CN109949862A - 一种血液ctDNA的微卫星不稳定性检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血液ctDNA的微卫星不稳定性的检测方法。本发明方法是包括对包含ctDNA的cfDNA进行探针捕获，根据获得的目标产物建立测序文库和上机测序；对下机数据进行拆分、质控、过滤和比对；然后通过perl程序对微卫星位点序列提取，并和正常的微卫星序列进行对比，检测微卫星位点的突变情况并记录其突变类型，最后根据统计各个微卫星位点的稳定性评估样本的整体的微卫星稳定性状态。本发明不仅能有效准确的检测出样本的微卫星不稳定性的状态，还能检测微卫星不稳定位点的突变情况。本发明方法相比传统PCR检测方法更快速和方便，成本更低，检测更全面。
Description
技术领域
本发明属于生物信息技术领域，具体涉及一种血液ctDNA的微卫星不稳定性检测方法。
背景技术
微卫星序列(Microsatellite，MS)或简单串联重复序列(Simple SequenceRepeat，SSR)广泛存在于原核及真核基因组中，是由10～50个1～6个核苷酸组成的重复单位串联组成的具有高度多态性的简单串联序列。微卫星不稳定性(Microsatelliteinstability，MSI)是由于复制错误导致微卫星区域出现碱基对的插入或缺失的表型。与正常组织的DNA相比，有微卫星不稳定性的DNA序列在电泳的时候出现等位带的移动、带的强度增加或获得额外的带型。微卫星不稳定性发生的主要原因很可能是由于配对错误修复基因功能异常而导致正常的蛋白质合成出错，产生了一种有缺陷的蛋白质。因为此蛋白质不能正常地发挥调控作用，从而导致细胞增殖和分化异常，促进了癌症的形成和发展。
至今为止，几乎所有的人类的肿瘤研究都有微卫星不稳定性的情况，虽然结果有一定的差异，但能明确的表明微卫星序列突变会促使正常细胞向恶性肿瘤细胞转化。所以现在微卫星不稳定性已经成为恶性肿瘤筛查的一个指标。因为微卫星不稳定性与大多数癌症早期发生有关，所以检测微卫星不稳定能有助于提高早期癌症的诊断率。甚至对于许多恶性肿瘤来说，微卫星不稳定性检测具有判断预后和指导治疗的作用。例如结直肠癌遗传学研究显示约15％的原发性结直肠癌和大部分的林奇综合症(Lynch syndrome)都是由微卫星不稳定所导致的，而且高度微卫星不稳定性是1期结直肠癌患者预测康复良好的一个标志物。2015年美国国立综合癌症网络(national comprehensive cancer network，NCCN)指南指出二期微卫星不稳定性的结直肠癌患者不应该接受5-FU为基础的化疗方案。同年美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology，ASCO)指出三期微卫星不稳定性的结直肠癌患者可以从5-FU为基础的化疗方案中获益。近期研究表明，高度微卫星不稳定性患者在接受PD-1和PD-L1抗体时有良好的预后，所以微卫星不稳定性可能是免疫检查点阻断疗法的一个标志物。
根据美国国立癌症研究院协作组推荐的微卫星不稳定性检测方法，首先对5个微卫星位点(BAT-26、BAT-25、NR-21、NR-24和NR-27)进行PCR扩增，然后根据PCR的结果来对微卫星不稳定性进行分类，结果可分为以下三类：微卫星稳定(MSS)：通过PCR检测的5个微卫星位点中没有一个微卫星位点显示不稳定；低频微卫星不稳定性(MSI-L)：通过PCR检测的5个微卫星位点中有1个标记位点显示不稳定或者通过PCR检测的多个微卫星位点中有10％到30％的标记位点为不稳定；高频微卫星不稳定(MSI-H)：通过PCR检测的5个微卫星位点中有2个或以上表示不稳定或通过PCR检测的多个微卫星位点中30％以上的位点表示不稳定。
目前对微卫星不稳定性检测方法大致分为两种：一种是聚合酶联系反应(poly-merase chain reaction，PCR)扩增为基础，对PCR扩增产物的长度进行检测微卫星序列突变情况；另一种是免疫组化的方法，即将目标基因序列导入细胞，通过测量蛋白活性间接检测微卫星序列突变情况。这两种方法都有其缺点，例如传统的PCR检测方法步骤繁琐，通量低，耗时长，结果不易判读，同时要求实验仪器精度较高；免疫组化法的可重复性较低，对样本质量较高，同时需要精确度很高的仪器，操作更是复杂。虽然现在有一些以二代测序为基础的微卫星不稳定性检查方法，但大多都是针对肿瘤样本，对一些不方便获取肿瘤切片的样本，不能很好的检测出样本的微卫星不稳定性。
