CN117448316A - 寡核苷酸捕获探针、含有其的试剂盒和靶标dna的检测方法 - Google Patents

寡核苷酸捕获探针、含有其的试剂盒和靶标dna的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种寡核苷酸捕获探针、含有其的试剂盒和靶标DNA的检测方法，所述寡核苷酸捕获探针为具有修饰基团的单链DNA，所述单链DNA包括靶标DNA捕获片段，或者还包括其他片段；所述单链DNA在游离状态下具有二级结构，所述二级结构是通过单链DNA之间或/和单链DNA内部的若干碱基互补配对形成，若干碱基互补配对所需自由能的绝对值低于10.4kcals/mol。采用该捕获探针，能够于复杂样本(例如粪便)中、在其他DNA干扰严重的情况下实现靶标DNA的捕获，捕获特异性强。

Description

寡核苷酸捕获探针、含有其的试剂盒和靶标DNA的检测方法
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及一种寡核苷酸捕获探针、含有其的试剂盒和靶标DNA的检测方法。
背景技术
从复杂的样本中分离提取出的核苷酸在现代生物学和医学中有着极其广泛的应用，其可用于物种鉴定、产前诊断、肿瘤筛查和肿瘤预后监测等。核苷酸的提取量和提取纯度会影响下游检测技术(如PCR检测、测序及分子杂交等)的灵敏度和特异性。为了能够进行定向检测，通常采用靶向捕获探针从样本中富集目标核苷酸，再通过洗脱来分离捕获探针和目标核苷酸进而获得相应的产物。目前多数靶向捕获探针由能够特异性与目标核苷酸结合的DNA分子和经过处理的磁珠构成，该DNA分子通常为线性单链，其自身不会形成二级结构，通过特殊处理其可以共价或非共价的方式偶联在磁珠上，从而用于从样本中靶向捕获目标核苷酸和与目标核苷酸分离。然而，在某些情况下(从复杂样本例如粪便样本中提取目标核苷酸)，目标核苷酸在样本中的含量极低，且样本中存在大量的背景核苷酸，即使使用靶向捕获探针来富集目标核酸，样本中的背景核苷酸仍然会严重影响目标核苷酸的纯度，从而影响后续检测技术(如PCR检测、测序及分子杂交等)的灵敏度和特异性，进而影响对结果的判断。因此，有必要发明新型捕获探针，以实现复杂样本中目标核苷酸的捕获，提高复杂样本中靶向捕获目标核苷酸的纯度，从而提高后续检测的准确性。有鉴于此，特提出本申请。
发明内容
本申请实施例的目的之一包括提供一种寡核苷酸捕获探针，该寡核苷酸捕获探针基于其独特设计，能够从复杂样本(例如粪便)中捕获靶标DNA，捕获特异性强。
在本申请的第一方面，提供一种寡核苷酸捕获探针，所述寡核苷酸捕获探针为具有修饰基团的单链寡核苷酸，所述单链寡核苷酸由核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸组成；
所述单链寡核苷酸包括靶标DNA捕获片段；
所述单链寡核苷酸在游离状态下会自发形成二级结构，所述二级结构通过单链寡核苷酸之间或/和单链寡核苷酸内部的若干碱基互补配对形成。
在本申请的一些实施例中，所述若干碱基互补配对形成二级结构所需自由能的绝对值低于10.4kcals/mol。
在本申请的一些实施例中，所述二级结构包括二聚体结构和发卡结构中的至少一种；
所述二聚体结构由两条单链寡核苷酸捕获探针之间通过若干碱基互补配对形成；
所述发卡结构由一条单链寡核苷酸捕获探针内部通过若干碱基互补配对形成。
在本申请的一些实施例中，所述寡核苷酸捕获探针自身在游离状态下仅形成二聚体结构；
或，所述寡核苷酸捕获探针自身在游离状态下既能形成所述发卡结构又能形成所述二聚体结构。
在本申请的一些实施例中，所述寡核苷酸捕获探针还包括非捕获片段，所述非捕获片段包括能与所述靶标DNA捕获片段互补配对的若干碱基，所述非捕获片段能够与所述靶标DNA捕获片段互补配对形成所述二级结构。
在本申请的一些实施例中，所述非捕获片段位于所述靶标DNA的捕获片段的5’末端或3’末端。
在本申请的一些实施例中，所述非捕获片段的全部碱基能够与所述靶标DNA捕获片段互补配对。
在本申请的一些实施例中，所述修饰基团选自氨基基团、羧基基团、巯基基团、生物素和荧光素中的一种或多种。
在本申请的一些实施例中，所述若干碱基包括3-10个碱基。
在本申请的一些实施例中，所述若干碱基是连续的或不连续的。
在本申请的一些实施例中，所述捕获探针是长度为10-100个碱基的寡核苷酸。
