CN106047858A - 一种粪便核酸甲基化纯化方法 - Google Patents

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Abstract

一种粪便核酸甲基化纯化方法，包括以下步骤：提供待100ul粪便溶液至离心管中；向该离心管中1mL裂解液，该裂解液由0.3N氢氧化钠、0.4M氯化钾、0.025％N月桂酰肌氨酸钠、2mM EDTA、0.4M Tris HCL和1.5％曲通X‑100组成；向离心管中加入100ul ph值为5.5的转化液，将离心管搁置于75℃的恒温中90Min；冷却至室温加入10ul磁珠溶液，混匀，放置15Min；将离心管放置于磁力架上5Min，去掉清液；重复上述第二步骤至第六步骤动作，直至磁珠分离后，转移上清液至另一离心管中。

Description

一种粪便核酸甲基化纯化方法
技术领域
本发明涉及医疗检测领域，尤其涉及一种粪便核酸甲基化纯化方法。
背景技术
甲基化是指从活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上将甲基催化转移到其他化合物的过程。可形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。在生物系统内，甲基化是经酶催化的，这种甲基化涉及重金属修饰、基因表达的调控、蛋白质功能的调节以及核糖核酸(RNA)加工。
DNA甲基化：脊椎动物的DNA甲基化一般发生在CpG位点(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点，即DNA序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位点)。经DNA甲基转移酶催化胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶。人类基因中约80％-90％的CpG位点已被甲基化，但是在某些特定区域，如富含胞嘧啶和鸟嘌呤的CpG岛则未被甲基化。这与包含所有广泛表达基因在内的56％的哺乳动物基因中的启动子有关。1％-2％的人类基因组是CpG群，并且CpG甲基化与转录活性成反比。
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。
现阶段，核酸自动化提取过程包含：样本裂解、磁珠吸附、洗涤纯化、核酸洗脱，其过程复杂，步骤较多，造成处理基因的DNA损耗较多。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种粪便核酸甲基化纯化方法，其目的为减小提取步骤、提高纯化效率。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种粪便核酸甲基化纯化方法，包括以下步骤：
步骤一：提供待100ul粪便溶液至离心管中；
步骤二：向该离心管中1mL裂解液，该裂解液由0.3N氢氧化钠、0.4M氯化钾、0.025％N月桂酰肌氨酸钠、2mM EDTA、0.4M Tris HCL和1.5％曲通X-100组成；
步骤三：向离心管中加入100ul ph值为5.5的转化液，该转化液含有亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铵中任一种；
步骤四：将离心管搁置于75℃的恒温中90Min；
步骤五：冷却至室温加入10ul磁珠溶液，混匀，放置15Min；
步骤六：将离心管放置于磁力架上5Min，去掉清液；
步骤七：重复上述第二步骤至第六步骤动作，直至磁珠分离后，转移上清液至另一离心管中。
与现有技术相比，本发明粪便核酸甲基化纯化方法的有益效果在于：裂解样本(粪便)与亚硫酸盐处理同时进行，在裂解液中直接转变核酸样本中未被甲基化的C碱基为U碱基，然后加入与甲基化序列互补并固定于磁珠的核酸片段，特异纯化甲基化核酸，减小提取步骤、提高纯化效率。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
一种粪便核酸甲基化纯化方法，包括以下步骤：
步骤一：提供待100ul粪便溶液至离心管中；
步骤二：向该离心管中1mL裂解液，该裂解液由0.3N氢氧化钠、0.4M氯化钾、0.025％N月桂酰肌氨酸钠、2mM EDTA、0.4M Tris HCL和1.5％曲通X-100组成；
步骤三：向离心管中加入100ul ph值为5.5的转化液，该转化液含有亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铵中任一种；
步骤四：将离心管搁置于75℃的恒温中90Min；
步骤五：冷却至室温加入10ul磁珠溶液，混匀，放置15Min；
步骤六：将离心管放置于磁力架上5Min，去掉清液；
步骤七：重复上述第二步骤至第六步骤动作，直至磁珠分离后，转移上清液至另一离心管中。
裂解样本(粪便)与亚硫酸盐处理同时进行，在裂解液中直接转变核酸样本中未被甲基化的C碱基为U碱基，然后加入与甲基化序列互补并固定于磁珠的核酸片段，特异纯化甲基化核酸，减小提取步骤、提高纯化效率。

Claims (1)

1.一种粪便核酸甲基化纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：提供待100ul粪便溶液至离心管中；
步骤二：向该离心管中1mL裂解液，该裂解液由0.3N氢氧化钠、0.4M氯化钾、0.025％N月桂酰肌氨酸钠、2mM EDTA、0.4M Tris HCL和1.5％曲通X-100组成；
步骤三：向离心管中加入100ul ph值为5.5的转化液，该转化液含有亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铵中任一种；
步骤四：将离心管搁置于75℃的恒温中90Min；
步骤五：冷却至室温加入10ul磁珠溶液，混匀，放置15Min；
步骤六：将离心管放置于磁力架上5Min，去掉清液；
步骤七：重复上述第二步骤至第六步骤动作，直至磁珠分离后，转移上清液至另一离心管中。
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