JP6750879B2 - Dnaの組織または細胞起源を決定するための方法およびキット - Google Patents
Dnaの組織または細胞起源を決定するための方法およびキット Download PDFInfo
- Publication number
- JP6750879B2 JP6750879B2 JP2016562026A JP2016562026A JP6750879B2 JP 6750879 B2 JP6750879 B2 JP 6750879B2 JP 2016562026 A JP2016562026 A JP 2016562026A JP 2016562026 A JP2016562026 A JP 2016562026A JP 6750879 B2 JP6750879 B2 JP 6750879B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- tissue
- dna
- cell
- methylation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
される。最近の研究により、新しく診断されたT1D患者の循環ならびに膵島移植片レシピエントから非メチル化インスリンプロモーターDNAが同定され、これはβ細胞の自己免疫性および同種免疫性の破壊の両方を反映する可能性がある(非特許文献1、非特許文献2、非特許文献3および非特許文献4)。
前記DNA中の連続配列上の少なくとも4箇所のメチル化部位のメチル化状態を確認することを含み、前記配列はヌクレオチド数300以下であり、前記細胞型または組織に特徴的なDNAの前記連続配列上の前記少なくとも4箇所のメチル化部位のそれぞれのメチル化状態を、前記目的の細胞型由来または組織由来であることの指標とする方法が提供される。
キットであって、核酸配列中の少なくとも4箇所のメチル化部位のメチル化状態を検出し得るオリゴヌクレオチドを含み、前記核酸配列は300塩基対以下であり、且つ少なくとも4箇所のメチル化部位を含み、各メチル化部位は、目的の第1細胞において、第1細胞とは非同一である第2細胞とは異なる様式でメチル化されている部位である、キットが提供される。
(a)試料中のDNAを亜硫酸水素塩と接触させて、DNA中の脱メチル化シトシンをウラシルに変換し、
(b)DNAの連続配列上の少なくとも4箇所のメチル化部位の1箇所目に隣接する核酸配列と、最後の箇所に隣接する核酸配列とのそれぞれにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いて、DNA中の連続配列を増幅し、そして
(c)DNAの連続配列のシーケンシングを行う
ことによって確認を実施する。
これは臨床応用を想定することができる程度である。
チド、105ヌクレオチド、100ヌクレオチド、95ヌクレオチド、90ヌクレオチド、85ヌクレオチド、80ヌクレオチド、75ヌクレオチド、70ヌクレオチド、65ヌクレオチド、60ヌクレオチド、55ヌクレオチド、または50ヌクレオチド以下である。
に固有のメチル化を同定し、同定した特徴が、これらの細胞に由来するDNAと血液細胞に由来するDNAとを上手く識別することができることを示した。
DNA中の連続配列上の少なくとも4箇所のメチル化部位のメチル化状態を確認することを含み、配列はヌクレオチド数300以下であり、細胞に特徴的なDNAの連続配列上の少なくとも4箇所のメチル化部位のそれぞれのメチル化状態を、目的の細胞由来であることの指標とする方法が提供される。
は、膵管細胞中ではメチル化されており、他の細胞(例えば、血液細胞)中では非メチル化されている。
数300以下の連続配列を含む。特定の実施形態によれば、連続配列は、これらの配列のそれぞれの250位および251位に位置するヌクレオチドCGを含む。このCGは、子宮細胞中では非メチル化され、他の細胞(例えば、血液細胞)中ではメチル化されている。
。このCGは、前立腺細胞中では非メチル化され、非前立腺組織の細胞(例えば、血液細胞)中ではメチル化されている。
細胞(例えば、血液細胞)中ではメチル化されている。
ル化部位を含むもの)を分析することを企図することを理解されたい。かくして、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上の(組織または細胞特異的マーカーとして働く)標的配列を分析することができる。これは、同じDNA調製物を用いて同時に、または複数のDNA調製物を用いて行うことができる。
リダイズ可能であるが、相補的ではない配列を含むプライマーにより導入される配列変化など)、および/または増幅中に生じるAを含んでもよい。
文献10ならびに特許文献4、特許文献5および特許文献6(それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる)に開示されている。その最も単純な形式では、PCRは、特定のDNA配列の酵素的合成のためのin vitroでの方法であって、それぞれが反対の鎖にハイブリダイズし、標的DNA中の目的の領域に隣接する2種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。それぞれのサイクルが、変性ステップ、アニーリングステップおよび重合ステップを含む複数の反応サイクルは、特定のDNA断片の指数的蓄積をもたらす(非特許文献11、非特許文献12、非特許文献13、非特許文献14)。増幅された断片の末端は、プライマーの5’末端によって決まる。PCR反応において増幅産物を生成することができるDNAポリメラーゼの例としては、大腸菌DNAポリメラーゼI、DNAポリメラーゼIのKlenow断片、T4 DNAポリメラーゼ、下記より単離された熱安定性DNAポリメラーゼ: Thermus aquaticus(Taq)(種々のメーカー(例えば、Perkin Elmer)から入手可能)、Thermus thermophilus(United States Biochemicals)、Bacillus stereothermophilus(Bio−Rad)、またはThermococcus litoralis(「Vent」ポリメラーゼ、New England Biolabs)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。RNA標的配列は、mRNAをcDNAに逆転写した後、上記のようなPCR(RT−PCR)を実施することにより増幅することができる。あるいは、1種の酵素を、特許文献7に記載のように両ステップに用いることができる。
とができるが、好ましくは、当該方法は、ハイスループットシーケンシング法を含む。典型的な方法としては、本明細書では「454技術」もしくは「454シーケンシング」と呼ばれることもある、コネチカット州、ブランフォードのRoche 454 Life
Sciences(商標)により提供されるシーケンシング技術および分析装置;カリフォルニア州、サンディエゴのIllumina,Incにより提供されるシーケンシング技術および分析装置(そのSolexaシーケンシング技術は、本明細書では「Solexa法」もしくは「Solexa技術」と呼ばれることもある);または本明細書ではABI−SOLiD(商標)プラットフォームもしくは方法と呼ばれることもある、インディアナ州、インディアナポリスのABI,Applied Biosystemsにより提供されるシーケンシング技術および分析装置が挙げられる。
ングプロセス中に読まれるヌクレオチドの回数を指す。ディープシーケンシングは、プロセスの範囲、または深度が、試験下の配列の長さよりも何倍も長いことを示す。
DNAをバイサルファイト変換し、バイサルファイト特異的プライマーを、配列中の目的のCpGの直前の塩基対のところまで配列にアニーリングさせる。DNAポリメラーゼ停止ジデオキシヌクレオチドを用いてプライマーを一塩基対だけC(またはT)側に伸長させ、CとTの比を定量的に決定する。プライマー伸長のリポーターとしての放射性ddNTPの使用などの、いくつかの方法を用いて、このC:T比を決定することができ、蛍光に基づく方法またはピロシーケンシングを用いることもできる。マトリックス支援レーザー脱離イオン化/飛行時間(MALDI−TOF)質量分析を用いて、2つの多型プライマー伸長産物間を区別することができ、本質的には、SNPジェノタイピングのために設計されたGOODアッセイに基づいて用いることができる。イオン対逆相高速液体クロマトグラフィー(IP−RP−HPLC)を用いて、プライマー伸長産物を識別することもできる。
、CからUへの変換による開裂部位の導入/除去または増幅されたリバース鎖におけるGからAへの変換による断片質量の変更をもたらす。C特異的開裂は、全てのメチル化CpG部位で特異的に生じる。得られる断片のサイズを分析することによって、領域内のCpG部位のDNAメチル化の特異的パターンを決定することができる。
1Mリン酸ナトリウム(pH6.8)、1mM EDTA(pH7.6)、0.5%SDSの最終洗浄溶液、6xSSCの最終洗浄溶液、および22℃での最終洗浄(ストリンジェントから中程度のハイブリダイゼーション条件);ならびに(iii)6xSSCおよび1%SDSまたは3M TMACl、0.01Mリン酸ナトリウム(pH6.8)、1mM EDTA(pH7.6)、0.5%SDS、100μg/ml変性サケ精子DNAおよび0.1%無脂肪乾燥ミルクのハイブリダイゼーション溶液、Tmより2.5〜3℃低いハイブリダイゼーション温度および22℃での6xSSCの最終洗浄溶液(中程度のハイブリダイゼーション溶液)。