在本申请的一些实施例中，以GRCh38.p14为参考基因组，所述单链寡核苷酸为特异性捕获TFPI2基因Chr7:93890000-93891000区域正链的DNA片段或/和特异性捕获SDC2基因Chr8:96494500-96495500区域正链的DNA片段。
在本申请的一些实施例中，所述单链寡核苷酸选自如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47所示片段中的一种或多种。
在本申请的第二方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包括：
如第一方面中所述的寡核苷酸捕获探针，以及固相载体；
所述寡核苷酸捕获探针能够通过所述修饰基团与所述固相载体偶联。
在本申请的一些实施例中，所述固相载体包括磁珠。
在本申请的一些实施例中，偶联主要通过作共价作用、离子键相互作用、离子与偶极分子间相互作用或亲和作用实现。
在本申请的一些实施例中，所述试剂盒还包括样本保存试剂、DNA裂解试剂、漂洗试剂、靶标DNA检测试剂中的一种或多种。
在本申请的第三方面，提供一种靶标DNA的富集捕获方法，包括如下步骤：
将第一方面中所述的寡核苷酸捕获探针与含有所述靶标DNA的生物样本接触，得到所述寡核苷酸捕获探针和所述靶标DNA结合的复合体；以及，
从所述生物样本中分离所述复合体。
在本申请的一些实施例中，所述方法在将所述寡核苷酸捕获探针与所述生物样本接触前，还包括将所述捕获探针与固相载体偶联的步骤。
在本申请的一些实施例中，所述固相载体包括磁珠。
在本申请的一些实施例中，所述生物样本包括粪便。
相对于传统技术，本申请的有益效果包括：
本申请提供具有独特设计的寡核苷酸捕获探针，采用该寡核苷酸捕获探针，能够于复杂样本(例如粪便)中、在其他DNA干扰严重的情况下实现靶标DNA的捕获，捕获特异性强。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为新型寡核苷酸捕获探针1-3的二级结构及形成二级结构所需自由能；
图2为新型寡核苷酸捕获探针4-6的二级结构及形成二级结构所需自由能；
图3为新型寡核苷酸捕获探针7-9的二级结构及形成二级结构所需自由能；
图4为新型寡核苷酸捕获探针10-12的二级结构及形成二级结构所需自由能；
图5为线性寡核苷酸捕获探针13和14的基本参数；
图6为使用寡核苷酸捕获探针富集提取粪便样本中TFPI2基因的拷贝数；
图7为新型寡核苷酸捕获探针15-17的二级结构及形成二级结构所需自由能；
图8为新型寡核苷酸捕获探针18和线性寡核苷酸捕获探针19的基本参数。
具体实施方式
下面结合附图、实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1～10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
本发明中，％(w/w)与wt％均表示重量百分比，％(v/v)指体积百分比，％(w/v)指质量体积百分数。
本发明中，单链寡核苷酸捕获探针形成的二级结构是指连接了互补配对碱基对的二维结构，二级结构包括“二聚体”和“发卡结构”。“二聚体”由两条单链寡核苷酸之间的碱基互补配对形成，它是相同或不同的两条单链寡核苷酸之间形成的二级结构。“发卡结构”是寡核苷酸单链分子通过自身回折使得互补的碱基对相遇并通过氢键互补配对，进而形成发卡结构。
游离状态，是指寡核苷酸分子在水溶液种存在的一种状态，其不与其它分子或离子结合形成化合物，以自由形式存在。
非捕获片段：是相对于靶标DNA的捕获片段而言的，指不用于特异性结合靶标DNA的片段。
本申请的第一方面
本申请提供一种寡核苷酸捕获探针，所述寡核苷酸捕获探针为具有修饰基团的单链寡核苷酸，所述单链寡核苷酸由核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸组成；
所述单链寡核苷酸包括靶标DNA捕获片段；
所述单链寡核苷酸在游离状态下会自发形成二级结构，所述二级结构通过单链寡核苷酸之间或/和单链寡核苷酸内部的若干碱基互补配对形成。
所述游离状态是指寡核苷酸分子在水溶液中存在的一种状态，其不与其它分子或离子结合形成化合物，以自由形式存在。