循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)是肿瘤细胞在坏死、凋亡后释放到外周血的一种DNA小片段，其携带有与原发肿瘤组织一致的遗传信息。因此我们可以从ctDNA中获取原发肿瘤的微卫星不稳定性的信息，更有价值的是，无论是原发部位肿瘤还是转移部位肿瘤都会持续地向血液释放ctDNA，所以ctDNA中基因的突变更能体现患者整体的肿瘤微卫星突变情况。但是人类正常细胞死亡或凋亡后也会向血液释放一些游离的DNA(cell free DNA，cfDNA)，因为肿瘤患者体内的肿瘤细胞数量远远低于正常细胞，cfDNA原本在血浆中的含量就很低，而ctDNA仅占cfDNA的0.1％-5％，且不同癌种，不同病程的肿瘤患者ctDNA在血浆中含量差异较大，因此相比于组织检测，检测ctDNA的微卫星不稳定性需要更高的灵敏度和特异性。
因此一种能有效快速地检测血液ctDNA微卫星不稳定性的方法，是目前亟待解决的问题。
发明内容
为了解决以上问题，本发明提供一种血液ctDNA的微卫星不稳定性检测方法。该方法不仅能检测样本类型为肿瘤组织的微卫星不稳定性，还能检测血液样本的微卫星不稳定性，这有利于肿瘤组织不易取的患者。
本发明通过以下技术方案实现其目的：一种血液ctDNA的微卫星不稳定性检测方法，包括以下步骤：
(1)提取包含ctDNA的cfDNA后，进行探针捕获，对获得的目标产物建立测序文库，然后对文库中的序列上机测序，测序读长为150bp；
(2)下机拆分步骤(1)获得的测序数据，并对拆分的数据进行质控和过滤，将数据和人类参考基因组进行比对，获取比对数据后建立比对数据的索引和去除重复序列；
(3)从步骤(2)的比对结果中提取包含微卫星位点的测序序列，并对所述序列进行分类计数，获得每种测序序列的置信值，抛弃低置信值的序列，将合格的所述序列与正常的微卫星位点序列进行比对；
(4)通过步骤(3)的比对结果获得该位点的微卫星不稳定性和突变情况，通过微卫星不稳定性位点的数目和检测出微卫星位点的总数的比例确定样本微卫星序列的稳定性。
优选地，所述步骤(1)中cfDNA提取后将其DNA分子随机打断，并对cfDNA片段进行末端修复并在3’端添加A碱基；所述探针捕获中所使用的特异性探针为具有特异性的小片段DNA序列。
优选地，所述步骤(2)中的过滤是通过fastq软件过滤掉质量不合格，N含量过多的序列；采用bwa软件将过滤后的数据和人类参考基因组做比对，找到每条测序的序列在人类参考基因组中的位置；采用samtools软件获取比对后的数据。
优选地，所述步骤(3)中提取包含微卫星位点的测序序列采用perl程序，并过滤深度较低和比对质量较差的测序序列；所述低置信值的序列为置信值低于0.05的测序序列。
优选地，所述步骤(3)中测序序列的置信值统计方法如下：把包含相同微卫星位点的测序序列进行分类并计数，计算每种测序序列的数目与数目最多的测序序列的比例，如果比率低于5％，则认为此微卫星序列情况不可信并抛弃此序列，最后把比例作为此序列的置信值。
优选地，所述步骤(4)中通过perl程序获得该位点的微卫星不稳定性和突变情况。
优选地，所述步骤(4)中对包含微卫星位点的测序数据进行突变情况识别的方法如下：提取正常序列中微卫星序列中的重复单位和其重复数，以其重复单位为种子，在提取的微卫星位点的不同序列中寻找相连的重复单位并计算其重复出现的次数；比较其重复次数和正常序列次数做对比，如果重复数少于正常序列的重复数，则视为发生缺失突变，如果重复数多于正常序列的重复数，则视为发生插入突变；如果序列中有两处连续重复的种子序列，且它们重复数总数比正常序列的重复数少一个和它们之间间隔一个种子序列的长度，则视为这个序列发生了单核苷酸突变；如果这个微卫星位点所有的序列都没有发生突变则视为该点微卫星稳定。
优选地，步骤(4)中样本微卫星序列的稳定性检测结果确定方法如下：
统计所有检测出的微卫星位点数目和微卫星不稳定性位点的数目，如果微卫星不稳定性位点数目占所有检测出的微卫星位点数目的30％以上，则认为高频微卫星不稳定；如果微卫星不稳定性位点数目占所有检测出的微卫星位点数目的比值在10％～20％之间，则认为低频微卫星不稳定；如果微卫星不稳定性位点数目占所有检测出的微卫星位点数目的10％以下，则认为微卫星稳定。