し、その強度が分析される試料中の増幅産物の量と関連する(例えば、比例する)ように選択される。
System)(非特許文献52)、核酸中に挿入し、UV照射時にヌクレオチド塩基に共有結合されるようになる、プソラレン−ビオチン(非特許文献53および非特許文献54)、光反応性アジド誘導体(非特許文献55)、およびDNAアルキル化剤(非特許文献56)が挙げられる。
ン6G、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミンまたはTMR)、クマリンおよびクマリン染料(例えば、メトキシクマリン、ジアルキルアミノクマリン、ヒドロキシクマリンおよびアミノメチルクマリンまたはAMCA)、オレゴングリーン染料(例えば、オレゴングリーン488、オレゴングリーン500、オレゴングリーン514)、テキサスレッド、テキサスレッド−X、Spectrum Red(商標)、Spectrum Green(商標)、シアニン染料(例えば、Cy−3(商標)、Cy−5(商標)、Cy−3.5(商標)、Cy−5.5(商標))、Alexa Fluor染料(例えば、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660およびAlexa Fluor 680)、BODIPY染料(例えば、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665)、IR染料(例えば、IRD40、IRD700、IRD800)などが挙げられる。好適な蛍光染料および核酸分子に蛍光染料を連結する、または組み込むための方法のさらなる例については、例えば、非特許文献57を参照されたい。蛍光染料ならびに標識化キットは、例えば、Amersham Biosciences,Inc.(ニュージャージー州、ピスカタウエイ)、Molecular Probes Inc.(オレゴン州、ユージーン)およびNew England Biolabs Inc.(マサチューセッツ州、ビバリー)から市販品が入手可能である。配列のメチル化状態を分析するための別の企図される方法は、メチル化感受性制限酵素への曝露後のDNAの分析である。例えば、内容が本明細書に組み込まれる、特許文献16および特許文献17を参照されたい。
ジメの効率をモニタリングするために用いることもできる。
本明細書に記載の成分はいずれも、キット中に含まれていてもよい。非限定例においては、キットは、上記のように、メチル化状態が疾患を示すDNA配列を増幅することができる少なくとも1種のプライマー対を含む。一実施形態によれば、プライマーは、上述したようなバーコード配列および/または下流のシーケンシングを可能にする配列をさらに含む。そのようなプライマー配列としては、例えば、配列番号1485〜1496に記載のものが挙げられる。一実施形態によれば、プライマー対のそれぞれのプライマーは、好適な容器に含まれる。別の実施形態によれば、キットは、2種のプライマー対を含み、当該プライマー対は、上記のように、メチル化状態が疾患の指標となる2つの異なるDNA配列を増幅することができる。別の実施形態によれば、キットは、3種のプライマー対を含み、当該プライマー対は、上記のように、メチル化状態が疾患の指標となる3つの異なるDNA配列を増幅することができる。別の実施形態によれば、キットは、4種のプライマー対を含み、当該プライマー対は、上記のように、メチル化状態が疾患の指標となる4つの異なるDNA配列を増幅することができる。別の実施形態によれば、キットは、5種以上のプライマー対を含み、当該プライマー対は、上記のように、メチル化状態が疾患の指標となる5つ以上の異なるDNA配列を増幅することができる。
ットは、健康な対象に由来の増幅配列と同じ配列を有するDNA(陰性対照となるもの)、および/または調査される疾患を有することがわかっている対象に由来の増幅配列と同じ配列を有するDNA(陽性対照となるもの)を含んでもよい。
not limited to)」を意味する。
3〜6などのサブ範囲、ならびにその範囲内の個々の数値、例えば、1、2、3、4、5、および6を具体的に開示したものと考えるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
患者:全ての臨床試験は、関連する地方倫理委員会によって認可されたものであり、血
液採取の前に全ての対象またはその法定後見人からインフォームドコンセントを得ている。
CO2約4.5kPaおよび正常なpHの中に。血中グルコースは、NICUのルーチンにしたがって、4〜6mmol/Lに保持した。患者はステロイドを受けていなかった。
プライマー配列:配列番号1485および1486
MBP3
プライマー配列:配列番号1495および1496
CG10809560(WM1)
プライマー配列:配列番号1491および1492
CG09787504
プライマー配列:配列番号1493および1494
膵臓(CUX2)
プライマー配列:配列番号1487および1488
膵臓(REG1A)
プライマー配列:配列番号1489および1490
組織特異的メチル化マーカーの同定
本発明者らは、個々の組織または細胞型と、他の組織とを識別する、組織特異的DNAメチル化マーカーを同定した。cfDNAの主要な寄与因子であり、それゆえ、システムにおける主要な潜在的なノイズ源であると考えられる、目的の組織と造血細胞とを区別するマーカーに特に着目した。本発明者らは、公共的に利用可能なメチローム(多くはThe Cancer Genome Atlas[TCGA]およびGene Expre
ssion Omnibus[GEO]に含まれるIllumina 450kアレイデータ)を分析して、示差的なメチル化パターンを有する個々のCpGジヌクレオチド、即ち、ある組織では特異的に非メチル化され、他の場所ではメチル化されているものを同定した(手順の略図、図5A〜Bを参照されたい)。
T1D患者の循環中の非メチル化インスリン遺伝子プロモーターの存在
ベータ細胞に由来するcfDNAを検出するために、ベータ細胞特異的メチル化マーカーとして、インスリン遺伝子プロモーターを用いた。末梢血試料中のベータ細胞に由来するDNAの同定を目的とした以前の研究は、インスリンプロモーター中の2〜3箇所のCpGジヌクレオチドのメチル化状態に基づくメチル化特異的PCRを用いた(非特許文献79)。しかしながら、インスリンプロモーターは、ごく近傍にさらなるCpG部位を含有し、これを用いてベータ細胞と他の組織のDNA間の区別を改善することができる(図1A)。この概念を試験するために、インスリン遺伝子プロモーターの160bp断片を、複数の組織から得られたバイサルファイト処理されたDNAから増幅し、産物をシーケンシングして、それぞれの組織中のそれぞれのCpGのメチル化状態を決定した。図1Bに示されるように、それぞれのCpGは、ヒトベータ細胞に由来するDNA分子の90〜95%および他の組織に由来するDNA分子の5〜15%において非メチル化されていた。しかしながら、この情報を組み合わせ、6箇所全てのCpG部位が非メチル化されたDNA分子の画分を算出した場合、ベータ細胞と全ての他の組織との差異は、劇的に大きくなった:完全に非メチル化されたベータ細胞に由来するDNA分子は約80%であったが、完全に非メチル化された任意の他の組織に由来する分子は0.01%未満であった。かくして、インスリン遺伝子プロモーター中の6箇所の隣接する非メチル化CpG部位を含む伸長鎖(配列番号1241に含まれる)は、10,000:1に近いシグナル対ノイズ比で他の組織に由来するベータ細胞と他の組織とを強固に区別する。
。患者に由来する血漿DNAをバイサルファイトで処理し、PCRで増幅し、シーケンシングして、完全に非メチル化されたインスリンプロモーターDNAを含有する分子画分を決定した。得られた画分に、各試料中で測定されたcfDNAの濃度を掛けて、各患者の血液中に循環するベータ細胞由来DNAの値(ng/ml)を得た(図5A〜B)。健康なボランティア(n=25)のcfDNAについては、完全に非メチル化されたインスリン遺伝子プロモーター分子の頻度は極端に低くかった(最大で循環するインスリンプロモーター断片の0.12%)。それぞれの個体におけるcfDNAの総量を掛けた場合、ベータ細胞に由来する循環DNAは0.06ng/ml未満であり(10個のゲノムに相当する)、健康な成人におけるベータ細胞の代謝回転の非常に低い速度と一致することがわかった(図1C)。診断の2〜16週後に採取されたT1D患者(n=11)に由来する血漿は、cfDNA中の非メチル化されたインスリンプロモーターDNAの明確なシグナル(血漿1mlあたり1.06〜8.6ngのベータ細胞DNA)を示し、これはベータ細胞の進行中の自己免疫性破壊の指標となる(図1C)。
多発性硬化症におけるオリゴデンドロサイト由来cfDNAの同定