在其中一个示例中，所述若干碱基互补配对形成二级结构所需自由能的绝对值低于10.4kcals/mol，例如为10.4、10.2、10、9.8、9.6、9.4、9.2、9、8.8、8.6、8.4、8.2、8、7.8、7.6、7.4、7.2、7、6.8、6.6、6.4、6.2、6、5.8、5.6、5.4、5.2、5、4.8、4.6、4.4、4.2、4、3.8、3.6、3.4、3.2、3、2.8、2.6、2.4、2.2、2、1.8、1.6、1.4、1.2、1、0.8、0.6、0.4、0.2kcals/mol。
在其中一个示例中，所述二级结构包括二聚体结构和发卡结构中的至少一种；
所述二聚体结构由两条单链寡核苷酸捕获探针之间通过若干碱基互补配对形成；
所述发卡结构由一条单链寡核苷酸捕获探针内部通过若干碱基互补配对形成。
在其中一个示例中，所述寡核苷酸捕获探针自身在游离状态下仅形成二聚体结构；
或，所述寡核苷酸捕获探针自身在游离状态下既能形成所述发卡结构又能形成所述二聚体结构。
在其中一个示例中，所述寡核苷酸捕获探针还包括非捕获片段，所述非捕获片段包括能与所述靶标DNA捕获片段互补配对的若干碱基，所述非捕获片段能够与所述靶标DNA捕获片段互补配对形成所述二级结构。
在其中一个示例中，所述非捕获片段位于所述靶标DNA的捕获片段的5’末端或3’末端。
在其中一个示例中，所述非捕获片段的全部碱基能够与所述靶标DNA捕获片段互补配对。
本申请对修饰基团不做特别限定，例如可以为自氨基基团、羧基基团、巯基基团、生物素和荧光素，可以是其中的一种，也可以是多种的组合，可以理解的是，本申请的修饰基团并不局限于。
在其中一个示例中，所述若干碱基包括3-10个碱基，例如为3、4、5、6、7、8、9、10个碱基。
本申请对所述若干碱基在所述寡核苷酸捕获探针中分布不做特别限定，这些碱基可以是连续的，也可以是不连续的。
在其中一个示例中，所述捕获探针是长度为10-100个(例如为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100)碱基的寡核苷酸。
本申请对靶标DNA不做特别限定，以GRCh38.p14为参考基因组，在其中一个示例中，靶标DNA可以是TFPI2基因Chr7:93890000-93891000区域正链，相应地所述单链寡核苷酸为特异性捕获TFPI2基因Chr7:93890000-93891000区域正链的DNA片段，在另一示例中，靶标DNA为SDC2基因Chr8:96494500-96495500区域正链，相应地所述单链寡核苷酸为特异性捕获SDC2基因Chr8:96494500-96495500区域正链的DNA片段。
可选地，所述单链寡核苷酸选自如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47所示片段中的一种或多种。
本申请的第二方面
本申请提供一种试剂盒，所述试剂盒包括：
如第一方面中所述的寡核苷酸捕获探针，以及固相载体；
所述寡核苷酸捕获探针能够通过所述修饰基团与所述固相载体偶联。
本申请对固相载体不做特别限定，可以是但不限于磁珠。
本申请对偶联的机制不做特别限定，可以选自但不限于通过作共价作用、离子键相互作用、离子与偶极分子间相互作用或亲和作用实现。
可选地，所述试剂盒还包括样本保存试剂、DNA裂解试剂、漂洗试剂、靶标DNA检测试剂中的一种或多种。
本申请的第三方面
本申请提供一种靶标DNA的富集捕获方法，包括如下步骤：
将第一方面中所述的寡核苷酸捕获探针与含有所述靶标DNA的生物样本接触，得到所述寡核苷酸捕获探针和所述靶标DNA结合的复合体；以及，
从所述生物样本中分离所述复合体。
可选地，所述方法在将所述寡核苷酸捕获探针与所述生物样本接触前，还包括将所述捕获探针与固相载体偶联的步骤。
本申请对固相载体不做特别限定，可以是但不限于磁珠。
本申请对偶联的机制不做特别限定，可以选自但不限于通过作共价作用、离子键相互作用、离子与偶极分子间相互作用或亲和作用实现。
本申请对生物样本的种类不做特别限定，可以为但不限于粪便。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
结直肠癌是最常见的恶性消化道肿瘤之一，患者的生存率与确诊时疾病的严重程度密切相关，比如早期患者的5年生存率可达90％以上，而已发生远端转移的患者其5年生存率仅为10％左右。因此，早诊早治是提高结直肠癌患者生命周期的重要途径。目前，肠镜及病理活检是诊断结直肠癌的金标准，但是其具有侵入性，患者依从性差且受医疗资源的限制。粪便潜血检测(FOBT)具有廉价、便捷、无创等优点，但是其检测的假阳性率和假阴性率均较高。
