacgtaacggatga 3’
SEQ ID No:31 5’atttaacgatttacgcggag 3’
SEQ ID No:32 5’aaacgtacctacgcaatacgcga 3’
SEQ ID No:33 5’cgaacgcaaacgtacctacgc 3’
SEQ ID No:34 5’accgaacgcaaacgtacctacgca 3’
SEQ ID No:35 5’acccaaaacgcgcttccacca 3’
SEQ ID No:36 5’cgaataaccgaataaac 3’
SEQ ID No:37 5’tacgcgaaaaaatac 3’
SEQ ID No:38 5’cgccgtacgcaaccga 3’
SEQ ID No:39 5’atttcaaaataaaaccgaacgc 3’
SEQ ID No:40 5’acccgaccttaaaaccgaat 3’
表3用来扩增目标基因SOX1甲基化区域的引子对及探针组
表4用来扩增目标基因NKX6-1甲基化区域的引子对及探针组
表5用来扩增目标基因PTPRR甲基化区域的引子对及探针组
序列编号 PTPRR引子及探针组
SEQ ID No:69 5’gcgttgttgttgggttgtt3’
SEQ ID No:70 5’aagtcgtcgttaagattcggagaagcgg3’
SEQ ID No:71 5’cggcgttgggtatgtttagtagtc3’
SEQ ID No:72 5’agtcgcggcgttgttgttg 3’
SEQ ID No:73 5’tgggtatgtttagtagtcgcgg 3’
SEQ ID No:74 5’agattcggagaagcggaattt3’
SEQ ID No:75 5’gttggcgcggagtttattt 3’
SEQ ID No:76 5’tacctaaccttctaaacgccca 3’
SEQ ID No:77 5’actaaacatacccaacgccgaccc 3’
SEQ ID No:78 5’acgacaaatacctaaccttctaaacgccc3’
SEQ ID No:79 5’acgacaaatacctaacctt 3’
SEQ ID No:80 5’tccgaaattcaaatcctcgacta 3’
SEQ ID No:81 5’aattacgaataaaaaaaacaaaaacgctc3’
SEQ ID No:82 5’accgccaaaaatcttctaatctccgaa 3’
SEQ ID No:83 5’ttgtcggcgttatagattgattgttt3’
SEQ ID No:84 5’caatcaatctataacgccgacaaa3’
表6用来扩增内部控制组基因甲基化区域的引子对及探针组
序列编号 内部基因控制组引子及探针组
SEQ ID No:85 5’agggttattttgaaaagggagatat 3’
SEQ ID No:86 5’ttttaaggggaagatgggatagaag 3’
SEQ ID No:87 5’agaggtggggataggtattgggt 3’
SEQ ID No:88 5’cttctatcccatcttccc 3’
SEQ ID No:89 5’ttcattctaacccaatacct 3’
SEQ ID No:90 5’tgttagagtaaagtatagagt 3’
SEQ ID No:91 5’aacccaatacctatccccacctc 3’
SEQ ID No:92 5’aacaattataaactccaaccaccaaac 3’
SEQ ID No:93 5’actccaaccaccaaaccttcattct 3’
SEQ ID No:94 5’accgaccccactaatacccg 3’
聚合酶连锁反应PCR扩增反应方法步骤如下：(i)在95℃下活化聚合酶10分钟，(ii)在95℃下变性DNA模板10秒及在60℃下键合/延长DNA链40秒，及(iii)进行变性/键合/延长循环30至50次。
同时针对不同目标基因或其基因组合可制成诊断套组，供市售或方便使用，其包含：
-含目标基因引子及/或探针的混合液，其至少包含针对一或多个目标基因甲基化区域的正向引子、反向引子对及/或探针；
-含内部控制基因的混合液，其至少包含针对内部控制基因的正向引子、反向引子对及/或探针；
-聚合酶连锁扩增反应主要混合液；及
-正对照组：一个目标基因及内部控制组基因。
实施例2不同目标基因的甲基化分析
本实施例采6个与泌尿系统相关癌症细胞株或上皮细胞相关的癌症细胞株进行测试，利用表1至表6所揭示用来扩增目标基因PAX1、ZNF582、SOX1、NKX6-1、PTPRR及内部控制组基因甲基化区域的引子对及探针组，来进行不同目标基因的甲基化程度的分布分析，甲基化程度以目标基因与内控基因的Cp值(循环数值)差异计算：△Cp＝Cp目标基因–Cp内部控制组。PAX1、SOX1、ZNF582、NKX6-1及PTPRR的甲基化状态分析结果与已知标识基因WT1、DBC1比较如表7所示。
表7不同目标基因甲基化检测泌尿系统癌症细胞株的结果
实施例3不同目标基因的甲基化分析
本实施例采6个癌症组织，利用表1至表6所揭示用来扩增目标基因PAX1、ZNF582、SOX1、NKX6-1、PTPRR及内部控制组基因甲基化区域的引子对及探针组，来进行不同目标基因的甲基化程度的分布分析，甲基化程度以目标基因与内控基因的Cp值(循环数值)差异计算：△Cp＝Cp目标基因–Cp内部控制组。PAX1、SOX1、ZNF582、NKX6-1及PTPRR的甲基化状态分析检测膀胱癌与肺癌结果如表8所示，显示该等目标基因相对于肺癌细胞，特别专一于膀胱癌的检测。