脳細胞死の非侵襲的検出は、特に困難である。理論的には、脳特異的メチル化パターンを用いて、脳由来cfDNAを同定することができる。本発明者らは、多発性硬化症(MS)および視神経脊髄炎(NMO)といった、白質中のミエリン産生オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトが破壊される自己免疫疾患を発症した患者の血液中に循環するオリゴデンドロサイト/グリアDNAの証拠を探した。正常なヒト白質の公開されたメチロームを分析し、隣接するCpG部位のクラスターを、ミエリン塩基性タンパク質(本明細書ではMBP3と呼ばれる)の3’UTRにおいて、およびオリゴデンドロサイト中で選択的に非メチル化された、遺伝子座の決定していない部位(IlluminaアレイにおいてはCG10809560、白質1についてはWM1と呼ばれる)の周囲で同定した(
図2A)。インスリン遺伝子プロモーターに関しては、これらのクラスター中の個々のCpGは、中程度のシグナル対ノイズ比を示した:それらは、オリゴデンドロサイトに富む起源(グリア調製物、白質および全脳)に由来するDNA分子の60〜85%、他の組織に由来するDNAの2〜35%において非メチル化されていた(図7A〜Eおよび図8A〜E)。MBP3およびWM1遺伝子座での全てのCpGの組合せは、オリゴデンドロサイトに富むDNAと、血液を含む他の起源に由来するDNAとの識別を大きく増大させた(図7A〜Eおよび図8A〜E)。かくして、全ての隣接するCpG部位で非メチル化されたMBP3(配列番号1248中に含まれる)またはWM1(配列番号1247中に含まれる)遺伝子座に由来するDNAは、オリゴデンドロサイトの排他的マーカーとして役立ち得る。
急性脳損傷後の脳由来cfDNAの同定
脳傷害のためのより一般的なマーカーを得るために、そのメチル化状態が脳DNAを他の組織と識別する遺伝子座についてIlluminaアレイをスキャンした。CG09787504遺伝子座(本明細書ではBrain1と呼ばれる;配列番号1251中に含まれる)の周囲の9箇所のCpGを含むクラスターは、(ニューロンまたはグリアに富む)脳組織の様々な起源に由来するDNAの70%において、および他の組織(これらの組織中に存在する末梢ニューロンのDNAを反映する可能性が高い)に由来するDNA分子の5%未満において完全に非メチル化されていた。重要なことは、非メチル化された血液中の分子は0.03%未満であり、脳と血液の間のこの遺伝子座のメチル化における差は2000倍を超えていた(図3Aおよび図9A〜E)。
一致する。脳由来cfDNAの量および時間的パターンは、患者間で変化した。心停止した群においては、蘇生直後の最初の時点で最も強いシグナルが観察され、多くの患者においてはその後の数日間で低下した。TBIを発症した患者の群においては、より遅延したパターンの脳由来cfDNAが観察された。これらの知見は、脳特異的DNAならびにオリゴデンドロサイト特異的DNAを、独特のメチル化マーカーに基づいて、神経炎症、外傷性および虚血性脳病理を発症した患者の循環中で同定することができることを示している。
膵臓がんおよび膵炎における膵臓外分泌腺由来cfDNAの同定
本発明者らは、前記手法を用いてがんについてもcfDNAを検出することができるかどうかを試験した。腫瘍は、正常組織と比較してメチロームにおける広範な変化を呈するが、多くの組織特異的メチル化部位は、腫瘍中でも無傷のままであると考えられる。かくして、腫瘍における細胞死は、腫瘍の組織起源の正常なメチル化パターンを有するcfDNAを生じさせるはずである。膵管腺がんは、膵臓外分泌腺中の腺房細胞または膵管細胞のいずれかを起源とすると考えられる。ヒト死体材料に由来するFACS精製された膵管細胞および腺房細胞に対する抗体を使用し、そのメチロームをIllumina 450kアレイを用いて取得した(未公開の結果)。これらのデータの分析は、複数のCpGが、膵臓外分泌腺中では非メチル化され、他の多くの組織中ではメチル化されていることを示していた。さらなる分析のために2つの部位を選択し、腺房細胞および膵管細胞を他の細胞型と区別することができる、膵臓外分泌腺のためのマーカーとして用いることができる隣接するCpGのクラスターを同定した(図4A、図10A〜Eおよび図11A〜E)。健康な対象(n=25)は、そのcfDNA中に非常に低レベルの非メチル化膵臓外分泌腺マーカーを有し、この組織の低い代謝回転と一致していた(図4B)。膵臓がんを発症した患者のほぼ半分(42人のうち20人)が、バックグラウンドレベルより高い膵臓外分泌腺由来cfDNAを示した(図4C)。進行した疾患を発症した患者においてシグナルが強くなる傾向があり、これらの患者はバックグラウンドより高いシグナルを示す可能性がより高かった。それにもかかわらず、ステージ1および2(限局性疾患)の患者の何人かは、明確なシグナルを有していたが(29人のうちの11人)、この方法は、原理的には、切除可能なステージにある膵臓がんにおける細胞死を同定することができることを示唆している。
ALSを発症した患者の血漿中での脳由来DNAの同定
神経変性疾患である筋萎縮性側索硬化症(ALS)においては、運動ニューロンが死滅した後、筋肉細胞が死滅する。本発明者らは、脳由来DNA断片を、ALSを発症した患者の循環中で同定することができるかどうかを試験した。図12に示されるように、健康な個体(n=12)においてはシグナルがゼロ近くであるのと比べて、40%のALS患者(n=29)が、その血漿中で測定可能なレベルの脳由来DNAを示した(非メチル化
されたCG0978[Brain1]の画分に、その血漿中の無細胞DNAの総量を掛けた値に基づく)。さらに、本発明者らは、ALS患者の血漿中でグリアDNAの存在を探した。図13は、健康な個体におけるシグナルなしと比較して、試験したALS患者の70%(n=10)がその血漿中に少なくとも2つのグリアマーカー(WM1およびMBP3)を有していたことを示す。これらの知見は、ALS患者における白質への損傷に関する臨床報告と一致している。予備分析において、本発明者らはまた、ALS患者の血液中で筋肉DNAを同定した(データは示さない)。かくして、前記アッセイを用いて、疾患進行の診断、モニタリングおよび薬物活性の評価のために、ALSを発症した患者におけるニューロン、グリア細胞および筋肉細胞の死を検出およびモニタリングすることができる。
グリア芽細胞腫を発症した患者の血漿中でのグリアDNAの同定
グリア芽細胞腫は、グリア細胞を起源とする。本発明者らは、グリアDNA(WM1またはMBP3の非メチル化された断片)の存在についてグリア芽細胞腫を発症した患者の血漿を検査した。試験したグリア芽細胞腫患者の30%(n=10)が、健康な個体における最小レベルよりも高い明確なシグナルを有することがわかった。かくして、前記方法を用いて、グリア芽細胞腫における細胞死を同定およびモニタリングすることができる。
結腸がんまたはクローン病を発症した患者の血漿中での結腸上皮DNAの同定
本発明者らは、結腸DNAのいくつかのマーカーを同定した。これらマーカーは、いずれも他の組織中では非メチル化されているが、結腸中ではメチル化されている、CpGの非メチル化クラスターを有する。非メチル化された分子の組織分布を、図14A〜Dに示す。
肺がんを発症した患者の血漿中での肺DNAの同定
本発明者らは、肺上皮のDNA中では非メチル化され、他の組織中ではメチル化されている、肺細胞のいくつかのマーカーを同定および検証し、健康な個体の血漿中および肺がんを発症した患者の血漿中のそれらのレベルを試験した。
伝子である非メチル化SFTP/A1の組織分布を示す。非メチル化SFTP/A1は多くの健康な個体の血漿中には存在しないが、肺がんを有する多くの患者の血漿中には存在することがわかった。
運動後の血漿および筋ジストロフィーにおける骨格筋DNAの同定
本発明者らは、骨格筋中では非メチル化され、他の組織(心臓を含む)中ではメチル化されている骨格筋の3つのメチル化マーカーを同定および検証した。図20A〜Cは、これらのマーカー(TNN、TPOおよびMAD1)の組織分布を示す。
循環中の血管内皮由来DNAの同定
内皮細胞のメチル化マーカーを同定するために、本発明者らは、臍帯から選別されたヒト内皮細胞のメチロームを決定した。図22は、内皮細胞(臍帯に由来する)中では非メチル化されているが、試験される全ての特定の細胞型(リンパ球、および膵臓腺房細胞、アルファ細胞および膵管細胞)中では完全にメチル化されている、内皮細胞の1つのマーカーを示す。組織生検に由来するDNAの約10%が、このマーカーのメチル化の欠如を示し、これは全ての組織における内皮細胞の存在を反映していた。多くの健康な個体は、その血清中にシグナルを有さないが、これは、内皮細胞の低いベースライン代謝回転を示唆している。月経周期中の女性の血液は、大規模な血管虚脱のため予想されるように高いシグナルを示した。妊娠女性はシグナルを有し、それは子癇前症を有する女性において、より強かった。試験した全てのがん患者は明確なシグナルを示した。
などの病理における抗血管形成薬の活性を評価するための、様々な設定における内皮細胞死の同定を可能にすることを示唆する。
循環中の肝臓由来DNAの同定
本発明者らは、肝細胞マーカーを同定および検証した。図23は、アルブミン(ALB)のプロモーターが、肝細胞(ならびにある程度は腎臓および膵臓)中で非メチル化されているが、他の場所ではメチル化されていることを示す。健康な個体の血液は、シグナルを含有しないか、または比較的高レベルの非メチル化されたアルブミンプロモーターDNAを含有していたが、これは、肝細胞のベースライン代謝回転またはクリアランスの変動を示唆している。試験した全ての肝炎患者(n=7)は陽性であったが、これは、前記方法が病理学的肝細胞死を検出することができることを示唆している。