随着分子生物学技术的发展，检测肿瘤细胞基因组遗传信息和表观遗传信息的变化逐渐成为肿瘤检测的新手段。成年人的结肠中每天有数以亿计的上皮细胞脱落进入肠腔。肿瘤患者的结肠中，脱落的肿瘤细胞约占脱落细胞总量的1％。相较于正常的结肠上皮细胞，肿瘤细胞其细胞间的黏附分子表达降低，更容易脱落，且肿瘤细胞自身凋亡机制受抑制，其基因组DNA不易被降解。以上原因是利用粪便DNA诊断结直肠癌的理论基础。
尽管可以从粪便样本中回收的DNA总量非常高，但是人源DNA的含量仅占DNA总量的0.01％左右，而且粪便中人源DNA中还包括了大量来自正常脱落细胞的DNA。因此，在检测肿瘤细胞遗传信息和表观遗传信息的改变时，其检测的敏感性不仅受生物标志物发生突变或发生甲基化改变的水平的影响，还严重受限于粪便中可提取的肿瘤细胞来源的DNA的含量。那么，一种性能优异且稳定性高的从粪便样本中提取目标DNA的方法是急需的。
由于磁珠法核酸分离技术可以通过偶联磁珠的寡核苷酸捕获探针来靶向富集和分离靶标DNA，且可以降低粪便样本中的多糖、胆酸等PCR抑制剂的残留量，因此常被用于从粪便样本中分离低丰度的、发生甲基化水平改变的基因，进而用于结直肠癌或其它消化道疾病的诊断。在粪便DNA靶向提取中，应用最广泛的是链霉亲和素修饰的磁珠和生物素化的寡核苷酸捕获探针的组合，寡核苷酸捕获探针的序列与靶标DNA序列完全互补配对，通过一定条件下的共孵育，探针与样本中游离的靶标DNA杂交，再通过磁性吸附、洗脱等步骤获得靶标DNA片段。虽然使用此方法可以显著提高粪便样本中靶标DNA的捕获效率。但是在实际应用中，样本中靶标DNA片段(如肿瘤细胞中发生甲基化水平改变的DNA)极低的含量，而背景DNA(如细菌DNA)极高的含量，会影响目标DNA提取的特异性；且不同粪便样本的异质性很大，上述方法也会影响目标DNA提取效率的稳定性。因此，失败的靶标DNA捕获提取时有发生，即使提取成功也经常由于样本中靶标DNA的纯度过低而影响后续检测。因此，有必要进一步提高粪便样本中靶标DNA靶向捕获的特异性，提高靶标DNA的纯度。
使用偶联磁珠的寡核苷酸捕获探针捕获提取粪便样本中的人源DNA时，由于细菌DNA的含量远远高于人源DNA的含量，样本中的细菌DNA可能会非特异性地结合寡核苷酸捕获探针，从而影响目标核苷酸的纯度，另外，过多的非特异性结合不可避免地会影响寡核苷酸捕获探针捕获目标核苷酸的效率。因此，本申请提供了一种新型寡核苷酸捕获探针的设计方法，使用所述方法设计的寡核苷酸捕获探针在游离状态时可形成二级结构，如二聚体和发卡结构，控制所述发卡结构和二聚体形成所需的自由能，使其低于10.4kcals/mol。
当新型寡核苷酸捕获探针与样本中的靶标DNA结合以后，探针自身形成的发卡结构或探针之间形成的二聚体结构被破坏。与常规方案设计的线性寡核苷酸捕获探针相比，所述新型寡核苷酸捕获探针可以有效避免粪便样本中大量的非目标DNA的非特异性结合，显著提高捕获的特异性，从而提高目标DNA的纯度。
实施例1：设计TFPI2基因特异性新型寡核苷酸捕获探针
以GRCh38.p14为参考基因组，以TFPI2基因Chr7:93890000-93891000正链作为模板来设计新型寡核苷酸捕获探针。具体的，本实施例提供了4种类型的新型寡核苷酸捕获探针，分别为仅形成二聚体结构且与靶标区域完全互补配对的捕获探针、既可形成二聚体又可形成发卡结构且与靶标区域完全互补配对的捕获探针、将人为设计的B部分片段(也即非捕获片段)添加在与靶标区域完全互补配对的A片段5’端的捕获探针、以及将人为设计的B部分片段添加在与靶标区域完全互补配对的A片段3’端的捕获探针。对于每种类型的新型寡核苷酸捕获探针，又分别提供3条形成二级结构所需不同自由能的探针序列，即自由能的绝对值小于10.4kcals/mol，约等于10.4kcals/mol和大于10.4kcals/mol，用于筛选最优的形成二级结构所需的自由能的范围。另外，本实施例还设计了2条TFPI2基因特异性的线性寡核苷酸捕获探针，所述线性寡核苷酸捕获探针自身不会形成二级结构。上述14条TFPI2基因特异性的寡核苷酸捕获探针的序列及各自形成二级结构所需的自由能如表1所示。每条寡核苷酸捕获探针形成的二级结构如图1、图2、图3和图4所示。分析各个寡核苷酸捕获探针形成二级结构和自由能所用的软件为Primer Premier 5.0.