表8不同目标基因于膀胱癌与肺癌细胞的甲基化表现
实施例4不同目标基因的甲基化程度分析
本实施例采14个正常尿液检体(正常组)及22个确诊为膀胱癌个体的尿液检体(疾病组)，利用表1至表6所揭示用来扩增目标基因PAX1、ZNF582、SOX1及内部控制组基因甲基化区域的引子对及探针组，来进行不同目标基因的甲基化程度的分布分析，甲基化程度以目标基因与内控基因的Cp值(循环数值)差异计算：△Cp＝Cp目标基因–Cp内部控制组。PAX1、SOX1及ZNF582的甲基化状态分析结果如图1、2及3所示。
如图1、2及3所示，疾病组针对不同目标基因PAX1、SOX1及ZNF582的甲基化状态分布及其平均值相对于正常组，均有一显著的差异，足以区分为癌变检体与正常检体，证实确可作为筛检膀胱癌有无的筛检指标。
实施例5尿液检体检测方法敏感度及特异性的计算
本实施例使用已确诊为正常(正常组)与膀胱癌(疾病组)的尿液检体共36个，包括正常组14个及疾病组22个，经抽取DNA，重亚硫酸盐(bisulfite)转换，并以表1至表3揭示用于扩增PAX1、SOX1及ZNF582甲基化区域的引子对及探针组检测其甲基化状态，分别针对目标基因PAX1、SOX1及ZNF582甲基化区域及其不同组合进行分析，并计算使用该等目标基因或目标基因组合检验方法的敏感度(sensitivity)及特异性(specificity)，其结果见表9。进一步分析其接收者操作特征曲线(Receiver Operating Characteristic Curve，ROC曲线)并计算曲线下面积(Area under the Curve,AUC)，针对不同目标基因PAX1、SOX1及ZNF582甲基化状态检测诊断膀胱癌发生可能性的ROC曲线及AUC如图4、5及6所示。
如表9所示，不同目标基因于正常组呈现甲基化的检体数，以单一基因分析分别为PAX1有1位，SOX1有2位及ZNF582有1位，以其组合分析分别为PAX1/ZNF582有1位，PAX1/SOX1有2位，SOX1/ZNF582有2位，以及PAX1/SOX1/ZNF582有2位；而于疾病组呈现甲基化的检体数，以单一基因分析分别为PAX1有17位，SOX1有18位及ZNF582有13位，以其组合分析分别为PAX1/ZNF582有18位，PAX1/SOX1有18位，SOX1/ZNF582有19位，以及PAX1/SOX1/ZNF582有19位，计算其膀胱癌诊断的敏感度均在50％以上，甚至高达86％以上(SOX1/ZNF582)，其特异性则高于85％，更高达92％以上(PAX1及ZNF582)，足以证实该等基因及其任一组合可作为膀胱癌的筛检指标。
综上，无论是检测单独的PAX1、SOX1、ZNF582的甲基化状态，或其任一组合，均可有效于尿液、组织检体中诊断膀胱或泌尿系统发生癌变的可能性。
表9不同目标基因甲基化检测诊断膀胱癌结果以及敏感度与特异性

Claims (13)

1.一种检测膀胱癌或泌尿系统癌症的方法，包含：分析待检测个体的检体中一或多个目标基因甲基化状态判断膀胱或泌尿系统发生癌变的可能性，其中该目标基因是选自由PAX1、SOX1、ZNF582、NKX6-1及PTPRR组成的群，如一个体检体经检测判定目标基因有甲基化，判定膀胱或泌尿系统组织有发生癌变的可能性。
2.根据权利要求1所述的方法，其用以检测泌尿系统不正常细胞增生现象。
3.根据权利要求2所述的方法，其中待检测的不正常细胞增生包含癌前病变检测、肿瘤检测、肿瘤复发检测或肿瘤用药预测或愈后效果检测。
4.根据权利要求1所述的方法，其中该检体为尿液、血液、粘液、黏膜脱落细胞、泌尿系统上皮细胞或手术后的癌症组织等离体的检体。
5.根据权利要求1所述的方法，其中该检体为尿液。
6.根据权利要求1所述的方法，其是用于早期诊断或治疗追踪。
7.根据权利要求1所述的方法，其中该泌尿系统癌症为泌尿道细胞癌。
8.根据权利要求1所述的方法，其包含由该待测个体检体萃取出其gDNA，经适当前处理及化学反应，检测检体中基因CpG序列甲基化的存在与否，判定该待测个体有发生癌变的可能性。
9.根据权利要求1或5所述的方法，其中该目标基因甲基化状态是以连锁扩增产物后以荧光法、定序法、微数组、质谱仪分析、变性高效液相色谱、焦磷酸定序或免疫分析法分析。
10.一种用于根据权利要求1至7中任一项所述的方法的检测套组，其包含：
(1)含侦测目标基因的混合液，其至少包含有针对一或多个目标基因甲基化区域的正向引子、反向引子对或探针；其中该目标基因是选自由PAX1、SOX1、ZNF582、NKX6-1及PTPRR组成的群；
(2)含侦测内部控制基因的混合液，其至少包含可侦测内部控制基因的正向引子、反向引子对或探针；及
(3)一聚合酶连锁扩增反应主要混合液。
11.根据权利要求8所述的检测套组，其中该含侦测目标基因的混合液包含针对一或多个目标基因甲基化区域的正向引子、反向引子对及探针；及该侦测内部控制基因的混合液包含可侦测内部控制基因的正向引子、反向引子对及探针。
12.根据权利要求8所述的检测套组，其中该针对目标基因PTPRR甲基化区域的正向引子、反向引子的序列是选自SEQ ID No：69-84所示的核苷酸序列，其具有至少80％或至少90％同一性的序列，与其任一序列中至少连续十个核苷酸相同的序列，及其互补序列组成的群。
13.根据权利要求8所述的检测套组，其中该针对目标基因PTPRR甲基化区域的探针序列是选自SEQ ID No：69-84所示的核苷酸序列，其具有至少80％或至少90％同一性的序列，与其任一序列中至连续十个核苷酸相同的序列，及其互补序列组成的群。
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