非リンパ球に由来する無細胞循環DNAの同定
図24A〜Bは、リンパ球中では非メチル化され、他の場所ではメチル化されていると同定されたマーカーを示す。多くの健康な個体の血液中で、多くの分子は非メチル化され、ベースライン条件下で多くの無細胞循環DNAが死滅しつつある血液細胞に由来するという事実を反映する。しかしながら、集中運動の直後の健康な個体またはがんを発症した患者の血清中では、高レベルのメチル化されたこれらのマーカーが存在し、非リンパ球に由来する無細胞循環DNA(見かけ上、運動後の筋肉DNAおよびがん患者における腫瘍DNA)の指標となる。これらのマーカーは、個体における正常からの逸脱:血液以外の組織における細胞死の証拠を、大まかに評価するために使用することができる。
循環中の腎臓由来DNAの同定
図25は、AQP(アクアポリン遺伝子の1つに由来する配列)が腎臓細胞中では非メチル化され、血液中ではメチル化されていることを示す。健康な個体は、血液中に非メチル化されたAQPを有さない(おそらく、血液よりもむしろ尿への、腎臓中の死滅しつつある細胞の正常な脱落を反映する)。子癇前症を有する妊娠女性(腎臓損傷を有することが知られる)は、強いシグナルを示した。これらの知見は、この方法を用いて、様々な病状における腎臓細胞死(例えば、敗血症を有するいくらかの患者における急性尿細管壊死)を検出することができることを示す。
循環中の脂肪細胞DNAの同定
脂肪細胞の総数は、成人期には一定のままであることが、新しい脂肪細胞がかなり形成されるという証拠と共に示されている。かくして、脂肪細胞形成の速度と等しい速度で脂肪細胞死がなければならないと予測される。
業者に明らかとなることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨及び広い範囲内に含まれるそれらの代替、改変及び変種の全てを包含することが意図される。
配列番号1486: 1本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号1487: 1本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号1488: 1本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号1489: 1本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号1490: 1本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号1491: 1本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号1492: 1本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号1493: 1本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号1494: 1本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号1495: 1本鎖DNAオリゴヌクレオチド
配列番号1496: 1本鎖DNAオリゴヌクレオチド
Claims (11)
- 対象における細胞型または組織の死を検出するための方法であって、対象の血液試料中に含まれる無細胞DNAが細胞型由来または組織由来であるか否かの決定を含み、前記決定は、下記工程(a)〜(d)を含む方法によって実施する、方法。
(a)前記血液試料中の前記無細胞DNAを亜硫酸水素塩と接触させて、DNA中の脱メチル化シトシンをウラシルに変換し、
(b)前記血液試料中に含まれる、前記亜硫酸水素塩によって変換された前記無細胞DNAを増幅して、DNAの増幅分子を得、得られた前記増幅分子のそれぞれが300ヌクレオチドの配列当たり少なくとも4箇所のメチル化部位を有し、前記少なくとも4箇所のメチル化部位の特異的メチル化パターンが、前記細胞型または組織の特徴となり、
(c)前記少なくとも4箇所のメチル化部位を含む前記特異的メチル化パターンを有する前記増殖分子の数を確認するために、前記DNAの増幅分子のディープシーケンシングを行い、
(d)前記数に基づき、前記細胞型または組織の死の程度を決定する。 - 前記特異的メチル化パターンは、非疾患性の細胞型または組織の特徴である、請求項1に記載の方法。
- 前記配列は50〜250ヌクレオチドを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記少なくとも4箇所のメチル化部位は、少なくとも5箇所のメチル化部位を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血液試料は、血漿試料である、請求項1に記載の方法。
- 前記血液試料は、前記細胞型または組織と非同一である第2細胞に由来の無細胞DNAを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞型由来または組織由来の無細胞DNA量と、前記第2細胞由来の無細胞DNA量との比の分析をさらに含む、請求項6に記載の方法。
- 前記細胞型由来または組織由来の無細胞DNA量と、前記血液試料中の無細胞DNAの総量との比の分析をさらに含む、請求項6に記載の方法。
- 前記細胞型は、膵臓ベータ細胞、膵臓外分泌細胞、肝細胞、脳細胞、肺細胞、子宮細胞、腎臓細胞、乳房細胞、脂肪細胞、結腸細胞、直腸細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、前立腺細胞および甲状腺細胞からなる群より選択されるものである、請求項1に記載の方法。
- 前記組織は、膵臓組織、肝臓組織、肺組織、脳組織、子宮組織、腎臓組織、乳房組織、脂肪、結腸組織、直腸組織、心臓組織、骨格筋組織、前立腺組織および甲状腺組織からなる群より選択されるものである、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞型由来または組織由来の無細胞DNAの定量をさらに含む、請求項1に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201461979233P | 2014-04-14 | 2014-04-14 | |
US61/979,233 | 2014-04-14 | ||
PCT/IL2015/050403 WO2015159292A2 (en) | 2014-04-14 | 2015-04-14 | A method and kit for determining the tissue or cell origin of dna |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017511142A JP2017511142A (ja) | 2017-04-20 |
JP6750879B2 true JP6750879B2 (ja) | 2020-09-02 |
Family
ID=53051869
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016562026A Active JP6750879B2 (ja) | 2014-04-14 | 2015-04-14 | Dnaの組織または細胞起源を決定するための方法およびキット |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US11203784B2 (ja) |
EP (4) | EP4026917B1 (ja) |
JP (1) | JP6750879B2 (ja) |
CN (1) | CN106574296B (ja) |
DK (2) | DK3643795T3 (ja) |
FI (1) | FI4026917T3 (ja) |
HR (1) | HRP20240189T1 (ja) |
IL (1) | IL248299B (ja) |
LT (1) | LT4026917T (ja) |
PL (1) | PL4026917T3 (ja) |
PT (1) | PT4026917T (ja) |
WO (2) | WO2015159292A2 (ja) |
Families Citing this family (45)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL305303A (en) | 2012-09-04 | 2023-10-01 | Guardant Health Inc | Systems and methods for detecting rare mutations and changes in number of copies |
US11913065B2 (en) | 2012-09-04 | 2024-02-27 | Guardent Health, Inc. | Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation |
US10876152B2 (en) | 2012-09-04 | 2020-12-29 | Guardant Health, Inc. | Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation |
US20160040229A1 (en) | 2013-08-16 | 2016-02-11 | Guardant Health, Inc. | Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation |
JP6571665B2 (ja) | 2013-12-28 | 2019-09-04 | ガーダント ヘルス, インコーポレイテッド | 遺伝的バリアントを検出するための方法およびシステム |
FI4026917T3 (fi) | 2014-04-14 | 2024-02-14 | Yissum Research And Development Company Of The Hebrew Univ Of Jerusalem Ltd | Menetelmä ja välineistö solujen tai kudoksen kuoleman tai DNA:n kudos- tai solualkuperäin määrittämiseksi DNA-metylaatioanalyysin avulla |
CN106795562B (zh) | 2014-07-18 | 2022-03-25 | 香港中文大学 | Dna混合物中的组织甲基化模式分析 |
WO2017012544A1 (en) | 2015-07-20 | 2017-01-26 | The Chinese University Of Hong Kong | Methylation pattern analysis of haplotypes in tissues in dna mixture |
CN108603228B (zh) | 2015-12-17 | 2023-09-01 | 夸登特健康公司 | 通过分析无细胞dna确定肿瘤基因拷贝数的方法 |
US11384382B2 (en) | 2016-04-14 | 2022-07-12 | Guardant Health, Inc. | Methods of attaching adapters to sample nucleic acids |
WO2017181146A1 (en) | 2016-04-14 | 2017-10-19 | Guardant Health, Inc. | Methods for early detection of cancer |
WO2017201606A1 (en) * | 2016-05-04 | 2017-11-30 | Queen's University At Kingston | Cell-free detection of methylated tumour dna |
CN115161390A (zh) | 2016-05-30 | 2022-10-11 | 香港中文大学 | 使用血液中的无细胞dna检测血液病症 |
US11499196B2 (en) | 2016-06-07 | 2022-11-15 | The Regents Of The University Of California | Cell-free DNA methylation patterns for disease and condition analysis |
CA3033650A1 (en) * | 2016-08-17 | 2018-02-22 | The Regents Of The University Of California | A novel immunoprobe-based method to assess organ injury status through a biofluid-based cell-free dna (cfdna) assay |
US11959125B2 (en) * | 2016-09-15 | 2024-04-16 | Sun Genomics, Inc. | Universal method for extracting nucleic acid molecules from a diverse population of one or more types of microbes in a sample |
WO2018081130A1 (en) | 2016-10-24 | 2018-05-03 | The Chinese University Of Hong Kong | Methods and systems for tumor detection |
KR20230062684A (ko) | 2016-11-30 | 2023-05-09 | 더 차이니즈 유니버시티 오브 홍콩 | 소변 및 기타 샘플에서의 무세포 dna의 분석 |
IL302912A (en) | 2016-12-22 | 2023-07-01 | Guardant Health Inc | Methods and systems for analyzing nucleic acid molecules |
TW202348802A (zh) | 2017-01-25 | 2023-12-16 | 香港中文大學 | 使用核酸片段之診斷應用 |
US11781188B2 (en) | 2017-04-06 | 2023-10-10 | Cornell University | Methods of detecting cell-free DNA in biological samples |
CN111032868A (zh) * | 2017-06-30 | 2020-04-17 | 加利福尼亚大学董事会 | 用于评估无细胞dna中的dna甲基化的方法和系统 |
EP3652342A1 (en) | 2017-07-13 | 2020-05-20 | Yissum Research and Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. | Detecting tissue-specific dna |
US11466323B2 (en) | 2017-07-13 | 2022-10-11 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Dual-probe digital droplet PCR strategy for specific detection of tissue-specific circulating DNA molecules |
US20200340057A1 (en) | 2017-07-13 | 2020-10-29 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Dna targets as tissue-specific methylation markers |
DE102017126248B4 (de) | 2017-11-09 | 2019-10-17 | Epiontis Gmbh | ERGIC1 als epigenetischer Marker zur Identifizierung von Immunzellen, insbesonderemonozytischem myeloid-abgeleiteten Suppressor-Zellen (mMDSCs) |
WO2019159184A1 (en) * | 2018-02-18 | 2019-08-22 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Cell free dna deconvolution and use thereof |
EP3766076A4 (en) * | 2018-03-15 | 2021-12-29 | Grail, Inc. | Tissue-specific methylation marker |
JP2021112127A (ja) * | 2018-04-26 | 2021-08-05 | 暁生 黒田 | 膵β細胞の傷害検査方法 |
EP3801623A4 (en) | 2018-06-01 | 2022-03-23 | Grail, LLC | NEURAL CONVOLUTIONAL NETWORK SYSTEMS AND DATA CLASSIFICATION METHODS |
CA3111887A1 (en) | 2018-09-27 | 2020-04-02 | Grail, Inc. | Methylation markers and targeted methylation probe panel |
US11581062B2 (en) | 2018-12-10 | 2023-02-14 | Grail, Llc | Systems and methods for classifying patients with respect to multiple cancer classes |
AU2019401636A1 (en) * | 2018-12-18 | 2021-06-17 | Grail, Llc | Systems and methods for estimating cell source fractions using methylation information |