表1、TFPI2基因特异性寡核苷酸捕获探针
注：探针7-12中，B部分片段的核苷酸序列用加粗斜体表示。
实施例2：分析TFPI2基因特异性新型寡核苷酸捕获探针的捕获灵敏性
人工合成表1中展示的14条寡核苷酸捕获探针，且在每条寡核苷酸捕获探针5’端的第一个碱基上进行生物素修饰。另外，购买商品化的链霉亲和素包被的磁珠，将生物素修饰的寡核苷酸捕获探针用TE缓冲液稀释后，再与涡旋混匀的链霉亲和素包被的磁珠混合，形成磁珠偶联的生物素化的寡核苷酸捕获探针备用。
人工合成TFPI2基因Chr7:93890000-93891000区域正链的DNA片段，使用TE缓冲液重悬作为捕获模板(靶标DNA片段)备用。将捕获模板依次稀释，使每管(600μL)中分别含有102、103、104、105拷贝的靶标DNA片段。
分别向含有0、102、103、104、105拷贝的TFPI2基因片段的离心管中加入100μL充分混匀的磁珠偶联的生物素化的寡核苷酸捕获探针，待磁珠悬液与模板悬液充分混匀后，室温静置孵育45min，使寡核苷酸捕获探针与靶标DNA片段充分结合。随后将上述离心管置于磁力架上吸磁10min，弃上清，收集磁珠沉淀。向上一步获得的磁珠沉淀中加入1mL漂洗液(5mM EDTA、20mM Tris-HCl，80％v/v无水乙醇，pH 8.0)，震荡混匀5s后瞬时离心2～4s，置于磁力架上吸磁2min，弃上清，收集磁珠沉淀。重复洗涤磁珠沉淀一次，将残留液体吸干净。最后向含磁珠沉淀的离心管中加入40μL洗脱液，轻轻震荡混匀，置于55℃孵育10min，再吸磁2min，将上清转移至一洁净离心管中，即得所需靶标DNA样本。
荧光定量PCR法检测使用各种寡核苷酸捕获探针富集含不同拷贝数的靶标DNA片段后的回收效果。对于每一条寡核苷酸捕获探针，设计引物扩增寡核苷酸捕获探针识别的靶标DNA片段，控制扩增子的长度不超过200bp。用于定量分析14条捕获探针富集回收的靶标DNA片段的扩增引物如表2所示。
表2、用于检测各寡核苷酸捕获探针捕获效果的引物对及其对应的扩增子的序列
将上述9对引物对分别人工合成并稀释备用。以人工合成的TFPI2基因Chr7:93890000-93891000区域正链的DNA片段为模板，分别使用表2中提供的引物对进行PCR反应，以得到含各个扩增子的PCR产物。得到的9种PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后进行胶回收，随后使用Nano Drop 2000超微量分光光度计测定回收产物的浓度，并计算拷贝数。将上述准确定量的各个扩增子进行梯度稀释，作为qPCR反应的标准品备用。
对于寡核苷酸捕获探针1富集回收的靶标DNA片段，使用qPCR法对其定量。具体地，取寡核苷酸捕获探针1富集回收的靶标DNA片段10μL作为模板，以引物对1作为扩增引物，使用Fast SYBRTM预混液配置qPCR反应体系，如表3所示，每个样本设置3个复孔。同时，设置标准品反应管，即使用引物对1扩增不同梯度的标准品(0copy/管、10copies/管、102copies/管、103copies/管、104copies/管、105copies/管)，用以绘制标准曲线。上述待测管和标准品管的反应体系配置完成后，按照表4所示的反应程序进行PCR扩增，扩增结束后，导出Ct值。根据标准品的拷贝数和对应的Ct值绘制标准曲线，根据待测管的Ct值计算其DNA的拷贝数，并回算使用捕获探针1富集回收的DNA总拷贝数。
寡核苷酸捕获探针2-14所富集回收的DNA的拷贝数的检测方法同寡核苷酸捕获探针1，使用所述14条磁珠偶联的寡核苷酸捕获探针分别回收到的靶标DNA的拷贝数如表5所示。
表3、qPCR反应体系
组分 体积(μL)
Fast SYBRTM预混液(2×) 10
上游引物(10μM) 1
下游引物(10μM) 1
模板 5
超纯水 3
总体积 20
表4、qPCR反应程序
表5、寡核苷酸捕获探针富集回收TFPI2基因的拷贝数
由表5可以看出，使用自身能形成二级结构的新型寡核苷酸捕获探针富集回收TFPI2基因片段的效果优异。在靶标DNA的投入量为102拷贝的条件下，新型寡核苷酸探针1、2、4、5、7、8、10、11捕获靶标DNA的效率在48％到61％之间，新型寡核苷酸探针3、6、9、12捕获目标基因的效率在26％到35％之间，线性寡核苷酸探针13和14捕获靶标DNA的效率分别为34％和37％。在靶标DNA的投入量为103拷贝的条件下，新型寡核苷酸探针1、2、4、5、7、8、10、11捕获目标基因的效率在69.5％到75.2％之间，新型寡核苷酸探针3、6、9、12捕获靶标DNA的效率在52.1％到58.9％之间，线性寡核苷酸探针13和14靶向捕获靶标DNA的效率分别为60％和61.3％。在靶标DNA的投入量为104和105拷贝的条件下，新型寡核苷酸探针1、2、4、5、7、8、10、11和线性寡核苷酸探针13、14捕获靶标DNA的效率均大于72％，且趋于稳定；而新型寡核苷酸探针3、6、9、12靶向捕获靶标DNA的效率略低。上述结果表明，在新型寡核苷酸探针自身形成二级结构所需的自由能的绝对值低于10.4kcals/mol的条件下，其捕获靶标DNA的效率不低于线性寡核苷酸探针；另外，当靶标DNA片段的含量较低时，自身形成二级结构所需的自由能的绝对值低于10.4kcals/mol的新型寡核苷酸探针的捕获效果优于传统线性寡核苷酸探针。
实施例3：分析TFPI2基因特异性新型寡核苷酸捕获探针的特异性
考虑到粪便样本中含有大量的细菌来源的DNA，本实施例使用靶向TFPI2基因的寡核苷酸捕获探针富集回收粪便样本中靶标DNA片段，并分析表1中列举的寡核苷酸探针的捕获特异性。
1.粪便样本的收集
收集约15g健康人粪便样本，向其中加入45mL粪便保存液(成分：300mmol/L EDTA、200mmol/LTris-HCl和150mmol/L NaCl，pH 9.0)后充分振荡混匀，将所得粪便混悬液置于离心机中高速(13000g)离心2min。收集样本离心后的上清液并将其分装至洁净的1.5mL离心管中，600μL/管，-80℃冻存。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。
2.靶向富集粪便样本中的靶标DNA
使用表1中提供的寡核苷酸捕获探针分别富集提取上述粪便样本中的靶标DNA片段。具体的操作步骤如下：
1)向600μL解冻后的粪便上清液中加入等体积的5mol/L的异硫氰酸胍，轻柔地颠倒混匀，作为均一的粪便裂解液样本备用。
2)将上述粪便裂解液置于95℃放置10min，使DNA变性。
3)将上述样本迅速置于冰上降温，待样本彻底冷却后，向每管加入50μL充分混匀的磁珠偶联的生物素化的寡核苷酸探针，待样本和磁珠充分混匀后，室温静置孵育45min，使捕获探针与靶标DNA充分结合。
4)将上述离心管置于磁力架上吸磁10min，弃上清。
5)向上一步中获得的磁珠沉淀中加入1mL漂洗液(5mM EDTA、20mM Tris-HCl，80％v/v无水乙醇，pH8.0)，震荡混匀5s后瞬时离心2～4s，置于磁力架上吸磁2min，弃上清。
6)重复洗涤一次，将残留液体吸干净。
7)向上一步含磁珠的离心管中加入40μL洗脱液，轻轻震荡混匀，置于55℃孵育10min，再吸磁2min，将上清转移至一洁净离心管中，即得所需DNA样本。
3.qPCR分析寡核苷酸捕获探针靶向富集粪便样本中靶标DNA的灵敏度和特异性
1)寡核苷酸捕获探针靶向富集粪便样本中靶标DNA的灵敏度检测方法：
以表2中提供的引物对，使用qPCR法分别扩增不同捕获探针富集提取的粪便DNA样本，同时制作标准曲线，对粪便样本中TFPI2基因进行定量分析。具体的检测方法同实施例2，检测结果见表6。
表6、寡核苷酸捕获探针富集提取相同粪便样本中TFPI2基因的拷贝数
由表6可以看出，使用自身能形成二级结构的新型寡核苷酸捕获探针从复杂的粪便样本中富集提取人源TFPI2基因的效果良好。对于相同的粪便样本，新型寡核苷酸探针1、2、4、5、7、8、10、11与线性寡核苷酸探针13、14捕获粪便样本中TFPI2基因的拷贝数之间无统计学差异，而新型寡核苷酸探针3、6、9、12捕获粪便样本中TFPI2基因的拷贝数较低，见图6。以上结果表明新型寡核苷酸捕获探针与传统线性捕获探针的捕获性能相似，形成弱的二级结构(自由能的绝对值低于10.4kcals/mol)不会影响寡核苷酸探针的捕获灵敏度。
2)寡核苷酸捕获探针靶向富集粪便样本中靶标DNA的特异性检测方法：
细菌16S rRNA基因保守性极强，其保守区为所有细菌共有，且细菌之间无差别，因而被称为分子化石。若在使用寡核苷酸捕获探针靶向富集提取的DNA产物中检测到16SrDNA则表明样本中存在细菌DNA污染。对于使用不同寡核苷酸捕获探针富集提取的粪便DNA样本，分别加入扩增细菌16S rRNA基因保守区的引物对(上游引物SEQ ID NO.42：5’-GCAACGCGAAGAACCTTACC-3’，下游引物SEQ ID NO.43：5’-ACGTCATCCCCACCTTCCT-3’)，反应液中其它成分按照表3配置，再按照表4提供的反应程序进行扩增，每个样本设置3个复孔。注意在实验过程中细菌污染十分容易出现，因此一定要设置不加模板的阴性对照孔，以保证实验结果准确、可靠。按时上述方法扩增不同捕获探针富集提取的粪便样本中16S rRNA基因的Ct值如表7所示。
表7、寡核苷酸捕获探针富集提取相同粪便样本中16S rDNA的拷贝数
捕获探针 复孔1 复孔2 复孔3
1 Unde Unde Unde
2 Unde Unde Unde
3 Unde Unde Unde
4 Unde Unde Unde
5 Unde Unde Unde
6 Unde Unde Unde
7 Unde Unde Unde
8 Unde Unde Unde
9 Unde Unde Unde
10 Unde Unde Unde
11 Unde Unde Unde
12 Unde Unde Unde
13 37 39 39
14 Unde 38 39
由表7可以看出，使用本发明设计的新型寡核苷酸捕获探针靶向提取粪便样本中的靶标DNA的条件下，样本中不含有细菌DNA的污染，而使用传统的线性寡核苷酸捕获探针时，提取的样本中含有微量的细菌DNA。与传统的线性寡核苷酸捕获探针相比，二级结构自由能的绝对值不超过10.4kcals/mol的新型捕获探针从粪便样本中富集提取目标基因的特异性更佳，所得的目标基因纯度更高，能有效提高检测的准确性。
实施例4：分析SDC2基因特异性新型寡核苷酸捕获探针的性能
本实施例提供了使用SDC2基因特异性新型寡核苷酸捕获探针富集粪便样本中靶标DNA片段的性能数据。
1.粪便样本的收集，具体的收集过程和处理过程同实施例3。
2.SDC2基因特异性寡核苷酸捕获探针靶向捕获靶标DNA片段
以GRCh38.p14为参考基因组，以SDC2基因Chr8:96494500-96495500正链作为模板，按照实施例1中的寡核苷酸捕获探针的设计方法，共设计4种类型的新型寡核苷酸捕获探针，即仅形成二聚体结构且与靶标区域完全互补配对的捕获探针、既可形成二聚体又可形成发卡结构且与靶标区域完全互补配对的捕获探针、将人为设计的B部分片段添加在与靶标区域完全互补配对的A序列5’端的捕获探针、以及将人为设计的B部分片段添加在与靶标区域完全互补配对的A序列3’端的捕获探针。上述4种类型的新型寡核苷酸捕获探针形成二级结构所需自由能的绝对值均小于10.4kcals/mol.另外还设计了一条SDC2基因特异性的不形成二级结构的线性寡核苷酸捕获探针作为对照。寡核苷酸捕获探针15-19所形成的二级结构如图6、图7和图8所示，具体的寡核苷酸捕获探针的序列如表8所示。分析各个寡核苷酸捕获探针形成二级结构和自由能所用的软件为Primer Premier 5.0。
表8、SDC2基因特异性寡核苷酸捕获探针
注：探针17-18中，B部分片段的核苷酸序列用加粗斜体表示。
将表8中的寡核苷酸捕获探针分别人工合成，并按照实施例2中的方法制备磁珠偶联的生物素化的寡核苷酸捕获探针备用。随后按照实施例3中提供的方法，使用SDC2基因特异性寡核苷酸捕获探针分别靶向捕获上述粪便样本中的靶标DNA片段。
3.寡核苷酸捕获探针捕获靶标DNA片段的性能检测
对于寡核苷酸捕获探针15-19，分别设计引物对扩增其捕获的靶标DNA片段，控制扩增子的长度不超过200bp。用于定量分析上述富集回收的靶标DNA片段的扩增引物如表9所示。
表9、用于检测SDC2基因特异性的寡核苷酸捕获探针捕获效果的引物对
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将上述3对引物对分别人工合成并稀释备用。以人工合成的SDC2基因Chr8:96494500-96495500的正链DNA作为模板，分别使用表9中提供的引物对进行PCR反应，以得到含各个扩增子的PCR产物。得到的3种PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后进行胶回收，随后使用Nano Drop 2000超微量分光光度计测定回收产物的浓度，并计算拷贝数。将上述准确定量的各个扩增子进行梯度稀释，即分别稀释至0copy/管、10copies/管、102copies/管、103copies/管、104copies/管、105copies/管作为qPCR反应的标准品备用。
以上一步中通过寡核苷酸捕获探针富集回收的靶标DNA片段为模板，使用表9中提供的对应的上、下游引物作为引物对，使用Fast SYBRTM预混液配置qPCR反应体系并进行PCR扩增，每个样本设置3个复孔。具体的qPCR反应体系配置、反应程序设置、标准曲线的绘制同实施例2所示。随后，按照实施例2所示的方法计算使用各种寡核苷酸捕获探针回收的SDC2基因片段的DNA拷贝数，如表10所示。
表10、寡核苷酸捕获探针富集回收相同粪便样本中SDC2基因的拷贝数
由表10可以看出，对于等分的粪便样本，SDC2基因特异性的新型寡核苷酸捕获探针富集回收目的DNA片段的效果良好。当新型寡核苷酸捕获探针自身形成二级结构的自由能小于10.4kcals/mol时(捕获探针15-18)，其捕获粪便样本中SDC2基因的拷贝数与线性寡核苷酸捕获探针的捕获能力相似，即形成弱的二级结构不会影响寡核苷酸探针的捕获灵敏度。
进一步地，本实施例使用qPCR法检测了上述富集回收的粪便样本中细菌DNA的残留量，具体的操作过程如实施例3所示，结果如表11所示。
表11、寡核苷酸捕获探针富集提取相同粪便样本中16S rDNA的拷贝数
捕获探针 复孔1 复孔2 复孔3
15 Unde Unde Unde
16 Unde Unde Unde
17 Unde Unde Unde
18 Unde Unde Unde
19 Unde 39 Unde
由表11可以看出，本发明设计的SDC2基因特异性的新型寡核苷酸捕获探针在靶向提取粪便样本中的目的基因片段时，样本中不会出现细菌DNA的污染，而使用传统的线性寡核苷酸捕获探针靶向提取粪便样本中的目的基因片段，则会出现一定概率的细菌DNA污染。因此，使用含有二级结构的新型寡核苷酸捕获探针从粪便样本中靶向提取目标基因片段的特异性更佳，有利于提高DNA片段的回收纯度，使后续的检测准确度更高。
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (13)

1.一种寡核苷酸捕获探针，其特征在于，所述寡核苷酸捕获探针为具有修饰基团的单链寡核苷酸，所述单链寡核苷酸由核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸组成；
所述单链寡核苷酸包括靶标DNA捕获片段；
所述单链寡核苷酸在游离状态下会自发形成二级结构，所述二级结构通过单链寡核苷酸之间或/和单链寡核苷酸内部的若干碱基互补配对形成。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸捕获探针，其特征在于，所述若干碱基互补配对形成二级结构所需自由能的绝对值低于10.4kcals/mol。
3.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸捕获探针，其特征在于，所述二级结构包括二聚体结构和发卡结构中的至少一种；
所述二聚体结构由两条单链寡核苷酸捕获探针之间通过若干碱基互补配对形成；
所述发卡结构由一条单链寡核苷酸捕获探针内部通过若干碱基互补配对形成。
4.根据权利要求3所述的寡核苷酸捕获探针，其特征在于，所述寡核苷酸捕获探针自身在游离状态下仅形成二聚体结构；
或，所述寡核苷酸捕获探针自身在游离状态下既能形成所述发卡结构又能形成所述二聚体结构。
5.根据权利要求1、2或4所述的寡核苷酸捕获探针，其特征在于，所述寡核苷酸捕获探针还包括非捕获片段，所述非捕获片段包括能与所述靶标DNA捕获片段互补配对的若干碱基，所述非捕获片段能够与所述靶标DNA捕获片段互补配对形成所述二级结构；
可选地，所述非捕获片段位于所述靶标DNA的捕获片段的5’末端或3’末端。
6.根据权利要求5所述的寡核苷酸捕获探针，其特征在于，所述非捕获片段的全部碱基能够与所述靶标DNA捕获片段互补配对。
7.根据权利要求1、2、4或6所述的寡核苷酸捕获探针，其特征在于，所述修饰基团选自氨基基团、羧基基团、巯基基团、生物素和荧光素中的一种或多种。
8.根据权利要求1、2、4或6中所述的寡核苷酸捕获探针，其特征在于，以GRCh38.p14为参考基因组，所述单链寡核苷酸为特异性捕获TFPI2基因Chr7:93890000-93891000区域正链的DNA片段或/和特异性捕获SDC2基因Chr8:96494500-96495500区域正链的DNA片段。
9.根据权利要求8所述的寡核苷酸捕获探针，所述单链寡核苷酸选自如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQID NO.46和SEQ ID NO.47所示片段中的一种或多种。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
如权利要求1至9任一项中所述的寡核苷酸捕获探针，以及固相载体；
所述寡核苷酸捕获探针能够通过所述修饰基团与所述固相载体偶联。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，
所述固相载体包括磁珠；
可选地，偶联主要通过作共价作用、离子键相互作用、离子与偶极分子间相互作用或亲和作用实现；
可选地，所述试剂盒还包括样本保存试剂、DNA裂解试剂、漂洗试剂、靶标DNA检测试剂中的一种或多种。
12.一种靶标DNA的富集捕获方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求1至9中任一项所述的寡核苷酸捕获探针与含有所述靶标DNA的生物样本接触，得到所述寡核苷酸捕获探针和所述靶标DNA结合的复合体；以及，
从所述生物样本中分离所述复合体。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法在将所述寡核苷酸捕获探针与所述生物样本接触前，还包括将所述捕获探针与固相载体偶联的步骤；
可选地，所述固相载体包括磁珠；
可选地，所述生物样本包括粪便。
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