优选地，所述步骤(1)中的二代测序仪为illumina NextSeq CN500测序仪。
优选地，所述步骤(1)中的样本血浆来自于肿瘤患者的外周血。
优选地，所述步骤(1)中的测序方式为双端测序，探针为具有特异性的小片段DAN序列。
与现有技术相比本发明的有益效果：本发明方法相比传统的PCR检测微卫星不稳定性方法，具有高通量、高灵敏度、高效率及操作简便等优势；相比其他基于下一代测序技术的微卫星不稳定检测，还具有以下优点：
1、本发明的检测方法能检测患者ctDNA中的微卫星序列情况，取样为患者外周血，取样简单方便，能全面的检测患者整体肿瘤的微卫星不稳定性，能做到实时监控。
2、本发明的检测方法不需要对照样本，节省了对照样本的实验、测序及分析的步骤，从而降低了成本及分析的复杂度。
3、本发明的检测方法不仅能检测微卫星序列的插入和缺失突变，还能检测微卫星序列的单核苷酸突变，检测更全面和精确。
4、本发明的检测方法通过特异性探针的捕获和高深度测序提高了对位点的捕获效率，使检测灵敏性高和特异性强。
附图说明
图1为本发明的主要流程图。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步的详细描述。
本发明重点说明一种用于肿瘤患者血液ctDNA的超低频突变位点检测的生物信息方法，能从肿瘤患者的外周血中检测出其微卫星序列的突变情况，并判断患者的微卫星不稳定性。此方法具有良好的普适性，不仅可以适用于所有包含微卫星位点的测序序列数据，还可以选择性的应用于各种与靶向测序兼容的基因检测技术，在检测样本的基因突变的同时检测出样本的微卫星不稳定。
本实验数据来自5间医院的15个癌症患者的肿瘤样本和5例正常人样本，样本获取后进行DNA提取和探针捕获建库，上机测序获得测序数据。通过MSI-PCR检测结果和其它三个二代测序检测软件的结果对比，验证本发明方法的准确性，具体过程如下：
(1)运用磁珠法获取样本血液中包含ctDNA的cfDNA，把DNA随机打断，再加入末端修复酶，进行末端修复，同时3’端添加A碱基和加入6bp的接头序列，纯化产物，去除未连接的接头序列。
(2)对含有接头的DNA序列进行PCR扩增，反应程序：95℃预变性3min，聚合酶链式反应扩增阶段：95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸20s，并进行13个循环。
(3)PCR扩增产物和含有探针的DNA芯片平台进行杂交捕获，富集含有目标区域的DNA序列。对富集的DNA序列进行PCR扩增，建立测序文库并上机测序。
(4)对于测序得到的数据我们会使用fastq软件进行过滤，筛除掉测序质量不及格、序列中具有太多的未知碱基和序列长度较短的序列，然后用bwa软件把过滤后的数据和人类基因组做比对，找到每条测序的序列在人类基因组中的位置，用samtools软件对比对后的数据进行获取并处理，建立比对数据的索引和去除重复序列。
用perl程序对所测序的2389个微卫星位点的正常序列进行整理，提取微卫星序列中的重复单位和重复次数，生成用于比对的bed文件。表1为2389个微卫星序列情况表；
根据bed文件中整理的微卫星位点序列信息，用perl脚本对下机数据中包含微卫星位点的序列进行提取，过滤和获得其置信值；
用perl程序对微卫星位点序列和正常序列进行对比，判定该微卫星位点的稳定性，计算微卫星不稳定性位点在所有微卫星位点中的占比，根据比率判断微卫星不稳定性情况；
根据对20个样本的检测结果表明正常人样本的微卫星不稳定位点突变情况都为微卫星稳定，即微卫星不稳定性位点占所有检测出的微卫星位点的比例低于10％，检测结果显示这几个样本微卫星不稳定性位点占比的范围为4.34％～8.61％，而15个肿瘤样本中，其中的4个检测林奇综合征的样本中只有一个样本的微卫星状态为低频微卫星不稳定，其微卫星不稳定性位点占所有检测出的微卫星位点的比例为28.73％，其余三个样本的微卫星不稳定性位点突变情况都处于高频微卫星不稳定，微卫星不稳定性位点占所有检测出的微卫星位点的比例高于30％，检测结果表明这三个样本微卫星不稳定性位点占比的范围为31.65％～34.68％。至于其中检测食管鳞状癌的两个样本中一个微卫星状态为低频微卫星不稳定性(微卫星不稳定性位点占比28.62％)，另一个微卫星状态为高频微卫星(微卫星不稳定性位点占比30.56％)。另外检测乳腺癌的两个样本的微卫星状态都为低频微卫星不稳定性(微卫星不稳定性位点占比22.37％和23.51％)。剩下的样本中，检测卵巢癌、肾腺癌、甲状腺癌都为微卫星稳定(微卫星不稳定性位点占比分别为9.83％、5.78％和9.61％)，检测肺腺癌、肺鳞癌、胆囊癌、肾癌都为低频微卫星不稳定(微卫星不稳定性位点占比分别为19.87％、17.47％、19.56％和28.19％)。
为了检验开发的软件检测出结果的准确性，我们对20个样本进行了MSI-PCR检测，检测结果表明4个检测林奇综合征症的样本中有一个为低频微卫星不稳定，其余都是高频微卫星不稳定。检测食管鳞状癌的两个样本中一个微卫星状态为低频微卫星不稳定性，另一个微卫星状态为高频微卫星不稳定；另外检测乳腺癌的两个样本的微卫星状态都为低频微卫星不稳定性，剩下的样本中，检测卵巢癌、甲状腺癌、肾腺癌都为微卫星稳定，检测肺腺癌、肺鳞癌、胆囊癌都为低频微卫星不稳定，但检测的肾癌却是高频微卫星不稳定。结果显示我们所研究的基于二代测序的微卫星不稳定性检测方法检测出的结果和MSI-PCR结果基本一致，说明我们的方法得出的结果的准确性可靠(此方法准确率为95％以上)。表1为20个检测样本的微卫星不稳定性检测结果统计表。MSI-PCR为MSI-PCR检测结果，MSI State为本发明方法检测结果，precent为此样本微卫星不稳定性位点的占总微卫星位点数的比率。
表1：20个检测样本的微卫星不稳定性检测结果统计表
同时分别用MSIsensor、mSINGS和MSMuTect这三个检测微卫星不稳定性软件分别对20个样本的二代测序数据进行微卫星不稳定性检测，检测结果表明，虽然这三个软件都能分辨出5个正常样本为微卫星稳定，但对于15个肿瘤样本的结果却各有不同。MSIsensor软件能检出样本的总微卫星位点数平均值为1897，15个样本中正确检出10个样本的结果，错误地把5个低频微卫星不稳定的样本的微卫星突变情况判断为高频微卫星不稳定性(微卫星不稳定性阳性样本的检测准确性为58.33％，微卫星不稳定性阴性样本的检测准确性为100％，灵敏度为79％)。mSINGS软件能检出样本的总微卫星位点数平均值为2314，15个样本中正确检出13个样本的结果，错误地把一个高频微卫星不稳定样本判断为低频微卫星不稳定和把一个低频微卫星不稳定判断为高频微卫星不稳定(微卫星不稳定性阳性样本的检测准确性为83.33％，微卫星不稳定性阴性样本的检测准确性为100％，灵敏度为96.4％)。MSMuTect软件能检出样本的总微卫星位点数平均值为2336，15个样本中正确检出14个样本的结果，错误地把一个低频微卫星不稳定性样本的微卫星不稳定性突变情况判断为高频微卫星不稳定(微卫星不稳定性阳性样本的检测准确性为91.66％，微卫星不稳定性阴性样本的检测准确性为100％，灵敏度为97.29％)。而我们方法的结果为微卫星不稳定性阳性样本的检测准确性为91.66％，微卫星不稳定性阴性样本的检测准确性为100％，灵敏性为97.6％。相比较其他的软件，很明显此发明的基于二代测序的微卫星不稳定性检测方法更准确、更灵敏和检测出的位点更多。表2为4种检测微卫星不稳定性位点的方法比较的详细表。
表2：各个检测软件的准确率和灵敏度比较表
根据以上所述表明，本发明具有以下优点：1、准确性高，灵敏度强，高通量，能有效准确的检测出肿瘤患者的微卫星不稳定性。2、样本取样简单，只需要取患者外周血就能检测其微卫星不稳定性。3、基于二代测序数据的微卫星不稳定性检测方法可以消除需要对MSI状态进行单独的、专门的检测，在获得更全面的遗传信息的过程中检测微卫星不稳定性这一临床上重要的肿瘤表型。4、此方法能检测更多的微卫星位点，相比较特意地对不同肿瘤进行MSI-PCR的微卫星位点筛选设计来说，此方法更方便快捷，同时减少没有检测出一些突变了的微卫星序列的情况。涵盖大量的微卫星突变位点有利于更全面的对肿瘤患者的微卫星突变情况进行分析。5、节省时间和人力，MSI-PCR的检测方法需要3到4天的时间出结果，同时需要进行电泳等实验，结果需要人工的判断，而结果的判断有可能会出错，特别当同位基因大小相近的时候。相对的，我们发明的这种方法只需要一天就能出结果，同时检测结果能自动生成，生成的结果能准确知道微卫星突变情况。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种血液ctDNA的微卫星不稳定性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取包含ctDNA的cfDNA后，进行探针捕获，对获得的目标产物建立测序文库，然后对文库中的序列上机测序，测序读长为150bp；
(2)下机拆分步骤(1)获得的测序数据，并对拆分的数据进行质控和过滤，将数据和人类参考基因组进行比对，获取比对数据后建立比对数据的索引和去除重复序列；
(3)从步骤(2)的比对结果中提取包含微卫星位点的测序序列，并对所述序列进行分类计数，获得每种测序序列的置信值，抛弃低置信值的序列，将合格的所述序列与正常的微卫星位点序列进行比对；
(4)通过步骤(3)的比对结果获得该位点的微卫星不稳定性和突变情况，通过微卫星不稳定性位点的数目和检测出微卫星位点的总数的比例确定样本微卫星序列的稳定性。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中cfDNA提取后将其DNA分子随机打断，并对cfDNA片段进行末端修复并在3’端添加A碱基；所述探针捕获中所使用的特异性探针为具有特异性的小片段DNA序列。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中的过滤是通过fastq软件过滤掉质量不合格，N含量过多的序列；采用bwa软件将过滤后的数据和人类参考基因组做比对，找到每条测序的序列在人类参考基因组中的位置；采用samtools软件获取比对后的数据。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中提取包含微卫星位点的测序序列采用perl程序，并过滤深度较低和比对质量较差的测序序列；所述低置信值的序列为置信值低于0.05的测序序列。
5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中测序序列的置信值统计方法如下：把包含相同微卫星位点的测序序列进行分类并计数，计算每种测序序列的数目与数目最多的测序序列的比例，如果比率低于5％，则认为此微卫星序列情况不可信并抛弃此序列，最后把比例作为此序列的置信值。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中通过perl程序获得该位点的微卫星不稳定性和突变情况。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中对包含微卫星位点的测序数据进行突变情况识别的方法如下：
提取正常序列中微卫星序列中的重复单位和其重复数，以其重复单位为种子，在提取的微卫星位点的不同序列中寻找相连的重复单位并计算其重复出现的次数；比较其重复次数和正常序列次数做对比，如果重复数少于正常序列的重复数，则视为发生缺失突变，如果重复数多于正常序列的重复数，则视为发生插入突变；如果序列中有两处连续重复的种子序列，且它们重复数总数比正常序列的重复数少一个和它们之间间隔一个种子序列的长度，则视为这个序列发生了单核苷酸突变；如果这个微卫星位点所有的序列都没有发生突变则视为该点微卫星稳定。
8.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)中样本微卫星序列的稳定性检测结果确定方法如下：
统计所有检测出的微卫星位点数目和微卫星不稳定性位点的数目，如果微卫星不稳定性位点数目占所有检测出的微卫星位点数目的30％以上，则认为高频微卫星不稳定；如果微卫星不稳定性位点数目占所有检测出的微卫星位点数目的比值在10％～20％之间，则认为低频微卫星不稳定；如果微卫星不稳定性位点数目占所有检测出的微卫星位点数目的10％以下，则认为微卫星稳定。
9.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中的使用的测序仪为illumina NextSeq CN500测序仪；所述测序方式为双端测序，探针为具有特异性的小片段DNA序列。
10.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中的cfDNA来自于肿瘤患者的外周血。
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