WO2020155149A1 (en) * | 2019-02-02 | 2020-08-06 | Lenovo (Beijing) Limited | Enhanced scheduling of time sensitive networking |
IL265451B (en) | 2019-03-18 | 2020-01-30 | Frumkin Dan | Methods and systems for the detection of methylation changes in DNA samples |
WO2020202162A1 (en) * | 2019-04-03 | 2020-10-08 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Primers for multiplex pcr |
US11773450B2 (en) | 2019-04-03 | 2023-10-03 | Grail, Llc | Methylation-based false positive duplicate marking reduction |
US11396679B2 (en) | 2019-05-31 | 2022-07-26 | Universal Diagnostics, S.L. | Detection of colorectal cancer |
US11001898B2 (en) | 2019-05-31 | 2021-05-11 | Universal Diagnostics, S.L. | Detection of colorectal cancer |
WO2021067484A1 (en) | 2019-09-30 | 2021-04-08 | Guardant Health, Inc. | Compositions and methods for analyzing cell-free dna in methylation partitioning assays |
US11898199B2 (en) | 2019-11-11 | 2024-02-13 | Universal Diagnostics, S.A. | Detection of colorectal cancer and/or advanced adenomas |
WO2022002424A1 (en) | 2020-06-30 | 2022-01-06 | Universal Diagnostics, S.L. | Systems and methods for detection of multiple cancer types |
US20230212674A1 (en) * | 2021-12-30 | 2023-07-06 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Compositions and methods for identifying cell types |
WO2023178109A2 (en) * | 2022-03-15 | 2023-09-21 | Resonant Llc | Neuronal methylation signatures from cell free dna as a pre-symptomatic neurodegenerative condition surveillance diagnostic |
WO2024038457A1 (en) | 2022-08-18 | 2024-02-22 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | A method for determining the tissue or cell of origin of dna |
Family Cites Families (52)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL154600B (nl) | 1971-02-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen. |
NL154598B (nl) | 1970-11-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking. |
NL154599B (nl) | 1970-12-28 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking. |
US3901654A (en) | 1971-06-21 | 1975-08-26 | Biological Developments | Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors |
US3853987A (en) | 1971-09-01 | 1974-12-10 | W Dreyer | Immunological reagent and radioimmuno assay |
US3867517A (en) | 1971-12-21 | 1975-02-18 | Abbott Lab | Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies |
NL171930C (nl) | 1972-05-11 | 1983-06-01 | Akzo Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen. |
US3850578A (en) | 1973-03-12 | 1974-11-26 | H Mcconnell | Process for assaying for biologically active molecules |
US3935074A (en) | 1973-12-17 | 1976-01-27 | Syva Company | Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies |
US3996345A (en) | 1974-08-12 | 1976-12-07 | Syva Company | Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays |
US4034074A (en) | 1974-09-19 | 1977-07-05 | The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG) |
US3984533A (en) | 1975-11-13 | 1976-10-05 | General Electric Company | Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction |
US4098876A (en) | 1976-10-26 | 1978-07-04 | Corning Glass Works | Reverse sandwich immunoassay |
US4458066A (en) | 1980-02-29 | 1984-07-03 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
US4879219A (en) | 1980-09-19 | 1989-11-07 | General Hospital Corporation | Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies |
US5011771A (en) | 1984-04-12 | 1991-04-30 | The General Hospital Corporation | Multiepitopic immunometric assay |
US4666828A (en) | 1984-08-15 | 1987-05-19 | The General Hospital Corporation | Test for Huntington's disease |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US4801531A (en) | 1985-04-17 | 1989-01-31 | Biotechnology Research Partners, Ltd. | Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis |
US4800159A (en) | 1986-02-07 | 1989-01-24 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
US5322770A (en) | 1989-12-22 | 1994-06-21 | Hoffman-Laroche Inc. | Reverse transcription with thermostable DNA polymerases - high temperature reverse transcription |
US5272057A (en) | 1988-10-14 | 1993-12-21 | Georgetown University | Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase |
US5192659A (en) | 1989-08-25 | 1993-03-09 | Genetype Ag | Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes |
KR100236506B1 (ko) | 1990-11-29 | 2000-01-15 | 퍼킨-엘머시터스인스트루먼츠 | 폴리머라제 연쇄 반응 수행 장치 |
AU645915B2 (en) | 1991-07-23 | 1994-01-27 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Improvements in the in situ PCR |
US5281521A (en) | 1992-07-20 | 1994-01-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Modified avidin-biotin technique |
US5612473A (en) | 1996-01-16 | 1997-03-18 | Gull Laboratories | Methods, kits and solutions for preparing sample material for nucleic acid amplification |
GB9620209D0 (en) | 1996-09-27 | 1996-11-13 | Cemu Bioteknik Ab | Method of sequencing DNA |
GB9626815D0 (en) | 1996-12-23 | 1997-02-12 | Cemu Bioteknik Ab | Method of sequencing DNA |
JP2001519525A (ja) | 1997-10-07 | 2001-10-23 | メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド | Fretを用いる核内受容体リガンドに関するアッセイ |
US6274320B1 (en) | 1999-09-16 | 2001-08-14 | Curagen Corporation | Method of sequencing a nucleic acid |
WO2003044226A2 (en) * | 2001-11-23 | 2003-05-30 | Epigenomics Ag | Method and nucleic acids for the analysis of a lymphoid cell proliferative disorder |
EP1342794B1 (en) | 2002-03-05 | 2005-12-14 | Epigenomics AG | Method and device for determination of tissue specificity of free floating DNA in bodily fluids |
US7709194B2 (en) * | 2004-06-04 | 2010-05-04 | The Chinese University Of Hong Kong | Marker for prenatal diagnosis and monitoring |
SI3101141T1 (sl) | 2007-06-08 | 2020-03-31 | Epigenomics Ag | Postopek za metilacijsko analizo |
EP2450869B1 (en) | 2009-07-01 | 2018-11-28 | Sharp Kabushiki Kaisha | Active matrix substrate and organic el display device |
WO2011101728A2 (en) | 2010-02-19 | 2011-08-25 | Nucleix | Identification of source of dna samples |
US9366632B2 (en) | 2010-02-12 | 2016-06-14 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
EP2561097A2 (en) | 2010-04-20 | 2013-02-27 | Nucleix | Methylation profiling of dna samples |
US20140112895A1 (en) | 2010-10-08 | 2014-04-24 | Universiti Putra Malaysia | Glp-1 promoter mediated insulin expression for the treatment of diabetes |
EP2723901B1 (en) * | 2011-06-22 | 2018-08-08 | Yale University | Compositions and methods of diagnosing diseases and disorders associated with cell death |
WO2013131083A1 (en) | 2012-03-02 | 2013-09-06 | Winthrop-University Hospital | METHOD FOR USING PROBE BASED PCR DETECTION TO MEASURE THE LEVELS OF CIRCULATING DEMETHYLATED β CELL DERIVED DNA AS A MEASURE OF β CELL LOSS IN DIABETES |
CN104486990B (zh) | 2012-07-20 | 2017-07-04 | 株式会社村田制作所 | 生物传感器 |
WO2014138133A1 (en) | 2013-03-04 | 2014-09-12 | Islet Sciences, Inc. | Compositions and methods for detecting hypo-methylated dna in body fluids |
CA2901293A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Abbott Molecular Inc. | Detection of bisulfite converted nucleotide sequences |
FI4026917T3 (fi) | 2014-04-14 | 2024-02-14 | Yissum Research And Development Company Of The Hebrew Univ Of Jerusalem Ltd | Menetelmä ja välineistö solujen tai kudoksen kuoleman tai DNA:n kudos- tai solualkuperäin määrittämiseksi DNA-metylaatioanalyysin avulla |
CN107223159A (zh) | 2014-05-09 | 2017-09-29 | 科戴克斯生命股份公司 | 源自特定细胞类型的dna的检测及相关方法 |
US10858706B2 (en) | 2015-07-10 | 2020-12-08 | Nyu Winthrop Hospital | System, method and kit for analysis of circulating differentially methylated DNA as a biomarker of beta-cell loss |
EP3652342A1 (en) | 2017-07-13 | 2020-05-20 | Yissum Research and Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. | Detecting tissue-specific dna |
US20200340057A1 (en) | 2017-07-13 | 2020-10-29 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Dna targets as tissue-specific methylation markers |
US11466323B2 (en) | 2017-07-13 | 2022-10-11 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Dual-probe digital droplet PCR strategy for specific detection of tissue-specific circulating DNA molecules |
-
2015
- 2015-04-14 FI FIEP22158931.0T patent/FI4026917T3/fi active
- 2015-04-14 US US15/303,762 patent/US11203784B2/en active Active
- 2015-04-14 PL PL22158931.0T patent/PL4026917T3/pl unknown
- 2015-04-14 EP EP22158931.0A patent/EP4026917B1/en active Active
- 2015-04-14 DK DK19209237.7T patent/DK3643795T3/da active
- 2015-04-14 LT LTEP22158931.0T patent/LT4026917T/lt unknown
- 2015-04-14 WO PCT/IL2015/050403 patent/WO2015159292A2/en active Application Filing
- 2015-04-14 JP JP2016562026A patent/JP6750879B2/ja active Active
- 2015-04-14 EP EP15720481.9A patent/EP3132055A2/en not_active Ceased
- 2015-04-14 EP EP23209884.8A patent/EP4306659A3/en active Pending
- 2015-04-14 EP EP19209237.7A patent/EP3643795B1/en active Active
- 2015-04-14 DK DK22158931.0T patent/DK4026917T3/da active
- 2015-04-14 CN CN201580031764.XA patent/CN106574296B/zh active Active
- 2015-04-14 HR HRP20240189TT patent/HRP20240189T1/hr unknown
- 2015-04-14 PT PT221589310T patent/PT4026917T/pt unknown
- 2015-04-14 WO PCT/IL2015/050404 patent/WO2015159293A2/en active Application Filing
-
2016
- 2016-10-10 IL IL248299A patent/IL248299B/en active IP Right Grant
-
2021
- 2021-11-17 US US17/528,699 patent/US20220064730A1/en active Pending
-
2023
- 2023-02-15 US US18/169,821 patent/US20230242985A1/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2015159292A2 (en) | 2015-10-22 |
EP3643795A1 (en) | 2020-04-29 |
EP4306659A3 (en) | 2024-03-27 |
DK3643795T3 (da) | 2022-05-09 |
CN106574296A (zh) | 2017-04-19 |
EP4026917B1 (en) | 2023-11-15 |
FI4026917T3 (fi) | 2024-02-14 |
IL248299A0 (en) | 2016-11-30 |
US20230242985A1 (en) | 2023-08-03 |
US20170121767A1 (en) | 2017-05-04 |
EP4026917A1 (en) | 2022-07-13 |
HRP20240189T1 (hr) | 2024-04-26 |
CN106574296B (zh) | 2021-03-02 |
EP3643795B1 (en) | 2022-03-30 |
PL4026917T3 (pl) | 2024-04-08 |
DK4026917T3 (da) | 2024-02-12 |
US11203784B2 (en) | 2021-12-21 |
US20220064730A1 (en) | 2022-03-03 |
WO2015159292A3 (en) | 2015-12-10 |
LT4026917T (lt) | 2024-03-12 |
PT4026917T (pt) | 2024-02-12 |
WO2015159293A2 (en) | 2015-10-22 |
JP2017511142A (ja) | 2017-04-20 |
WO2015159293A3 (en) | 2015-12-10 |
EP3132055A2 (en) | 2017-02-22 |
EP4306659A2 (en) | 2024-01-17 |
IL248299B (en) | 2021-04-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6750879B2 (ja) | Dnaの組織または細胞起源を決定するための方法およびキット | |
JP5378687B2 (ja) | Basp1遺伝子および/またはsrd5a2遺伝子中のメチル化シトシンを利用する、肝臓癌、肝臓癌発症リスク、肝臓癌再発リスク、肝臓癌悪性度および肝臓癌の経時的進展の検出方法 | |
JP7485427B2 (ja) | 肺癌を診断するためのキットおよび方法 | |
US20200340057A1 (en) | Dna targets as tissue-specific methylation markers | |
US20230120076A1 (en) | Dual-probe digital droplet pcr strategy for specific detection of tissue-specific circulating dna molecules | |
US20200165671A1 (en) | Detecting tissue-specific dna | |
CN113355414A (zh) | 食管癌检测试剂盒及其应用 | |
JP2024010011A (ja) | 全血からの血漿分離の効率を判定する方法およびキット | |
WO2011043365A1 (ja) | 遺伝子型判定方法 | |
WO2024038457A1 (en) | A method for determining the tissue or cell of origin of dna | |
WO2023135600A1 (en) | Personalized cancer management and monitoring based on dna methylation changes in cell-free dna | |
IL280297A (en) | Non-invasive cancer detection is based on DNA methylation changes | |
CN116064820A (zh) | 用于检测早期肝癌的生物标记物、试剂盒及其使用方法 | |
TW202328459A (zh) | 一種腫瘤檢測方法及應用 | |
TW202146658A (zh) | 用以評估個體罹患胃癌或癌前病變之風險的方法、其套組、其分析器及其生物標誌 | |
CN118086498A (zh) | 用于诊断肺癌的方法 | |
JP2007110991A (ja) | 遺伝子多型を用いた長寿の判定方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RD01 | Notification of change of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426 Effective date: 20170201 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20170202 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180322 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190212 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20190319 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190805 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20200204 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20200407 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200702 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200714 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200807 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6750879 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |