CN101679970A - 青光眼发病风险的判定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供是否存在青光眼风险的判定方法,该判定方法包括以下步骤:在来自受检者的样品中,在体外检测存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的等位基因和/或基因型的步骤,所述核苷酸序列为选自SEQ ID NO:203~514所示的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列(步骤A);以及将上述步骤A中检测到的等位基因和/或基因型与SEQ ID NO:203~514所示的核苷酸序列中包含高风险等位基因的至少一个等位基因和/或基因型进行比较的步骤(步骤B)。根据本发明的方法,通过分析样品中的本发明的单核苷酸多态性的等位基因或基因型,可以判定样品提供者的青光眼发病风险的高低,根据该风险,样品提供者可以采取预防青光眼的措施、或者接受适当的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测与青光眼发病有关的单核苷酸多态性或青光眼发病风险高的单核苷酸多态性的存在的方法、以及用于该检测方法的试剂盒。
背景技术
青光眼是一种由于视网膜神经节细胞死亡而导致特征性视神经乳头凹陷和视野缺损的疾病。眼压升高被认为是青光眼中乳头凹陷和视野缺损的主要原因。另一方面,还存在一种眼压在经统计计算得到出的正常范围内的青光眼,但这种情况下,对其个体而言该眼压也是足以产生视野缺损的高眼压,所以也认为是发生了青光眼。
治疗青光眼的基本原则是保持低眼压,为了保持低眼压,就必需要考虑导致高眼压的原因。因此,在青光眼的诊断中,重要的是根据眼压的高低及其原因对青光眼进行分类。作为导致眼压升高的原因,充满眼内的房水的主要排出经路-隅角是否存在闭塞是重要的。从上述观点考虑,原发性青光眼大致分为伴有隅角闭塞的隅角闭塞型青光眼和不伴有隅角闭塞的隅角开放型青光眼。其中,隅角开放型青光眼又分为:伴有眼压升高的狭义的隅角开放型青光眼、即原发性隅角开放型青光眼和眼压在正常范围内的正常眼压青光眼。
很久以来就已知青光眼与遗传有关,有报道称:在隅角开放型青光眼中,有5~50%具有家族史,通常有20~25%是遗传性的。根据上述报道,人们在进行探索青光眼的致病基因的研究,作为研究的成果,有人报道了肌球蛋白样蛋白(Myocilin,MYOC)基因的突变与隅角开放型青光眼有关(参照专利文献1)、而视神经蛋白基因(optineurin,OPTN)的突变与正常眼压青光眼有关(参照非专利文献1)。但仅凭这些基因还无法说明所有青光眼的遗传因素,于是设想还存在未知的青光眼相关基因。
另一方面,单核苷酸多态性是指在个体基因组的核苷酸序列中,发现一个碱基变成其它碱基的置换突变,该突变在其生物种的集团中以某种程度的频率、通常约1%以上的频率存在。单核苷酸多态性存在于基因上的内含子、外显子或除此以外的基因组的所有区域。
专利文献1:日本特开2000-306165号公报
非专利文献1:Rezaie T其他作者11名,Science,2002年,第295卷,No.5557,第1077~1079页.
发明内容
发明所要解决的课题
通常,将眼压或眼底照片用作青光眼的简单检查,但通过这些检查还不能确诊青光眼。除此之外,通常还进行视野检查,但却存在以下问题:检查时间长,患者负担大;以及患者必需适应检查,所以初次检查结果的可靠性低等。
另一方面,如上所述,在青光眼的发病中强烈怀疑有遗传因素的参与,但决定性的致病基因还未确定。另一方面,即使根据单一基因的突变或多态性还无法说明与疾病有关,但却认为可如下说明青光眼的发病与遗传因素有关:存在多个与青光眼有关的比较稳定的基因突变或多态性,各个突变或多态性结合起来发挥作用。
本发明人等为了找出与青光眼有关的基因,着眼于基因组上的多态性、特别是单核苷酸多态性。
通过找出与青光眼发病有关的多态性,具有该多态性、即在青光眼患者中高频率确认到的多态性的人,甚至在发病前就预知将来青光眼的发病风险高。或者,该多态性可用于筛选是否需要进行初期青光眼的视野检查,上述初期青光眼通过简单的青光眼判定、即测定眼压或眼底照片等方法难以检测,只能通过视野检查作出初次诊断。即,通过了解青光眼发病风险,样品提供者可以采取预防青光眼发病的措置。另外,可以采取例如通过精密检查作出的早期确诊和开始治疗等防止视野狭窄所必需的措置,所以找出与青光眼发病相关的多态性具有深远意义。
本发明的课题在于:提供通过检测与青光眼发病有关的单核苷酸多态性来预测青光眼发病风险的方法、和用于该检测方法的试剂盒。
解决课题的方法
本发明人等对青光眼患者和不具有青光眼家族史的非患者的基因组(常染色体)上所存在的公知多态性部位进行综合分析,发现了与青光眼发病有关的单核苷酸多态性。在该单核苷酸多态性中进一步发现了:在青光眼患者中高频率确认到的等位基因及其对立等位基因、以及各等位基因的组合、即在青光眼患者中高频率确认到的基因型。并且发现:通过将上述多个与青光眼发病有关的单核苷酸多态性组合起来进行判定,可以精度更高地判定样品提供者是否容易发生青光眼,从而完成了本发明。
即,本发明涉及下述[1]~[7]。
[1]是否存在青光眼风险的判定方法,该方法包括以下步骤:
步骤A:在体外检测在来自受检者的样品中存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的等位基因和/或基因型的步骤,所述核苷酸序列为选自SEQ ID NO:203~514所示的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列;以及
步骤B:将上述步骤A中检测到的等位基因和/或基因型与SEQ IDNO:203~514所示的核苷酸序列中包含高风险等位基因的至少一个等位基因和/或基因型进行比较的步骤,
当上述步骤A中检测到的等位基因为上述高风险等位基因时,判定存在青光眼风险;或者,当上述高风险等位基因符合显性遗传模型、且上述步骤A中检测到的基因型为包含上述高风险等位基因的基因型的纯合子或杂合子时,判定存在青光眼风险;当上述高风险等位基因符合隐性遗传模型、且上述步骤A中检测到的基因型为包含上述高风险等位基因的基因型的纯合子时,判定存在青光眼风险。
[2]是否存在青光眼风险的判定方法,该方法包括以下步骤:
步骤C1:在体外检测在来自受检者的样品中存在于核酸分子的如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的等位基因和/或基因型的步骤,上述核酸分子包含选自SEQ ID NO:203~514所示的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列;或
步骤C2:使用含有核苷酸序列的核酸分子,在体外检测上述单核苷酸多态性的等位基因和/或基因型的步骤,上述核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:515~694所示的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列;以及
步骤D:将上述步骤C1或C2中检测到的等位基因和/或基因型与至少一个核酸分子进行比较的步骤,上述核酸分子含有SEQ IDNO:203~514所示的核苷酸序列中包含高风险等位基因的等位基因和/或基因型,
上述步骤C1或C2中检测到的等位基因为上述高风险等位基因时,判定为存在青光眼风险;或者,当上述高风险等位基因符合显性遗传模型、且上述步骤C1或C2中检测到的基因型为包含上述高风险等位基因的基因型的纯合子或杂合子时,判定为存在青光眼风险;当上述高风险等位基因符合隐性遗传模型、且上述步骤C1或C2中检测到的基因型为包含上述高风险等位基因的基因型的纯合子时,判定为存在青光眼风险。
[3]判定是否存在青光眼风险的试剂盒,该试剂盒含有下述核酸分子:包含选自SEQ ID NO:203~514所示的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列或它们的部分序列的核酸分子,该核酸分子包含存在于各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性;和/或含有核苷酸序列的核酸分子,所述核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:515~694所示的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列;该试剂盒用于在体外检测在来自受检者的样品中上述单核苷酸多态性的等位基因和/或基因型。
[4]是否存在青光眼风险的判定方法,该方法包括以下步骤:
步骤(i):从来自受检者的样品中提取核酸分子的步骤;
步骤(ii):对于上述步骤(i)中提取的核酸分子,将存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的等位基因分类的步骤,上述核苷酸序列为选自SEQ ID NO:203~514所示的核苷酸序列或其互补序列的至少一个核苷酸序列;
步骤(iii):根据上述步骤(ii)中检测到的等位基因判定是否存在青光眼风险的步骤。
[5]核酸分子在判定青光眼风险中的应用,所述核酸分子包含选自SEQ ID NO:203~514所示的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列或它们的部分序列,该核酸分子包含存在于各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的等位基因和/或基因型。
[6]青光眼的诊断方法,该方法包括以下步骤:
步骤E:在体外检测在来自受检者的样品中存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的等位基因和/或基因型的步骤,上述核苷酸序列为选自SEQ ID NO:203~514所示的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列;以及
步骤F:将上述步骤E中检测到的等位基因和/或基因型与SEQ IDNO:203~514所示的核苷酸序列中包含高风险等位基因的至少一个等位基因和/或基因型进行比较的步骤,
上述步骤E中检测到的等位基因为上述高风险等位基因时,诊断为青光眼;或者,当上述高风险等位基因符合显性遗传模型、且上述步骤E中检测到的基因型为包含上述高风险等位基因的基因型的纯合子或杂合子时,诊断为青光眼;当上述高风险等位基因符合隐性遗传模型、且上述步骤E中检测到的基因型为含有上述高风险等位基因的基因型的纯合子时,诊断为青光眼。
[7]青光眼发病风险的判定方法,该方法包括以下步骤:
步骤(I):使用权利要求3所述的判定方法判定是否存在青光眼发病风险的步骤;
步骤(II):在上述步骤(I)中,当根据至少任一个单核苷酸多态性判定存在发病风险时,判定需要进行进一步的风险判定的步骤;
步骤(III):在上述步骤(II)中,当判定需要进行进一步的风险判定时,使用权利要求5所述的判定方法,进一步判定是否存在青光眼发病风险的步骤。
发明效果
根据本发明的方法,通过分析来自存在于样品中的基因组的核酸分子中所含的、本发明的单核苷酸多态性的等位基因或基因型,判定样品提供者是否存在青光眼发病风险,并且可以预测风险的高低。根据该风险,样品提供者可以采取预防青光眼的措施、或者接受适当的治疗。另外,利用本发明的方法,疑似青光眼的样品提供者可以接受精密检查,该精密检查可以诊断根据眼压或眼底照片难以充分判别的初期青光眼,所述样品提供者在基因组中具有在青光眼患者中高频率确认到的包含单核苷酸多态性的等位基因或基因型。当诊断为青光眼时,可以在早期开始治疗。
实施发明的最佳方式
本发明涉及是否存在青光眼风险的判定方法,在该青光眼风险的判定方法中,包括下述步骤:使用选自特定核苷酸序列的核苷酸序列或其互补序列中所含的至少一个单核苷酸多态性(以下,有时还记作SNP),在体外检测具有上述至少一个单核苷酸多态性的等位基因和/或基因型的步骤;该方法还包括下述步骤:在来自受检者的样品中,将通过上述步骤检测到的等位基因和/或基因型与特定核苷酸序列中的含有高风险等位基因的至少一个等位基因和/或基因型进行比较的步骤;当上述检测到的等位基因为上述高风险等位基因时,判定为存在青光眼风险;或者,当上述高风险等位基因符合显性遗传模型、且上述检测到的基因型符合包含上述高风险等位基因的基因型的纯合子或杂合子时,判定为存在青光眼风险;当上述高风险等位基因符合隐性遗传模型、且上述检测到的基因型为包含上述高风险等位基因的基因型的纯合子时,判定为存在青光眼风险。本发明具有以下主要特征:发现了与青光眼发病有关的单核苷酸多态性,还发现了:在该单核苷酸多态性中,存在青光眼患者中高频率确认到的等位基因及其对立等位基因、以及各等位基因的组合即青光眼患者中高频率确认到的基因型,并加以使用。需要说明的是,在本说明书中,多态性是指在某生物种的基因组的特定位置序列中确认到多样性,而多态性存在的部位(以下还称作多态性部位)是指确认到单核苷酸多态性的基因组上的部位。
在本说明书中,等位基因是指在某多态性部位能够获取的、彼此具有不同碱基的各型。本说明书中,基因型是指在某多态性部位对立的等位基因的组合。并且,在某多态性部位,对立的等位基因的组合、即基因型中存在三个型,将相同等位基因的组合称作纯合子,将不同等位基因的组合称作杂合子。
在本说明书中,对立的等位基因是指在构成某单核苷酸多态性的等位基因中,对应于特定的等位基因的其它等位基因。
本发明中,与青光眼有关的单核苷酸多态性是指与青光眼的发病有关的单核苷酸多态性或与青光眼的进展有关的单核苷酸多态性,即与青光眼发病有关的单核苷酸多态性是指,在青光眼患者和非患者中,统计学上的p值显示该单核苷酸多态性中各等位基因或基因型的频率显著不同,而与青光眼的进展有关的单核苷酸多态性是指在青光眼进展例与青光眼非进展例中,统计学上的p值显示该单核苷酸多态性中各等位基因或基因型的频率显著不同。
本发明中,高风险等位基因是指上述与青光眼有关的单核苷酸多态性的各等位基因中,在青光眼患者组中的频率较在非患者组中的频率高的等位基因。另一方面,在本发明中,低风险等位基因是指在某多态性部位与高风险等位基因对立的等位基因。
另外,基因型的纯合子和杂合子按照与在高风险等位基因和低风险等位基因中相同的方式进行定义。即,在某多态性部位中,将高风险等位基因之间险等位或低风险等位基因之间的组合称作纯合子,将高风险等位基因与低风险等位基因的组合称作杂合子。
将青光眼患者组与非患者组的等位基因频率进行统计学比较的方式称作等位基因模型,而将基因型频率进行比较的方式称作基因型模型。需要说明的是,在基因型模型中有显性遗传模型和隐性遗传模型,前者是指高风险等位基因的纯合子和杂合子均与发病风险有关的方式,而后者是指高风险等位基因的纯合子与发病风险有关的方式。
本发明中,青光眼风险是指与青光眼有关的风险。青光眼的发病风险是指根据疾病感受性确定的、将来发生青光眼的可能性。本发明中,风险预测是指现阶段判定将来是否会存在风险、或者现阶段确定将来风险的高低。
在本说明书中,青光眼优选是指隅角开放型青光眼(OAG)或正常眼压青光眼(NTG),隅角开放型青光眼是指在没有特别限制使用的情况下,不包括正常眼压青光眼的狭义的原发性隅角开放型青光眼(POAG)。
以下说明与青光眼有关的单核苷酸多态性的鉴定方法。
本发明中,关于与青光眼有关的单核苷酸多态性,具体而言,从诊断为原发性隅角开放型青光眼或正常眼压青光眼的青光眼患者和诊断为不是青光眼且通过问诊判断没有青光眼家族史的非患者(有时还记作对照者)各自的血液中提取总DNA,以人基因组上公知的约50万个单核苷酸多态性为指标,比较各单核苷酸多态性的等位基因或基因型在青光眼患者和非患者中的频率,由此选择作为候选的单核苷酸多态性。并且,通过在不同于上述样品组的青光眼患者和非患者中取得选择作为候选的上述各单核苷酸多态性的等位基因或基因型的频率,并将这些结果整合,发现了频率之差在统计学上确认为高显著性的单核苷酸多态性。另外,由青光眼患者组成的组作为青光眼患者组,由非患者组成的组作为非患者组。使用通过上述解析发现的、具有与青光眼发病有关的单核苷酸多态性的等位基因或基因型,从而可以判定是否存在青光眼的发病风险、以及预测发病风险的高低。利用下述方法可以鉴定本发明所公开的与青光眼有关的单核苷酸多态性,有关细节在实施例项下说明。
(与青光眼有关的单核苷酸多态性的鉴定)
首先,从诊断为青光眼的患者和判断不具有青光眼家族史的非患者各自的血液中提取总DNA。血液中的总DNA可以通过公知的任意方法进行提取,例如将细胞溶解,使洗脱的DNA结合在用二氧化硅包被的磁性珠粒的表面,再利用磁力进行分离、回收,从而可以提取DNA。
在提取的DNA样品中,单核苷酸多态性中的碱基种类、即具有单核苷酸多态性的等位基因的鉴定可以利用例如后述的使用固定化探针的方法等任意方法来进行。此时,用于检测的探针可以根据目标单核苷酸多态性及其周边的序列信息来设计。设计时,还可以使用dbSNP等公知的单核苷酸多态性数据库,参考从中得到的序列信息。用于检测单核苷酸多态性的探针可以是与基因组的有义链互补的探针,也可以是与反义链互补的探针,两者均可进行检测。将大量的可检测存在于人基因组上的单核苷酸多态性的探针固定化,之后通过相同操作可以确定多个单核苷酸多态性的等位基因的试剂盒也已市售,使用上述试剂盒还可以高效率地确定样品中的等位基因,其细节见后述。另外,许多上述试剂盒都具有通过相同操作来检测一个样品中所含的对立的各等位基因的构成,可以确定基因型。
与青光眼有关的单核苷酸多态性可如下确定:事先按照上述方法鉴定存在于来自青光眼患者和非患者的DNA中的等位基因,将各等位基因的频率和基因型的频率在青光眼患者组与非患者组之间作统计学比较,对于等位基因频率或基因型频率的至少一种,根据是否产生如下差值来进行判定:所述差值是p值为低于根据某基准确定的显著水平的差值。产生差值时,对于上述因子,在青光眼患者组与非患者组之间比较等位基因频率或基因型频率,确定是否任一个等位基因或基因型在青光眼患者组被高频率确认。
在统计学分析中,例如可以采用卡方检验。另外,因反复进行比较而产生的第一种错误可以通过公知的校正方法、例如Bonferroni方法进行校正,在基于Bonferroni校正的情况下,例如可以用p值5×10-2除以检验的反复次数、即作为卡方检验的比较对象的多态性的个数,得到显著水平。可以选择低于如此求得的显著水平的单核苷酸多态性作为更优选的单核苷酸多态性,而其它公知的用于多重性校正的方法、例如FDR法或置换法也可用于选择优选的单核苷酸多态性。但是,Bonferroni校正等公知的多重性校正方法是以反复分析的事件完全独立为前提的方法,另一方面,如下所述,由于在单核苷酸多态性中确认到连锁不平衡,所以会存在并不完全独立的情况。即,认为这种情况下采用Bonferroni方法进行校正会导致过度校正。特别是对于本发明这样的遍及全基因组的单核苷酸多态性分析,应该进行统计比较的因素非常多,所以若进行多重性校正,则作为基准的p值会显著降低,忽略与疾病有关的单核苷酸多态性的可能性会增加(Schymick J C等,Lancet Neurology.2007:6:322-8:Van Steen K等,Nature Genetics.2005:37:683-691)。学术上所期望的多重性校正方法尚未确立,但作为其它的校正方法,可以利用其它公知的校正方法进行校正,或者在不低于由Bonferroni校正得到的显著水平的范围的任意适当水平上设定显著水平。设定任意的适当水平时,例如在反复分析50万个单核苷酸多态性的情况下,显著水平采用5×10-2,更优选1×10-2,进一步优选1×10-3,更进一步优选1×10-4,再进一步优选3×10-5,又进一步优选1×10-5。如下所述,本发明中已经确认与青光眼的关联得到认可的单核苷酸多态性在基因组上的某个领域连续存在,所以上述显著水平的调整是有用的。
另外,已知第一类错误与统计学检测力通常成反比。作为减小第一类错误的同时保持检测力的方法,可以列举出:将单核苷酸多态性分析分两阶段进行实施的方法(Skol A.D.等,Nature Genetics.2006:38:209-213)。例如,对一定数量的某样品进行单核苷酸多态性分析时,首先,进行一次分析、即对其一部分样品进行遍及全基因组的多个单核苷酸多态性分析,接着进行二次分析、即使用一次分析中以某种程度缩减的单核苷酸多态性对剩余样品进行分析。这种情况下,可以选择在所有分析中均得到较低p值、例如p值为0.05的单核苷酸多态性,优选按一定的显著水平选择在最初分析中作为候选的单核苷酸多态性,使用其它样品进一步分析上述所选择的单核苷酸多态性。另一方面,更优选将一次分析和二次分析的结果整合进行分析,而不是分别进行统计分析。这种情况下,可以按照公知的整合分析(メタ解析)方法、例如Mantel-Haenszel法(Mantel N等,Journal of the National CancerInstitute 1959:22:719-748),将两次的分析结果整合。按照Mantel-Haenszel法等整合分析方法将分析结果整合时,在各个分析中进行单核苷酸多态性选择的显著水平不必是Bonferroni校正的水平,可以考虑缩减效率等来设定。另一方面,使用按照Mantel-Haenszel法等整合分析方法整合的p值来判断是否显著时,优选在考虑多重性的情况下使用显著水平。需要说明的是,Mantel-Haenszel法是指在进行卡方检验等时,将通过多次分析得到的结果进行加权,之后将分析结果整合的方法。在按照Mantel-Haenszel法整合的统计学参数中,除p值外,还有后述的比值比等。
就用于检测与青光眼有关的等位基因或基因型的单核苷酸多态性而言,例如基于使用通过1次操作可检测50万个单核苷酸多态性的微阵列进行1次分析而得到的结果时,优选p值为1×10-3以下的单核苷酸多态性,更优选p值为3×10-4以下的单核苷酸多态性,进一步优选p值为1×10-4以下的单核苷酸多态性,更进一步优选p值为3×10-5以下的单核苷酸多态性。当为按照Mantel-Haenszel法等整合分析方法将多个分析结果整合而得到的结果时,优选p值为1×10-2以下的单核苷酸多态性,更优选p值为3×10-3以下的单核苷酸多态性,进一步优选p值为1×10-4以下的单核苷酸多态性,更进一步优选p值为3×10-4以下的单核苷酸多态性。
分析时,为了得到可靠性高的结果,优选对足够数量的单核苷酸多态性进行分析。例如,相对于总样品的各单核苷酸多态性的判定率、即检出率(コ一ルレ一ト,call rate)低的多态性部位发生分型错误(タィピングェラ一,typing error)的几率高,可靠性不高。因此,优选使用检出率足够高的单核苷酸多态性部位进行分析。作为是否采用单核苷酸多态性的基准的检出率优选采用例如显示出优选70%、更优选75%、进一步优选80%、更进一步优选85%、再进一步优选90%以上的检出率的单核苷酸多态性。
此外,分析时可以考虑的因子有:Hardy-Weinberg’s平衡和次要等位基因频率。
Hardy-Weinberg’s平衡是指在没有突变和选择压力的情况下,通过任意交配形成的具有足够个体数的遗传同源集团中,某基因座位上各对立基因的分布频率即使世代交替也保持恒定。Hardy-Weinberg’s平衡是否成立,这可以通过几种公知的方法、例如卡方检验或Fischer直接概率计算法来确认。在足够数目的集团中,认为通过1次任意交配Hardy-Weinberg’s平衡成立,即只要不存在近亲交配,则Hardy-Weinberg’s平衡成立。因此,通常以母集团中Hardy-Weinberg’s平衡成立为前提,为了检测标本的基因型判定的错误,采用Hardy-Weinberg’s平衡的研究。但是,即使整体上Hardy-Weinberg’s平衡成立,但在某基因座位上在疾病组或对照组中不均匀地存在特定基因型时,例如由于存在特定基因型对疾病具有决定性影响的情形等,所以在探索疾病相关基因时,也可省略本研究。
次要等位基因频率是指当为两个等位基因中所含的单核苷酸多态性时,在两个等位基因频率中频率低的等位基因的频率。阈值可以任意设定。如上所述,单核苷酸多态性的概念是指次要等位基因频率超过约1%的概念,所以优选舍弃次要等位基因频率低于1%的单核苷酸多态性。另一方面,在疾病组中等位基因频率极高或极低的等位基因对疾病可能具有决定性的影响。在对多因子疾病原因的多态性的探索中,认为有多个对疾病的参与相对较低的多态性参与了疾病,所以为了探索这样的多态性,排出一定值以下的频率、例如不足5%的次要等位基因,再进行分析,这也可作为优选的方法。反之,在探索对疾病具有决定性影响的多态性时,不进行根据次要等位基因频率的舍弃也是有效的。
对于如此操作而得到的与青光眼有关的等位基因型或基因型,通过参照Genbank等公知序列数据库或dbSNP等公知单核苷酸多态性数据库,可以获得其单核苷酸多态性所存在的基因组上的位置、序列信息、单核苷酸多态性所存在的基因或邻近存在的基因、当存在于基因上时内含子或外显子的区别或其功能、其它生物种中的相同基因等信息,根据这些信息可以获取本发明中使用的核酸分子,设计本发明中使用的探针等。
在如此操作而确定的与青光眼有关的单核苷酸多态性中,将高风险等位基因定义为判断是否存在风险的基准。如上所述,在本发明中,高风险等位基因是指在与青光眼有关的单核苷酸多态性的各等位基因中,在青光眼患者组中的频率较在非患者组中的频率高的等位基因。在本发明中,低风险等位基因是指在某多态性部位与高风险等位基因对立的等位基因。
判定是否存在发病风险可以根据等位基因或基因型来进行。
根据等位基因进行判定时,由于该单核苷酸多态性具有高风险等位基因,故判断存在发病风险。
根据基因型进行判定时,要考虑高风险等位基因是符合显性遗传模型还是符合隐性遗传模型,再来判断发病风险。在某多态性部位,当高风险等位基因的纯合子和杂合子的频率在青光眼患者组中较在非患者组中显著高时,称这些基因型符合显性遗传模型。当高风险等位基因符合显性遗传模型、且基因型为高风险等位基因的纯合子或杂合子时,判断该单核苷酸多态性存在发病风险。另一方面,当高风险等位基因的纯合子的频率在青光眼患者组中较在非患者组中显著高时,称这些基因型符合隐性遗传模型。当高风险等位基因符合隐性遗传模型、且基因型为高风险等位基因的纯合子时,判断该单核苷酸多态性存在发病风险。
判定是否存在发病风险还可以根据低风险等位基因来进行。如上所述,低风险等位基因是与高风险等位基因对立的等位基因,即在非患者组中高频率确认到的等位基因。根据等位基因进行判定时,由于该单核苷酸多态性不具有低风险等位基因,故判断存在发病风险。
基因型的情形也同样地考虑。根据基因型进行判定时,要考虑低风险等位基因是符合显性遗传模型还是符合隐性遗传模型,再来判断发病风险。在某多态性部位,当低风险等位基因的纯合子和杂合子的频率在非患者组中较在青光眼患者组中显著高时,称这些基因型符合显性遗传模型。当低风险等位基因符合显性遗传模型、且基因型不是低风险等位基因的纯合子或杂合子时,判断该单核苷酸多态性存在发病风险。另一方面,当低风险等位基因的纯合子的频率在非患者组中较在青光眼患者组中显著高时,称这些基因型符合隐性遗传模型。低风险等位基因符合隐性遗传模型、且基因型不是低风险等位基因的纯合子时,判断该单核苷酸多态性存在发病风险。
至于是否使用等位基因、显性遗传模型、隐性遗传模型中的任一个的方法进行判定,可以采用与求出判断为显著的p值的方法相同的方法。当有关一个单核苷酸多态性存在多种求出判断为显著的p值的方法时,可以采用任一种方法,但优选采用与计算出最低p值的方法相同的方法。
通常,在与疾病有关的单核苷酸多态性中,采用相对危险度或比值比作为指标,其为在一方的等位基因或基因型与是否患有疾病之间存在何种强度的关系的指标。
通常,相对危险度(relative risk)是指携带危险因子的组中的发病率与不携带危险因子的组中的发病率之比。而比值比通常是指患者组中携带危险因子的人的比例与不携带危险因子的人的比例之比,即,用比值除以在非患者组中同样求得的比值而得到的值,如本发明这样的情形,在对照研究中往往使用比值比。在本发明中,比值比根据等位基因频率与基因型频率而求得。即,与发病有关的单核苷酸多态性的比值比是指用青光眼患者组中的某等位基因或基因型的频率与其它等位基因或基因型的频率之比,再除以在非患者组中同样求得的频率之比而得到的值。在本发明中,利用上述指标可以预测在具有某等位基因或基因型时与具有除此以外的等位基因或基因型时相比,青光眼的发病风险增加了何种程度。例如,当某单核苷酸多态性的特定等位基因的比值比大于1时,该等位基因是在青光眼患者组中高频率确认到的等位基因,则比值比越大,携带该等位基因的样品提供者其青光眼发病风险越高。而当等位基因的比值比小于1时,该等位基因是在疾病中高频率确认到的等位基因的对立等位基因,则比值比越小,携带该等位基因的样品提供者其青光眼发病风险越低。至于基因型,也同样可以预测疾病的风险。
在本发明中,通过以高风险等位基因为基准求出比值比,比值比的值常常会大于1。如上所述,当携带高风险等位基因时,通过定义比值比使其大于1,从而使多个单核苷酸多态性组合来进行预测风险变得容易。
以下细节如实施例中的数学式所示,计算等位基因中的比值比时,可以用青光眼患者组中的高风险等位基因频率与低风险等位基因频率之比,再除以非患者组中的高风险等位基因频率与低风险等位基因频率之比,以得到的值作为比值比。计算基因型中的比值比时,要考虑高风险等位基因是符合显性遗传模型还是符合隐性遗传模型,之后再计算比值比。即,当高风险等位基因符合显性遗传模型时,高风险等位基因的纯合子和杂合子成为危险因子;当高风险等位基因符合隐性遗传模型时,高风险等位基因的纯合子成为危险因子。因此,高风险等位基因符合显性遗传模型时的比值比可如下求得:求出青光眼患者组中高风险等位基因的纯合子频率与杂合子频率之和,再用该和与低风险等位基因的纯合子频率之比除以在非患者组中同样求得的频率之比,即可求得比值比。当高风险等位基因符合隐性遗传模型时,求出青光眼患者组中低风险等位基因的纯合子频率与杂合子频率之和,再用高风险等位基因的纯合子频率与上述和之比除以在非患者组中同样求得的频率之比,即可求得比值比。
并且,使用比值比可以确认用于预测风险的单核苷酸多态性的可靠性。如上所述,比值比为1以上和1以下时,对于风险预测的意义相反。因此,求出比值比的95%置信区间,当该置信区间包括1时,并不认为这样的比值比相对于风险预测的可靠性高。
当根据本发明的单核苷酸多态性的组合来预测青光眼的发病风险时,也可以使用比值比的大小来预测其风险的高低。
关于等位基因的比值比,可以通过下式求出将两个以上的单核苷酸多态性组合时的比值比。
(RA1combRA2comb)/(RA3combRA4comb)
其中,
RA1comb:在青光眼患者组中,至少一个等位基因为高风险等位基因时的等位基因频率;
RA2comb:在青光眼患者组中,所有等位基因均为低风险等位基因时的等位基因频率;
RA3comb:在非患者组中,对应于RA1comb的等位基因频率;
RA4comb:在非患者组中,所有等位基因均为低风险等位基因时的等位基因频率。
例如,当考虑组合与青光眼的发病风险有关的两个单核苷酸多态性的情形时,通过用同时携带各单核苷酸多态性的高风险等位基因的、或携带任一所述高风险等位基因的青光眼患者组的频率除以不携带任何高风险等位基因的青光眼患者组的频率,可求出比值比。通过算出与同样求得的非患者组的比值之比,可以求出将单核苷酸多态性组合时的比值比。
计算基因型组合时的比值比时,与单独的情形一样,要考虑高风险等位基因是符合显性遗传模型还是符合隐性遗传模型,再计算比值比。
关于符合显性遗传模型时的比值比,可以通过下式求出将两个以上的单核苷酸多态性组合时的比值比。
(RGd1combRGd2comb)/(RGd3combRGd4comb)
其中,
RGd1comb:在青光眼患者组中,至少一个基因型为高风险等位基因的纯合子或杂合子的频率
RGd2comb:在青光眼患者组中,所有基因型的低风险等位基因均为纯合子的频率
RGd3comb;在非患者组中,对应于RGd1comb的基因型频率
RGd4comb:在非患者组中,所有基因型的低风险等位基因均为纯合子的频率。
例如,两个单核苷酸多态性的高风险等位基因均符合显性遗传模型时的比值比可如下计算:用青光眼患者组中两个单核苷酸多态性中的任一个为高风险等位基因的纯合子或杂合子的频率与两个单核苷酸多态性的低风险等位基因均为纯合子的频率之比除以在非患者组中同样求得的频率之比,即可求得比值比。
关于符合隐性遗传模型时的比值比,可以通过下式求出将两个以上的单核苷酸多态性组合时的比值比。
(RGr1combRGr2comb)/(RGr3combRGr4comb)
其中,
RGr1comb:在青光眼患者组中,至少一个基因型为高风险等位基因的纯合子的频率
RGr2comb:在青光眼患者组中,所有基因型的低风险等位基因均为纯合子的频率
RGr3comb:在非患者组中,对应于RGr1comb的基因型频率
RGr4comb:在非患者组中,所有基因型的低风险等位基因均为纯合子的频率。
例如,两个单核苷酸多态性的高风险等位基因均符合隐性遗传模型时的比值比可如下求得:用青光眼患者组中两个单核苷酸多态性中的任一个的高风险等位基因为纯合子的频率与两个单核苷酸多态性的低风险等位基因均为纯合子的基因型的频率之比除以在非患者组中同样求得的频率之比,即可求得比值比。需要说明的是,关于单核苷酸多态性组合的比值比,还可以将具有不同遗传形式的单核苷酸多态性组合起来进行计算。
通常,通过将两个以上的单核苷酸多态性组合起来,与它们单独使用时相比比值比有所增加。因此,决定利用两个以上的单核苷酸多态性的组合来鉴定青光眼发病风险较高的样品提供者,与单独使用单核苷酸多态性时相比,可以提高预测精度。
为了确认由本发明的单核苷酸多态性的组合得到的青光眼发病风险的预测精度的提高,可以采用多变量分析法。作为多变量分析法,可以采用逻辑回归分析法、判别分析法、重回归分析法、比例风险分析法等本领域技术人员所周知的方法,其中,在处理存在和/或不存在青光眼发病风险等二值变量时,逻辑回归分析法有效。
逻辑回归分析法是指为了说明一个从属变数(Φ)而分析多个独立变数(∏)的贡献程度的方法(ゎかりゃすぃ医学统计学、第148-179页、森實敏夫、Medical Tribune公司)。通过进行逻辑回归分析,可以求出相对于各独立变数的回归系数(λ),该回归系数可以用作表示各独立变数在何种程度上说明从属变数的指标。另外,通过将该回归系数代入下式,可以算出得到各独立变数时的从属变数。
Φ=1/{1+exp[-(λ0+λ1∏1+λ2∏2+λ3∏3+…)]}
需要说明的是,进行逻辑回归分析时,可以采用逐步回归法等事先减少用于分析的独立变数∏。逐步回归法是指按照通过追加任意的独立变数∏使回归系数最大化的方式选择独立变数∏的方法。即,意思是指通过追加任意的独立变数∏使回归系数最大化后,即使再加入其它的独立变数∏,仍可得到相同结果。
在本发明中,通过将两个以上判定为与青光眼发病有关的任意的单核苷酸多态性组合起来,与单独使用各单核苷酸多态性时相比,可以知道发病风险的预测精度所提高的程度。即,以上述任意的两个以上单核苷酸多态性分别作为独立变数∏(一方的等位基因的纯合子=0、杂合子=1、对立等位基因的纯合子=2),通过逻辑回归分析求出上式。在各样品中,将相对于各单核苷酸多态性的变数代入此式,计算从属变数Φ。当从属变数Φ大于一定阈值(例如0.5)时,判断该样品提供者为青光眼患者。核对该判定结果和具有该单核苷酸多态性的样品提供者实际上是否是青光眼患者。根据两个以上本发明的单核苷酸多态性的组合,确认一致的比例有所提高,从而可以确认组合所产生的精度提高。
有时存在于遗传上足够近的位置的单核苷酸多态性部位之间并不是独立遗传,而是连锁遗传。在某集团中,将虽然通过交配发生重组但仍保持这种连锁的状态称作连锁不平衡,将保持连锁的单元称作单元型区段(ハプロタィプブロック,haplotype block)或LD区段。
在本发明人等的实验结果中,发现与青光眼有关的单核苷酸多态性有时实际上是集中存在于基因组上的邻近处。认为这些区域属于与青光眼有关的LD区段。为了确定与青光眼有关的LD区段,利用尽可能多的上述方法分析存在于该区域的单核苷酸多态性,通过采用用于确定LD区段的算法、例如EM算法即可确定。或者,当本发明的与青光眼有关的单核苷酸多态性属于公知的LD区段时,可以将该LD区段作为与青光眼有关的LD区段。公知的LD区段可以在加利福尼亚大学圣克鲁兹分校在互联网上提供的Genome Browser等中浏览。
属于与青光眼有关的LD区段的单核苷酸多态性与通过本发明人等的实验鉴定的与青光眼有关的单核苷酸多态性连锁,所以同样认为其是与青光眼有关的单核苷酸多态性,将其用于预测青光眼的发病或发病风险。另外,通过再次确定与青光眼有关的LD区段内的序列、或通过本发明人等的实验鉴定的与青光眼有关的单核苷酸多态性的周边序列,还有可能发现与该单核苷酸多态性连锁的、即与青光眼的发病或其进展有关的未知单核苷酸多态性。所发现的单核苷酸多态性实际上是否与青光眼的发病或其进展有关,这可以通过按照与上述说明相同的方式在疾病组与对照组间比较其等位基因或基因型的频率来判定。
在本发明中,内含子型单核苷酸多态性(iSNP)是指在内含子中确认到的单核苷酸多态性。翻译区型单核苷酸多态性(cSNP)是指在存在于被翻译成蛋白的区域的单核苷酸多态性中,在氨基酸序列中伴有如下变化:含有该单核苷酸多态性的密码子突变成编码其它氨基酸的密码子或终止密码子等。沉默型单核苷酸多态性(sSNP)是指在翻译区确认到的单核苷酸多态性中,不伴有氨基酸序列变化的单核苷酸多态性。基因组型单核苷酸多态性(gSNP)是指存在于基因组上不编码基因的区域的单核苷酸多态性。转录调节型多态性(rSNP)是指存在于认为与转录调节有关的部位的单核苷酸多态性。
如上所述,单核苷酸多态性有时会存在于基因组上的任何位置,无论何种情形均可与疾病有关。当单核苷酸多态性存在于内含子或非翻译区时,有时会影响基因表达控制、或者影响基因转录后发生的剪接或mRNA的稳定性。当单核苷酸多态性存在于翻译区时,因其碱基置换而发生对应于某氨基酸的密码子变成对应于其它氨基酸的密码子或变成终止密码子等变化,因此有时会在所编码的蛋白结构上发生变化。由于这些变化,使基因的表达量或功能、以至该基因所编码的蛋白的表达量或功能发生变化,可以成为各种疾病的病因。当基因组型单核苷酸多态性与疾病有关时,包含该多态性部位的区域实际上被翻译,有可能对其它基因的表达产生某种影响。当沉默型单核苷酸多态性与疾病有关时,在其单核苷酸多态性的周边存在与疾病有关的其它多态性,该多态性与沉默型单核苷酸多态性连锁时,认为确认到了与疾病的关联。同样,即使是沉默型单核苷酸多态性以外的单核苷酸多态性,当该单核苷酸多态性本身并不是青光眼的直接原因、而是与存在于周边的作为青光眼的真正原因的多态性连锁时,有时也会确认到这些单核苷酸多态性与青光眼的关联。这种情况下,如下所述,通过对本发明的单核苷酸多态性的周边进行再测序,也可发现作为青光眼原因的多态性。但是,无论是否是疾病的真正原因,在任一种情况下,为了预测青光眼的发病风险,均可使用这些单核苷酸多态性。
(含有与青光眼有关的等位基因的核酸分子)
在本发明的一个方式中,提供含有与青光眼有关的单核苷酸多态性的核酸分子、以及具有与含有与青光眼有关的单核苷酸多态性的核酸分子互补的序列的核酸分子。
上述含有与青光眼有关的单核苷酸多态性的核酸分子或具有与该核酸分子互补的序列的核酸分子可以用作判定青光眼发病风险高低的标记。并且,这些核酸分子可以用作用于检测该单核苷酸多态性中的在青光眼患者中高频率确认到的等位基因或其对立等位基因、或者用作确定基因型的探针。当该单核苷酸多态性存在于外显子上或其附近时,上述核酸分子可以用于检测基因转录物。
构成真核生物基因组的核酸分子由双链、即有义链和与有义链互补的反义链构成。即,单核苷酸多态性也存在于有义链和反义链中,检测任一链的单核苷酸多态性均具有相同意义,所以本发明的核酸分子还包括上述所有的链。
含有后述表1~2、表5~25、表26~28和表29~51中记载的任一个单核苷酸多态性的核酸分子、含有存在于根据后述表3~4中记载的连锁不平衡数据等确定的区域或基因上的任意单核苷酸多态性的核酸分子和与上述核酸分子互补的核酸分子均包含在本发明的核酸分子中。
在本发明的一个方式中优选:本发明的核酸分子为含有后述表1~2、表26~28或表52~62所记载的单核苷酸多态性的核酸分子或其互补的核酸分子;并且,当该单核苷酸多态性为gSNP时,本发明的核酸分子为包含下述序列的核酸分子或其互补序列的核酸分子,所述序列为从有义链上游侧的公知单核苷酸多态性的下一个碱基到下游侧的公知单核苷酸多态性的单核苷酸之前的碱基的序列;当该单核苷酸多态性为iSNP、sSNP或cSNP时,本发明的核酸分子为:包含含有该单核苷酸多态性的基因组上的基因全长的核酸分子、包含其互补序列的核酸分子、包含含有该单核苷酸多态性的互补DNA(cDNA)分子或其互补序列的核酸分子;当该单核苷酸多态性为rSNP时,本发明的核酸分子为包含从有义链上游侧的公知单核苷酸多态性的下一个碱基到存在于该单核苷酸多态性所存在的启动子区域的下游的基因全长的核酸分子或包含其互补序列的核酸分子。
本发明中的核酸分子不限于脱氧核糖核酸、核糖核酸或肽核酸,含有它们的混合序列的核酸分子也包含在本发明中。当将核糖核酸用于本发明的核酸分子时,在本发明的核酸分子的序列(包括互补序列)中,胸腺嘧啶可以读作尿嘧啶。另外,在不损及本发明所使用的功能的范围内,根据需要可以对上述核酸分子进行化学修饰。此时的功能是指达到使用核酸分子的目的的功能。
本发明中的核酸分子可以根据本说明书所公开的序列信息、或在数据库中检索本说明书所公开的信息而得到的序列信息,采用公知方法、例如亚磷酰胺法进行合成。还可以使用市售的DNA合成机来合成。另外,本发明的核酸分子可以由含有来源于人的DNA的样品,通过PCR法等公知方法获得;或者,一部分核酸分子可以由含有来源于人的RNA的样品,通过RT-PCR法等公知方法取得。取得核酸分子所必需的引物可以由本领域技术人员根据本说明书所公开的序列信息、或可以从本说明书所公开的数据库的ID检索到的序列信息进行设计。例如使用PCR法时,可以使用具有与目标核酸分子的一部分序列相同的序列的约10~30碱基的引物;采用RT-PCR法时,使用寡脱氧胸苷酸(dT)引物或无规六聚体等进行逆转录反应,制成cDNA,之后利用上述PCR法扩增该cDNA中的目标序列,即可得到。
优选核酸分子为:具有优选16~55碱基、更优选23~27碱基或47~53碱基的长度、且包含上述多态性部位及其周边序列或与其互补的序列的核酸分子。
选择含有与青光眼发病有关的单核苷酸多态性的核酸分子时,就本发明中的核酸分子而言,例如在基于使用一次操作检测50万个核酸分子的微阵列进行1次分析而得到的结果的情况下,优选p值为1×10-3以下的核酸分子,更优选p值为3×10-4以下的核酸分子,进一步优选p值为1×10-4以下的核酸分子,更进一步优选p值为3×10-5以下的核酸分子。当为按照Mantel-Haenszel法等整合分析方法整合多个分析结果而得到的结果时,本发明中的核酸分子优选p值为1×10-2以下的核酸分子,更优选p值为3×10-3以下的核酸分子,进一步优选p值为1×10-3以下的核酸分子,更进一步优选p值为3×10-4以下的核酸分子,又进一步优选p值为1×10-4以下的核酸分子。
作为选择优选的核酸分子的其它方法,可以按照公知的多重性校正方法设定显著水平,再选择优选的核酸分子。例如当基于Bonferroni校正时,可以用p值5×10-2除以检验的反复次数、即作为卡方检验的比较对象的多态性的个数,作为显著水平。可以选择具有低于如此操作而求得的显著水平的单核苷酸多态性的核酸分子作为更优选的核酸分子。此时,可以使用按照Mantel-Haenszel法等整合分析方法整合的p值,使用作为整合分析对象的单核苷酸多态性的个数进行Bonferroni校正。可以使用其它公知的用于多重性校正的方法、例如FDR法或置换法来选择优选的核酸分子。
(与青光眼有关的单核苷酸多态性的检测方法和青光眼发病风险的预测方法)
在本发明的另一方式中,提供一种在含有来自基因组的核酸分子的样品中是否具有在青光眼患者组中频率高的等位基因或基因型的检测方法。作为样品,只要可以提取来自基因组的核酸分子即可,可以是任何样品,例如可以使用血液、白细胞、毛根、毛发、唾液、口腔粘膜细胞、皮肤、通过活体解剖得到的肌肉或脏器等组织等。
如上所述,构成真核生物基因组的核酸分子由彼此互补的有义链和反义链构成,本发明的单核苷酸多态性的等位基因的确定还可以通过检测该多态性部位的有义链或反义链中的任意碱基来进行。
如上所述,在含有核酸分子的样品中是否包含该等位基因或基因型的判定方法可以使用任何方法,例如,使用根据本发明所公开的序列信息设计的各等位基因特异性探针、优选后述本发明的探针进行杂交,通过检测其信号,可以检测各等位基因。此外,对于对立的各等位基因、即某单核苷酸多态性的与疾病关联高的等位基因和关联低的等位基因分别施行不同的标记,之后通过使用使上述对立等位基因与多态性部位杂交的探针、或使用固定有对立的各等位基因的微阵列等的固定化探针,可以检测同一样品中所含的对立的各等位基因。根据上述构成,不仅可以确定样品的等位基因,还可以确定基因型。使用将对立的各等位基因固定化在同一载体上而得到的微阵列等的固定化探针时,还可以按照相同操作进行杂交,形成按照相同操作进行检测的构成。
作为检测本发明的单核苷酸多态性的其它方法,可以使用下述方法。使用探针进行杂交的方法的例子有:Taqman法、Invader((注册商标))法、LightCycler法、细胞周期蛋白探针法、MPSS法、珠粒阵列法等,这些方法均可使用。即使是用于检测同一等位基因的探针,根据检测中使用的方法,其更优选的探针有时也会不同。本发明的单核苷酸多态性的等位基因或基因型的判定并不依赖于检测方法,但优选根据检测方法使用适当的探针。
Taqman法是指通过使用在5’侧结合有荧光物质、在其3’侧结合有猝灭剂的任意长度的寡核苷酸探针来检测基因多态性的方法。探针与具有目标多态性的核酸分子杂交,通过PCR反应剥离5’侧的一部分探针,之后测定荧光物质发出的荧光量,由此判定是否存在多态性。
Invader法是指使用含有与具有多态性的核酸分子的3’侧共有的序列但5’侧的序列完全不同的探针(报道探针)和只具有5’侧的共有序列的探针(侵入探针)检测基因多态性的方法。使上述两根探针与目标核酸分子杂交,之后用核酸酶处理,被切出的报道探针中的一部分与含有荧光物质和猝灭剂的检测用探针杂交,之后用核酸酶处理时,荧光物质游离出来,因此利用该荧光量判定是否具有多态性。
LightCycler法是指通过使含有荧光物质的多态性检测探针和含有猝灭剂的锚定探针与事先用PCR扩增了的具有多态性的核酸分子杂交来检测多态性的方法。对已杂交的DNA缓慢加热,当达到某一定温度时多态性检测探针游离出来,因此通过测定该荧光量来判定是否具有多态性。
细胞周期蛋白探针法是指使DNA序列按照挟持具有与目标核酸分子的多态性部位互补的序列的RNA序列两端的方式结合,之后使用在各DNA端具有荧光物质或猝灭剂的探针(DRD探针)的多态性分析法。使DRD探针与事先通过PCR等扩增了的目标核酸分子杂交,再使RNase作用于该复合体时,荧光色素游离出来,所以通过测定该荧光量来判定是否具有多态性。
MPSS法是指使用编码衔接探针和解码探针进行多态性分析的方法。编码衔接探针是指一种寡DNA,该寡DNA在5’侧具有4碱基的突出末端,紧随其后是限制酶BbvI的识别序列,以及在3’侧具有解码探针所结合的单链序列。而解码探针是指在3’侧含有荧光物质的单链寡DNA,该探针包含4种不同序列,各序列与一个编码衔接探针特异性杂交。事先将具有多态性的核酸分子固定在珠粒上,使含有BbvI识别序列的起始衔接头结合在该核酸分子上,之后用BbvI消化成4碱基突出末端。从突出的4碱基的3’末端起依次与编码衔接探针连接,用特定的解码探针检测已结合的编码衔接探针的序列。
珠粒阵列法是指将等位基因检测用探针和寡核苷酸(地址序列,address sequence)所结合的珠粒组合起来进行基因型判定的方法,上述寡核苷酸特定利用等位基因检测用探针检测的信号在阵列上的位置信息。珠粒阵列法例如有:Golden Gate Assay,其中使用仅固定有Illumina公司的地址序列(23碱基)的珠粒;以及Infinium(注册商标)Assay,其中使用等位基因检测用探针(50碱基)结合在地址序列(30碱基)上的珠粒。在任一种方法中,根据地址序列可以知道:对于任意配置在阵列上的各个珠粒,等位基因检测用探针结合在阵列上的哪个位置上。
Golden Gate Assay方法如下所示。在单核苷酸多态性的检测中使用下述探针:等位基因特异性探针,即与各等位基因特异性杂交的两种探针;以及下游序列识别探针,即与单核苷酸多态性的3’侧的1~20碱基下游的序列特异性杂交的探针。在下游序列识别探针中带有阵列上的位置特定用地址序列。上述3种探针中包含后述通用引物所结合的序列。使3个探针与基因组DNA退火,之后添加DNA聚合酶和连接酶。通过伸长反应和连接反应,生成连接等位基因特异性探针和下游序列识别探针间的空隙的等位基因特异性产物。以该等位基因特异性产物为模板,使用各等位基因特异性的两种荧光标记通用引物和结合在下游序列识别探针上的通用引物进行PCR反应。使被标记的PCR产物经由地址序列与固定在珠粒上的寡核苷酸杂交。通过用共焦激光扫描仪检测珠粒上的荧光,来判定等位基因和基因型。
Infinium Assay方法如下所示。后述Illumina公司的阵列[Illumina公司iSelectTM Genotyping BeadChip]遵照该方法。利用该阵列检测等位基因时存在两种方法。第一种方法中,使用仅3’末端的碱基不同的两种探针(50碱基的等位基因检测用探针、Infinium I型),所述3’末端为检测单核苷酸多态性的部位。事先进行基因组DNA的全基因组扩增,之后利用酶进行片段化。在探针与片段化基因组DNA杂交后,进行等位基因特异性伸长反应,用一种荧光色素标记的多态性部位的一个碱基下游(3’侧)的碱基对应着探针掺入进来。另一种方法中,使用探针内不具有单核苷酸多态性的等位基因特异性序列的一种探针(50碱基的等位基因检测用探针、Infinium II型)。该探针的3’末端形成从多态性部位到其上游一个碱基(5’侧)为止的序列。使探针与片段化基因组DNA杂交,之后通过单核苷酸伸长反应,用两种荧光色素中的其中一种标记的碱基对应着目标单核苷酸多态性部位掺入进来。任一种方法中,均通过用共焦激光扫描仪检测荧光,来判定等位基因和基因型。
需要说明的是,有关上述杂交方法中所用探针的长度或修饰等特性的细节在后面叙述。
此外,作为不进行与探针杂交的方法,例如有PCR-RFLP法、SSCP法、质量分析法和直接测序法。
PCR-RFLP法是指在具有多态性的核酸分子中,由于多态性存在于限制酶的切断部位,所以通过酶消化生成不同的DNA片段,根据其电泳图谱的不同来判定是否存在多态性的方法。利用PCR扩增目标核酸分子,之后用限制酶切断该扩增片段,分析通过电泳生成的片段。被扩增的含有多态性的核酸分子的长度通常为50~10,000碱基对,优选为100~1,000碱基对。
SSCP法是指利用PCR扩增具有多态性的核酸分子,形成单链DNA,之后进行电泳,根据其电泳图谱的不同判定是否存在多态性的方法。利用PCR扩增目标核酸分子,该扩增片段经热或碱处理形成单链DNA。由于该单链DNA形成核苷酸序列特异性的高级结构,所以将这些扩增片段进行电泳时,因其结构的不同,在电泳率上可见差异。用于PCR的引物用放射性同位素或荧光物质标记。所扩增的具有多态性的核酸分子的长度通常为50~10,000碱基对,优选为100~1,000碱基对。
质量分析法是指将高分子用基质和激光等进行离子化,在高电场中加速该离子化的高分子,使其飞入至检测器中,根据其飞行时间的不同等来鉴定质量的方法。将该质量分析法与上述引物延伸法等组合起来检测多态性。具体而言,使用与具有多态性的核酸分子的多态性部位的直至单核苷酸上游的序列相互补的引物、4种双脱氧核苷中的任意一种、以及与其对应的脱氧核糖核酸以外的脱氧核糖核酸,进行单核苷酸的伸长反应,通过测定掺入3’末端的序列不同的核酸产物质量的差异,可以鉴定多态性。
直接测序法是指直接读取具有多态性的核酸分子的核苷酸序列的方法。代表性的方法称作Sanger法(双脱氧法)。使未标记或用放射性同位素或荧光物质标记的引物与目标核酸分子结合,利用未标记或用放射性同位素或荧光物质标记的4种双脱氧核苷使由克列诺(Klenow)酶等引发的伸长反应停止,之后用限制酶进行消化,产生的DNA片段通过电泳进行分离。根据电泳图像,从低分子量的片段开始依次读取3’末端的核苷酸序列,由此确定含有多态性的前后的核苷酸序列。作为其改良法,有一种称作引物延伸法的方法。该方法如下:使用与具有多态性的核酸分子的多态性部位的直至单核苷酸上游的序列互补的引物,进行单核苷酸的伸长反应,读取掺入3’末端的4种双脱氧核苷中任意一种的序列。在该双脱氧核苷的鉴定中有各种方法,例如用不同的荧光物质标记4种核苷酸,通过电泳进行分离和鉴定。此外,还采用下述方法,即、将在伸长反应时所生成的焦磷酸变换成ATP,利用萤光素酶的发光来鉴定该ATP的方法。伸长反应中使用的引物的长度通常为10~300碱基对,优选为15~25碱基对。
本发明中,杂交是指具有某序列的核酸分子和与该核酸分子的至少一部分互补的核酸分子根据彼此互补的核苷酸序列经由氢键进行缔合。与原始核酸分子缔合的互补的核酸分子的种类可以相同,也可以不同,构成上述核酸分子的核酸可以是脱氧核糖核酸、核糖核酸或肽核酸。上述核酸分子中,当谈到核糖核酸时,在核酸分子的序列(包括互补序列)中胸腺嘧啶可以被读作尿嘧啶。
在本发明中,严格条件是指一种核酸分子与具有某序列的核酸分子特异性杂交的条件,上述前一种核酸分子具有与后一种核酸分子的部分序列互补的序列(Fred M.Ausuble等,Current Protocols inMolecular Biology,第2.10.1-2.10.16、John Wiley和Sons,Inc)。上述条件的具体例子有:温度优选比具有某序列的核酸分子和与该核酸分子杂交的互补核酸分子的复合体的熔解温度(Tm)低约5℃~约30℃、更优选低约10℃~约25℃;0.01~6倍浓度的SSC(氯化钠、枸橼酸钠混合溶液)、SSPE(氯化钠、磷酸二氢钠和EDTA混合溶液)或MES(2-(N-吗啉基)乙磺酸和氯化四甲基铵混合溶液)缓冲液等杂交用反应溶液;以及pH6~8的氢离子浓度等条件。例如,在将25bp的DNA探针固定化得到的固定化探针的情况下,严格条件的例子有:在1倍浓度的MES缓冲液中(氢离子浓度为6.5~6.7)于49℃下杂交,之后用6倍浓度的SSC(氢离子浓度为8.0)于25℃下清洗,接着用0.6倍浓度的SSC(氢离子浓度为8.0)于45℃下清洗等条件。
在本发明中,等位基因特异性(或对等位基因特异)是指在来自包含该多态性部位的基因组的序列中或所制备的包含该多态性部位的核酸分子中含有该等位基因;或者,某核酸分子在该多态性部位与具有包含该等位基因的序列的核酸分子在严格条件下特异性杂交、即按照可以识别与该等位基因对立的等位基因的方式杂交。
本发明所公开的、包含与青光眼发病有关的单核苷酸多态性的61碱基长度的核酸序列包含仅中央(即第31位)的碱基不同的两组核苷酸序列组(SEQ ID NO为奇数号和偶数号的组),该第31位的碱基为多态性部位。多态性部位的高风险等位基因记载在后述的表1~2或表52~63中。关于上述任意的单核苷酸多态性,当对存在在青光眼患者中高频率存在的等位基因进行判定时,通过检测样品中的高风险等位基因,可以判定存在在青光眼患者中高频率存在的等位基因。
对于上述鉴定的任意的与青光眼发病有关的单核苷酸多态性,检测是否存在一个样品中所含的对立的各等位基因,可以确定基因型。即,当只检测到某等位基因时,基因型为该等位基因的纯合子;当检测到两个等位基因时,基因型为具有该两个等位基因的杂合子。对于上述单核苷酸多态性中的至少一个,通过检测基因型,可以判定样品中是否存在在青光眼患者组中较在非患者组中高频率确认到的基因型。即,关于上述单核苷酸多态性,当高风险等位基因符合显性遗传模型时,高风险等位基因的纯合子或杂合子是在青光眼患者组中较在非患者组中高频率确认到的基因型;当高风险等位基因符合隐性遗传模型时,高风险等位基因的纯合子是在青光眼患者组中较在非患者组中高频率确认到的基因型。从减小判定错误的角度考虑,还优选按照相同操作测定对立的各等位基因。
如此地进行样品分析,当样品中存在在青光眼患者组中较在非患者组中高频率确认到的等位基因或基因型时,预测在提供该样品的当时未患有青光眼者的青光眼发病风险高,或者,判定必需进行视野检查等青光眼的精密检查,提供该样品的青光眼疑似病例应该被诊断为青光眼的几率高。
在本发明的与青光眼有关的单核苷酸多态性的检测方法和青光眼发病风险的预测方法中,用于检测的单核苷酸多态性为存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性,所述核苷酸序列为选自SEQ ID NO:203~514所示的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列;
更优选为存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性,所述核苷酸序列为选自SEQ ID NO:203~238所示的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列;
进一步优选为存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性,所述核苷酸序列为选自下述含有单核苷酸多态性的核苷酸序列组的至少一个核苷酸序列或其互补序列。(其中,如上所述,在a~r所示的SEQ ID NO组中,各序列组对应于一个单核苷酸多态性,各核苷酸序列为在第31位碱基中含有上述单核苷酸多态性的相互对立的等位基因的核苷酸序列)
a:SEQ ID NO:203和/或SEQ ID NO:204、
b:SEQ ID NO:205和/或SEQ ID NO:206、
c:SEQ ID NO:207和/或SEQ ID NO:208、
d:SEQ ID NO:209和/或SEQ ID NO:210、
e:SEQ ID NO:211和/或SEQ ID NO:212、
f:SEQ ID NO:213和/或SEQ ID NO:214、
g:SEQ ID NO:215和/或SEQ ID NO:216、
h:SEQ ID NO:217和/或SEQ ID NO:218、
i:SEQ ID NO:219和/或SEQ ID NO:220、
j:SEQ ID NO:221和/或SEQ ID NO:222、
k:SEQ ID NO:223和/或SEQ ID NO:224、
l:SEQ ID NO:225和/或SEQ ID NO:226、
m:SEQ ID NO:227和/或SEQ ID NO:228、
n:SEQ ID NO:229和/或SEQ ID NO:230、
o:SEQ ID NO:231和/或SEQ ID NO:232、
p:SEQ ID NO:233和/或SEQ ID NO:234、
q:SEQ ID NO:235和/或SEQ ID NO:236、以及
r:SEQ ID NO:237和/或SEQ ID NO:238
使用上述任一个单核苷酸多态性时,其中优选使用存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的等位基因,所述核苷酸序列为选自下述含有单核苷酸多态性的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列。
SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:234、SEQ IDNO:235和SEQ ID NO:238
需要说明的是,上述序列为在各自的多态性部位含有高风险等位基因的序列。
并且,通过使用一个样品,将两个以上本发明的与青光眼有关的等位基因或基因型组合起来进行检测,还可以提高将来的青光眼发病风险的判定精度。
就组合的单核苷酸多态性而言,只要是本发明的单核苷酸多态性即可使用,但优选为p值低的单核苷酸多态性,更优选为下述单核苷酸多态性,即、对于按照上述Mantel-Haenszel法等整合分析法将两次分析得到的结果整合而得到的p值,即使在Bonferroni校正水平下也判断为显著的单核苷酸多态性。从另一个角度考虑,还优选使用:通过后述的逻辑回归分析,确认有助于提高通过组合得到的风险预测精度的单核苷酸多态性。另一方面,由于处于上述连锁不平衡状态的单核苷酸多态性表现出相同的行为,所以当将多个处于连锁不平衡状态的单核苷酸多态性组合起来时,有时必需认真评价基于相同区域的青光眼风险。将本发明的单核苷酸多态性组合起来进行疾病的风险预测的情况下、即均衡评价所有风险的情况下,当包含多个处于上述连锁不平衡状态的单核苷酸多态性时,还优选只使用处于该连锁不平衡状态的单核苷酸多态性中的任一个进行预测。
根据本发明的任意两个以上的单核苷酸多态性的组合进行发病风险预测时,可以使用通过逻辑回归分析求得的回归式预测青光眼的发病风险。即,以上述任意两个以上的单核苷酸多态性分别作为独立变数∏(一方的等位基因的纯合子=0、杂合子=1、对立等位基因的纯合子=2),通过逻辑回归分析求出回归式。在各样品中,将对应于各单核苷酸多态性的值代入该式,计算从属变数Φ。当从属变数Φ大于一定的阈值(例如0.5)时,可以判断该样品的提供者存在发病风险。
在本发明的与青光眼有关的单核苷酸多态性的检测方法和青光眼发病风险的预测方法中,将任意两个以上的单核苷酸多态性组合时,用于检测的单核苷酸多态性优选为存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性,所述核苷酸序列为选自SEQ ID NO:203~514所示的核苷酸序列的、含有两个以上不同的单核苷酸多态性的核苷酸序列或其互补序列;
更优选为存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性,所述核苷酸序列为选自SEQ ID NO:203~238所示的核苷酸序列的、含有两个以上不同的单核苷酸多态性的核苷酸序列或其互补序列;
进一步优选为存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性,所述核苷酸序列为选自下述含有单核苷酸多态性的核苷酸序列组的、含有两个以上不同的单核苷酸多态性的核苷酸序列或其互补序列;(其中,如上所述,在a~r所示的SEQ ID NO组中,各序列组对应于一个单核苷酸多态性,各核苷酸序列为在第31位碱基中含有上述单核苷酸多态性的相互对立的等位基因的核苷酸序列)
a:SEQ ID NO:203和/或SEQ ID NO:204、
b:SEQ ID NO:205和/或SEQ ID NO:206、
c:SEQ ID NO:207和/或SEQ ID NO:208、
d:SEQ ID NO:209和/或SEQ ID NO:210、
e:SEQ ID NO:211和/或SEQ ID NO:212、
f:SEQ ID NO:213和/或SEQ ID NO:214、
g:SEQ ID NO:215和/或SEQ ID NO:216、
h:SEQ ID NO:217和/或SEQ ID NO:218、
i:SEQ ID NO:219和/或SEQ ID NO:220、
j:SEQ ID NO:221和/或SEQ ID NO:222、
k:SEQ ID NO:223和/或SEQ ID NO:224、
l:SEQ ID NO:225和/或SEQ ID NO:226、
m:SEQ ID NO:227和/或SEQ ID NO:228、
n:SEQ ID NO:229和/或SEQ ID NO:230、
o:SEQ ID NO:231和/或SEQ ID NO:232、
p:SEQ ID NO:233和/或SEQ ID NO:234、
q:SEQ ID NO:235和/或SEQ ID NO:236、以及
r:SEQ ID NO:237和/或SEQ ID NO:238
更进一步优选为存在于各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性,所述核苷酸序列为选自上述含有单核苷酸多态性的核苷酸序列组的、含有10个以上不同的单核苷酸多态性的核苷酸序列或其互补序列;
又更进一步优选为存在于各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性,所述核苷酸序列为选自上述含有单核苷酸多态性的核苷酸序列组的、含有完全不同的单核苷酸多态性的核苷酸序列或其互补序列。
另外,用于组合的单核苷酸多态性优选使用未处于连锁不平衡状态的单核苷酸多态性,从这个角度考虑,在上述组合的所有方式中,
在属于由:
a:SEQ ID NO:203和/或SEQ ID NO:204以及
b:SEQ ID NO:205和/或SEQ ID NO:206
组成的组的核苷酸序列或其互补序列中,以存在于各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性所组成的组作为组1的单核苷酸多态性;
在属于由:
c:SEQ ID NO:207和/或SEQ ID NO:208以及
d:SEQ ID NO:209和/或SEQ ID NO:210
所组成的组的核苷酸序列或其互补序列中,以存在于各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性所组成的组作为组2的单核苷酸多态性;
在属于由:
j:SEQ ID NO:221和/或SEQ ID NO:222、
k:SEQ ID NO:223和/或SEQ ID NO:224以及
l:SEQ ID NO:225和/或SEQ ID NO:226
所组成的组的核苷酸序列或其互补序列中,以存在于各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性所组成的组为组3的单核苷酸多态性;
在属于由:
o:SEQ ID NO:231和/或SEQ ID NO:232、
p:SEQ ID NO:233和/或SEQ ID NO:234、
q:SEQ ID NO:235和/或SEQ ID NO:236以及
r:SEQ ID NO:237和/或SEQ ID NO:238
所组成的组的核苷酸序列或其互补序列中,以存在于各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性构成的组为组4的单核苷酸多态性,
当使用属于组1的单核苷酸多态性时,优选使用组1中的任一个单核苷酸多态性;
当使用属于组2的单核苷酸多态性时,优选使用组2中的任一个单核苷酸多态性;
当使用属于组3的单核苷酸多态性时,优选使用组3中的任一个单核苷酸多态性;和/或
当使用属于组4的单核苷酸多态性时,优选使用组4中的任一个单核苷酸多态性。
并且,在上述组合的所有方式中,优选存在于各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的等位基因,所述核苷酸序列为选自下述含有单核苷酸多态性的核苷酸序列的、含有两个以上不同的单核苷酸多态性的核苷酸序列或其互补序列。
SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ IDNO:218、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:235和SEQ ID NO:238
需要说明的是,上述核苷酸序列为在各自的多态性部位具有高风险等位基因的核苷酸序列。
(可以检测与青光眼有关的等位基因的探针)
在本发明的另一方式中,提供可以检测与青光眼有关的等位基因的等位基因特异性核酸分子或探针(以下,记作探针)、以及使用上述探针检测与青光眼有关的等位基因或基因型的方法。
探针只要是能够在严格条件下与本发明的与青光眼有关的单核苷酸多态性的多态性部位的等位基因特异性序列杂交的探针即可,可以使用任何探针。多态性部位的等位基因的确定还可以通过检测基因组的有义链或反义链的多态性部位来进行,所以本发明的探针包含有义链的等位基因特异性序列的互补序列和与反义链的等位基因特异性序列互补的序列、即包含有义链的等位基因特异性序列中的任一个。本发明的探针还可用于检测包含本发明的单核苷酸多态性的cDNA或mRNA。用于检测cDNA或mRNA时,该单核苷酸多态性使用存在于外显子中或其邻近的单核苷酸多态性。
可以检测后述表1~2、表5~25、表26~28、表29~51或表52~62中记载的单核苷酸多态性的各等位基因或其互补链的探针、以及可以特异性检测后述表3~4或表63~70中记载的存在于青光眼相关区域的任意的单核苷酸多态性的各等位基因或其互补链的探针均包含在本发明的探针中。就本发明的探针而言,例如基于使用微阵列进行1次分析而得到的结果时,其中所述微阵列通过一次操作检测可以特异性检测50万个单核苷酸多态性的各等位基因或其互补链的探针,本发明的探针优选为可以特异性检测p值为1×10-3以下的单核苷酸多态性的各等位基因或其互补链的探针;更优选为可以特异性检测p值为3×10-4以下的单核苷酸多态性的各等位基因或其互补链的探针;进一步优选为可以特异性检测p值为1×10-4以下的单核苷酸多态性的各等位基因或其互补链的探针;更进一步优选为可以特异性检测p值为3×10-5以下的单核苷酸多态性的各等位基因或其互补链的探针。当为按照Mantel-Haenszel法等整合分析方法整合多个分析结果而得到的结果时,本发明的探针优选为可以特异性检测p值为1×10-2以下的单核苷酸多态性的各等位基因或其互补链的探针;更优选为可以特异性检测p值为3×10-3以下的单核苷酸多态性的各等位基因或其互补链的探针;进一步优选为可以特异性检测p值为1×10-3以下的单核苷酸多态性的各等位基因或其互补链的探针;更进一步优选为可以特异性检测p值为3×10-4以下的单核苷酸多态性的各等位基因或其互补链的探针;又更进一步优选为可以特异性检测p值为1×10-4以下的单核苷酸多态性的各等位基因或其互补链的探针。
本发明中的探针优选含有等位基因特异性序列或其互补链,进一步优选:在本发明的探针中,有助于等位基因特异性杂交的序列仅包含等位基因特异性序列或其互补链。在本发明的探针中,在严格条件下能够与等位基因特异性序列杂交的范围内,可以在末端添加间隔区或为了稳定化等目的、且不来自该序列的任意碱基数目的序列。所添加的序列优选为保持发夹结构等三维结构的序列。
可以对探针实施用于检测的任意标记。对探针实施的标记可以使用通常所使用的任何标记,但通常使用FITC或Cy3等荧光标记、生物素、或碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶等酶标记等。使用生物素标记时,事先对与生物素特异性结合的链霉亲和素进一步实施可检测的标记,将该标记链霉亲和素用作二次标记。还可以使用标记抗生物素抗体来代替标记链霉亲和素。对探针实施标记的方法可以采用公知的任何方法,该方法为本领域技术人员所周知。还可以在探针中添加作为上述间隔区的任意序列,并对间隔区实施标记。探针的标记化用试剂、标记链霉亲和素、标记抗生物素抗体等以试剂的形式出售,可以采购。
本发明中的探针只要能够与具有目标等位基因的核酸分子特异性杂交即可,不仅包含脱氧核糖核酸、核糖核酸或肽核酸、甚至还包含它们的混合序列的探针也包含在本发明中。其中,在本发明的探针中使用含有核糖核酸的探针时,在本发明探针的序列(包括互补序列)中,胸腺嘧啶可以被读作尿嘧啶。根据需要还可以对本发明中的探针进行化学修饰,只要其能够在严格条件下与具有目标等位基因的核酸分子进行特异性杂交即可。实施化学标记的方法可以使用公知的任何方法。
检测用探针既可以在溶液状态下与样品反应,之后用公知的方法进行检测,也可以事先固定在载体上。上述探针还可以取得固定化探针、即所谓的微阵列形式,其如下得到:将多个至数十万个不同单核苷酸多态性各自的等位基因所对应的探针事先固定在固体载体上的确定位置上,每个单核苷酸多态性对应一个至十几个探针,之后使样品与其反应,扫描由杂交的探针产生的信号,并用计算机进行分析。取得固定化探针形式时,进行固定化的探针的最大数受探针的固定化密度和固定化部位的面积所限制。
取得上述固定化探针形式时,通过如下方法可以检测来自被标记的具有目标等位基因的核酸分子的固定层上的信号:事先按照公知的方法标记样品中的核酸分子,再使其与固定化的本发明的非标记探针结合,或者,使具有应该检测到等位基因的核酸分子与固定化的本发明的非标记探针结合,之后按照公知的方法进行标记。
固定化可以按照公知的任何方法进行,例如可以采用ォリゴプリント(syhthetic oligoprint)、斑点光刻法等方法。对载体的材质没有限定,可以使用通常所用的材质、例如聚碳酸酯或聚苯乙烯等高分子、玻璃、硅晶体等。为了提高核酸的粘合力,可以在固定化之前对载体事先实施阳离子化等包被。另外,为了防止非特异性核酸吸附到载体上,还可以在固定化之后用公知的封闭剂进行封闭。上述封闭剂中,只要是可以抑制非特异性核酸在载体上吸附的封闭剂均可使用,例如可以使用:鲑鱼精子DNA、Denhardt溶液、从人胎盘中提取的Cot-I DNA、十二烷基硫酸钠等阴离子性表面活性剂、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯等非离子性表面活性剂等。
将探针固定化时,通过将对立的各等位基因特异性探针固定在同一载体上,还可以形成按照相同操作检测一个样品中所含的对立的各等位基因的构成。在上述构成中,不仅可以确定样品的等位基因,还可以确定基因型。
用于检测等位基因的探针优选为:优选具有16~55碱基、更优选23~27碱基或47~53碱基、进一步优选具有上述多态性部位及其前后各计25碱基的长度,且含有上述多态性部位及其周边序列或与其互补的序列的探针;具有上述多态性部位及其5’上游侧、优选具有49碱基的序列(50碱基的序列),且含有上述多态性部位及其周边序列或与其互补的序列的探针;或者,具有上述多态性部位的5’上游侧50碱基的序列,且含有与上述多态性部位邻近的序列或与其互补的序列的探针。
用于检测等位基因的、进一步优选的探针为:
1)可以特异性检测该单核苷酸多态性的等位基因的探针,该探针具有上述多态性部位及其前后各12碱基的序列、即25碱基的长度,并且包含上述多态性部位及其周边序列或与其互补的序列;或者
2a)可以特异性检测该单核苷酸多态性的等位基因的探针,该探针具有上述多态性部位及其5’上游侧49碱基的序列(50碱基的序列),并且包含含有上述多态性部位的序列或与其互补的序列;或者
2b)可以特异性检测该单核苷酸多态性的等位基因的探针,该探针具有上述多态性部位的5’上游侧50碱基的序列,并且包含与上述多态性部位邻近的序列或与其互补的序列。
在本发明的与青光眼有关的单核苷酸多态性的检测方法和青光眼发病风险的预测方法中,用于检测的探针为:包含存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的探针,所述核苷酸序列为选自SEQ ID NO:203~514所示的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列、或它们的部分序列;和/或包含核苷酸序列的探针,所述核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:515~694所示的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列;
更优选为:包含存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的探针,所述核苷酸序列为选自SEQ ID NO:203~238所示的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列、或它们的部分序列;和/或包含核苷酸序列的探针,所述核苷酸序列包含选自SEQ IDNO:515~535所示的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列;
进一步优选为:包含存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的探针,所述核苷酸序列为选自下述组A的至少一个核苷酸序列或其互补序列、或它们的部分序列,所述组A由包含单核苷酸多态性的核苷酸序列组a~r构成;和/或包含序列的探针,所述序列包含选自组B的至少一个核苷酸序列或核苷酸序列组或它们的互补序列,所述组B由aa~rr的核苷酸序列或核苷酸序列组构成。
(其中,在a~r所示的SEQ ID NO组中,各序列组对应于一个单核苷酸多态性,各核苷酸序列为在第31位碱基中含有上述单核苷酸多态性的相互对立的等位基因的核苷酸序列;
在aa~rr所示的SEQ ID NO或SEQ ID NO组中,各核苷酸序列或核苷酸序列组为用于检测一个单核苷酸多态性的探针的序列或探针的序列组;
a和aa、b和bb、c和cc、d和dd、e和ee、f和ff、g和gg、h和hh、i和ii、j和jj、k和kk、l和ll、m和mm、n和nn、o和oo、p和pp、q和qq、以及、r和rr分别对应于相同的单核苷酸多态性)
组A
a:SEQ ID NO:203和/或SEQ ID NO:204、
b:SEQ ID NO:205和/或SEQ ID NO:206、
c:SEQ ID NO:207和/或SEQ ID NO:208、
d:SEQ ID NO:209和/或SEQ ID NO:210、
e:SEQ ID NO:211和/或SEQ ID NO:212、
f:SEQ ID NO:213和/或SEQ ID NO:214、
g:SEQ ID NO:215和/或SEQ ID NO:216、
h:SEQ ID NO:217和/或SEQ ID NO:218、
i:SEQ ID NO:219和/或SEQ ID NO:220、
j:SEQ ID NO:221和/或SEQ ID NO:222、
k:SEQ ID NO:223和/或SEQ ID NO:224、
l:SEQ ID NO:225和/或SEQ ID NO:226、
m:SEQ ID NO:227和/或SEQ ID NO:228、
n:SEQ ID NO:229和/或SEQ ID NO:230、
o:SEQ ID NO:231和/或SEQ ID NO:232、
p:SEQ ID NO:233和/或SEQ ID NO:234、
q:SEQ ID NO:235和/或SEQ ID NO:236、以及
r:SEQ ID NO:237和/或SEQ ID NO:238
组B
aa:SEQ ID NO:515和/或SEQ ID NO:533、
bb:SEQ ID NO:516、
cc;SEQ ID NO:517、
dd:SEQ ID NO:518和/或SEQ ID NO:534、
ee:SEQ ID NO:519、
ff:SEQ ID NO:520、
gg:SEQ ID NO:521、
hh:SEQ ID NO:522、
ii:SEQ ID NO:523、
jj:SEQ ID NO:524、
kk:SEQ ID NO:525、
ll:SEQ ID NO:526、
mm:SEQ ID NO:527、
nn:SEQ ID NO:528、
oo:SEQ ID NO:529、
pp:SEQ ID NO:530和/或SEQ ID NO:535、
qq:SEQ ID NO:531、以及
rr:SEQ ID NO:532
使用上述任一个单核苷酸多态性时,其中,在组A中,优选使用包含存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的等位基因的探针,所述核苷酸序列为选自下述包含单核苷酸多态性的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列、或它们的部分序列;SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEO ID NO:229、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:234、SEQ IDNO:235和SEQ ID NO:238
在组B中,优选包含核苷酸序列的探针,所述核苷酸序列包含选自下述核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列。
SEQ ID NO:533、SEQ ID NO:516、SEQ ID NO:517、SEQ ID NO:518、SEQ ID NO:519、SEQ ID NO:520、SEQ ID NO:521、SEQ IDNO:522、SEQ ID NO:523、SEQ ID NO:524、SEQ ID NO:525、SEQ ID NO:526、SEQ ID NO:527、SEQ ID NO:528、SEQ ID NO:529、SEQ ID NO:535、SEQ ID NO:531和SEQ ID NO:532
需要说明的是,上述核苷酸序列是用于检测高风险等位基因的探针所对应的序列。
在本发明的与青光眼有关的单核苷酸多态性的检测方法和青光眼发病风险的预测方法中,在将两个以上任意的单核苷酸多态性组合的情况下,用于检测的探针优选为:包含存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的探针,所述核苷酸序列包含选自SEQ IDNO:203~514所示的核苷酸序列的、含单核苷酸多态性的核苷酸序列或其互补序列、或它们的部分序列;和/或包含核苷酸序列的探针,所述核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:515~694所示的核苷酸序列的核苷酸序列或其互补序列,该探针对应于其中两个以上不同的单核苷酸多态性;
更优选为:包含存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的探针,所述核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:203~238所示的核苷酸序列的、含单核苷酸多态性的核苷酸序列或其互补序列、或它们的部分序列;和/或包含核苷酸序列的探针,所述核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:515~535所示的核苷酸序列的核苷酸序列或其互补序列,该探针对应于其中两个以上不同的单核苷酸多态性;
进一步优选为:包含存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的探针,所述核苷酸序列包含选自下述组A的、含单核苷酸多态性的核苷酸序列或其互补序列、或它们的部分序列,所述组A由包含单核苷酸多态性的核苷酸序列组a~r构成;和/或包含序列的探针,所述序列包含选自组B的、两个以上不同的核苷酸序列或核苷酸序列组或它们的互补序列,所述组B由aa~rr的核苷酸序列或核苷酸序列组构成;
(其中,在a~r所示的SEQ ID NO组中,各序列组对应于一个单核苷酸多态性,各核苷酸序列为在第31位碱基中包含上述单核苷酸多态性的相互对立的等位基因的核苷酸序列;
在aa~rr所示的SEQ ID NO或SEQ ID NO组中,各核苷酸序列或核苷酸序列组为用于检测一个单核苷酸多态性的探针的序列或探针的序列组;
a和aa、b和bb、c和cc、d和dd、e和ee、f和ff、g和gg、h和hh、i和ii、j和jj、k和kk、l和ll、m和mm、n和nn、o和oo、p和pp、q和qq、以及r和rr分别对应于相同的单核苷酸多态性)
组A
a:SEQ ID NO:203和/或SEQ ID NO:204、
b:SEQ ID NO:205和/或SEQ ID NO:206、
c:SEQ ID NO:207和/或SEQ ID NO:208、
d:SEQ ID NO:209和/或SEQ ID NO:210、
e:SEQ ID NO:211和/或SEQ ID NO:212、
f:SEQ ID NO:213和/或SEQ ID NO:214、
g:SEQ ID NO:215和/或SEQ ID NO:216、
h:SEQ ID NO:217和/或SEQ ID NO:218、
i:SEQ ID NO:219和/或SEQ ID NO:220、
j:SEQ ID NO:221和/或SEQ ID NO:222、
k:SEQ ID NO:223和/或SEQ ID NO:224、
l:SEQ ID NO:225和/或SEQ ID NO:226、
m:SEQ ID NO:227和/或SEQ ID NO:228、
n:SEQ ID NO:229和/或SEQ ID NO:230、
o:SEQ ID NO:231和/或SEQ ID NO:232、
p:SEQ ID NO:233和/或SEQ ID NO:234、
q:SEQ ID NO:235和/或SEQ ID NO:236、以及
r:SEQ ID NO:237和/或SEQ ID NO:238
组B
aa:SEQ ID NO:515和/或SEQ ID NO:533、
bb:SEQ ID NO:516、
cc:SEQ ID NO:517、
dd:SEQ ID NO:518和/或SEQ ID NO:534、
ee:SEQ ID NO:519、
ff:SEQ ID NO:520、
gg:SEQ ID NO:521、
hh:SEQ ID NO:522、
ii:SEQ ID NO:523、
jj:SEQ ID NO:524、
kk:SEQ ID NO:525、
ll:SEQ ID NO:526、
mm:SEQ ID NO:527、
nn:SEQ ID NO:528、
oo:SEQ ID NO:529、
pp:SEQ ID NO:530和/或SEQ ID NO:535、
qq:SEQ ID NO:531、以及
rr:SEQ ID NO:532
更进一步优选为:包含存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的探针,所述核苷酸序列包含选自组A的、含单核苷酸多态性的核苷酸序列或其互补序列、或它们的部分序列,所述组A由上述包含单核苷酸多态性的核苷酸序列组构成;和/或包含核苷酸序列的探针,所述核苷酸序列包含选自由上述核苷酸序列组构成的组B的核苷酸序列或其互补序列,该探针对应于其中10个以上不同的单核苷酸多态性;
又更进一步优选为:包含存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的探针,所述核苷酸序列包含选自组A的、含单核苷酸多态性的核苷酸序列或其互补序列、或它们的部分序列,所述组A由上述包含单核苷酸多态性的核苷酸序列组构成;和/或包含核苷酸序列的探针,所述核苷酸序列包含选自由上述核苷酸序列组构成的组B的核苷酸序列或其互补序列,该探针对应于其中所有不同的单核苷酸多态性。
另外,用于组合的单核苷酸多态性优选使用未处于连锁不平衡状态的单核苷酸多态性,从这个角度考虑,在上述组合的所有方式中,关于上述组A,在包含属于:
a:SEQ ID NO:203和/或SEQ ID NO:204、以及
b:SEQ ID NO:205和/或SEQ ID NO:206
所组成的组的核苷酸序列或其互补序列或它们的部分序列的核苷酸序列中,以包含存在于各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的核苷酸序列所组成的组作为组1的核苷酸序列,
在包含属于:
c:SEQ ID NO:207和/或SEQ ID NO:208、以及
d:SEQ ID NO:209和/或SEQ ID NO:210
所组成的组的核苷酸序列或其互补序列或它们的部分序列的核苷酸序列中,以包含存在于各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的核苷酸序列所组成的组作为组2的核苷酸序列,
在包含属于:
j:SEQ ID NO:221和/或SEQ ID NO:222、
k:SEQ ID NO:223和/或SEQ ID NO:224、以及
l:SEQ ID NO:225和/或SEQ ID NO:226
所组成的组的核苷酸序列或其互补序列或它们的部分序列的核苷酸序列中,以包含存在于各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的核苷酸序列所组成的组作为组3的核苷酸序列,
在包含属于:
o:SEQ ID NO:231和/或SEQ ID NO:232、
p:SEQ ID NO:233和/或SEQ ID NO:234、
q:SEQ ID NO:235和/或SEQ ID NO:236、以及
r:SEQ ID NO:237和/或SEQ ID NO:238
所组成的组的核苷酸序列或其互补序列或它们的部分序列的核苷酸序列中,以包含存在于各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的核苷酸序列所组成的组作为组4的核苷酸序列,
关于上述组B,以由包含属于下述组的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列构成的组作为组1的核苷酸序列,
aa:SEQ ID NO:515和/或SEQ ID NO:533、以及
bb:SEQ ID NO:516
以由包含属于下述组的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列构成的组作为组2的核苷酸序列,
cc:SEQ ID NO:517、以及
dd:SEQ ID NO:518和/或SEQ ID NO:534
以由包含属于下述组的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列构成的组作为组3的核苷酸序列,
jj:SEQ ID NO:524、
kk:SEQ ID NO:525、以及
ll:SEQ ID NO:526
以由包含属于下述组的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列构成的组作为组4的核苷酸序列,
oo:SEQ ID NO:529、
pp:SEQ ID NO:530和/或SEQ ID NO:535、
qq:SEQ ID NO:531、以及
rr:SEQ ID NO:532
使用属于组1的核苷酸序列时,优选使用包含组1中的任一个核苷酸序列的探针;
使用属于组2的核苷酸序列时,优选使用包含组2中的任一个核苷酸序列的探针;
使用属于组3的核苷酸序列时,优选使用包含组3中的任一个核苷酸序列的探针;和/或
使用属于组4的核苷酸序列时,优选使用包含组4中的任一个核苷酸序列的探针。
并且,在上述组合的所有方式中,在组A中,优选包含存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的等位基因的探针,所述核苷酸序列包括:选自下述包含单核苷酸多态性的核苷酸序列的、包含单核苷酸多态性的核苷酸序列或其互补序列、或它们的部分序列;
SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:234、SEQ IDNO:235和SEQ ID NO:238
在组B中,优选由包含选自下述核苷酸序列的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列构成的探针。
SEQ ID NO:533、SEQ ID NO:516、SEQ ID NO:517、SEQ ID NO:518、SEQ ID NO:519、SEQ ID NO:520、SEQ ID NO:521、SEQ ID NO:522、SEQ ID NO:523、SEQ ID NO:524、SEQ ID NO:525、SEQ ID NO:526、SEQ ID NO:527、SEQ ID NO:528、SEQ ID NO:529、SEQ ID NO:535、SEQ IDNO:531和SEQ ID NO:532
需要说明的是,上述核苷酸序列是用于检测高风险等位基因的探针所对应的序列。
在等位基因的检测中使用Taqman法时,探针通常优选具有10~300碱基的长度,且包含上述多态性部位及其周边序列或与其互补的序列,并且含有荧光物质和消光物质。探针更优选具有20~60碱基的长度,且包含上述多态性部位及其周边序列或与其互补的序列,并且含有荧光物质和消光物质。
在等位基因的检测中使用Invader法时,探针包含:虽然具有上述多态性部位的3’侧的共有序列但5’侧的序列完全不同的探针(报道探针);和只具有5’侧的共有序列的探针(侵入探针)。上述探针通常优选具有10~300碱基的长度,更优选具有20~60碱基的长度。
在等位基因的检测中使用LightCycler法时,探针通常优选具有10~300碱基的长度,且包含上述多态性部位及其周边序列或与其互补的序列,并且含有荧光物质和消光物质。探针更优选具有20~60碱基的长度,且包含上述多态性部位及其周边序列或与其互补的序列,并且含有荧光物质和消光物质。
在等位基因的检测中使用细胞周期蛋白探针法时,探针为:使DNA序列按照挟持具有上述多态性部位及其周边序列或与其互补的序列的RNA序列的两端的方式结合,在各DNA端具有荧光物质或猝灭剂。上述探针通常优选具有10~300碱基的长度,且包含上述多态性部位及其周边序列或与其互补的序列。探针更优选具有20~60碱基的长度,且包含上述多态性部位及其周边序列或与其互补的序列。
在等位基因的检测中使用MPSS法时,探针为:具有单链序列的寡DNA(编码衔接探针),所述单链序列在5’侧具有4碱基的突出末端,紧随其后是限制酶BbvI的识别序列,在3’侧结合有解码探针;以及在3’侧含有荧光物质的单链寡DNA;包含4种不同的序列,各序列与一个编码衔接探针特异性杂交的寡DNA(解码探针)。使DNA序列按照挟持具有上述多态性部位及其周边序列或与其互补的序列的RNA序列两端的方式结合,在各DNA端含有荧光物质或猝灭剂。编码衔接探针的长度通常优选为10~300碱基对,更优选为15~40碱基对。解码探针的长度通常优选为10~300碱基对,更优选为5~30碱基对。
(用于检测与青光眼有关的等位基因的试剂盒)
在本发明的另一方式中,提供用于检测与青光眼有关的单核苷酸多态性的试剂盒。
只要是能够在样品中的核酸分子中检测出本发明所公开的与青光眼有关的任一个单核苷酸多态性的等位基因或基因型的试剂盒,均包括在本发明的试剂盒(或风险预测用组合物)中。如上所述,本发明的试剂盒可以是检测单核苷酸多态性的有义链或反义链的碱基的试剂盒,也可以是检测上述两者的试剂盒。关于本发明的试剂盒,例如在基于使用微阵列通过1次分析而得到的结果时,所述微阵列是指检测与青光眼有关的等位基因或基因型的试剂盒在1次操作中检测50万个单核苷酸多态性的微阵列,本发明的试剂盒优选为检测后述表1~2中记载的p值为1×10-4以下的单核苷酸多态性的与青光眼有关的等位基因或基因型的试剂盒;更优选为检测p值为3×10-4以下的单核苷酸多态性的与青光眼有关的等位基因或基因型的试剂盒;进一步优选为检测p值为1×10-4以下的单核苷酸多态性的与青光眼有关的等位基因或基因型的试剂盒;更进一步优选为检测p值为3×10-5以下的单核苷酸多态性的与青光眼有关的等位基因或基因型的试剂盒。当为按照Mantel-Haenszel法等整合分析方法整合多个分析结果而得到的结果时,本发明的试剂盒优选为检测后述表52~B中记载的p值为1×10-2以下的单核苷酸多态性的与青光眼有关的等位基因或基因型的试剂盒;更优选为检测p值为3×10-3以下的单核苷酸多态性的与青光眼有关的等位基因或基因型的试剂盒;进一步优选为检测p值为1×10-3以下的单核苷酸多态性的与青光眼有关的等位基因或基因型的试剂盒;更进一步优选为检测p值为3×10-4以下的单核苷酸多态性的与青光眼有关的等位基因或基因型的试剂盒;又更进一步优选为检测p值为1×10-4以下的单核苷酸多态性的与青光眼有关的等位基因或基因型的试剂盒。
检测上述在青光眼患者组中高频率确认到的等位基因和与该等位基因对立的等位基因这两者的试剂盒也是本发明的实施方式之一。使用这种试剂盒时,如上所述,还可以确定各等位基因的基因型。
通过使用本发明的试剂盒检测样品中存在在青光眼患者中高频率确认到的等位基因或基因型,可以预测目前未患青光眼者将来的青光眼发病风险,判定是否需要进行青光眼的精密视野检查,或者进行青光眼疑似病例的青光眼的诊断。
如上所述,通过使用对立等位基因各自的特异性探针、并且使探针的标记不同,或者通过形成上述微阵列或珠粒阵列的形式,还可以制成按照相同操作测定对立的等位基因的试剂盒。
通过制成使用一个样品检测上述多个等位基因或基因型的构成的试剂盒,还可以提高预测青光眼发病风险或判定是否需要精密的视野检查的精度。在上述构成中,通过形成实施了不同标记的探针或上述微阵列或珠粒阵列的形式,还可以形成按照相同操作进行检测的构成。
在本发明的与青光眼有关的单核苷酸多态性的检测方法和青光眼发病风险的预测方法中,用于检测或风险预测的试剂盒为:使用核酸分子检测与青光眼发病有关的单核苷酸多态性或进行青光眼发病风险的预测的试剂盒,所述核酸分子包含存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性,所述核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:203~514所示的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列、或它们的部分序列;和/或使用包含核苷酸序列的核酸分子检测与青光眼发病有关的单核苷酸多态性或进行青光眼发病风险的预测的试剂盒,所述核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:515~694所示的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列;
更优选为:使用核酸分子检测与青光眼发病有关的单核苷酸多态性或进行青光眼发病风险的预测的试剂盒,所述核酸分子包含存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性,所述核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:203~238所示的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列、或它们的部分序列;和/或使用包含核苷酸序列的核酸分子检测与青光眼发病有关的单核苷酸多态性或进行青光眼发病风险的预测的试剂盒,所述核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:515~535所示的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列;
进一步优选为:使用核酸分子检测与青光眼发病有关的单核苷酸多态性或进行青光眼发病风险的预测的试剂盒,所述核酸分子包含存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性,所述核苷酸序列包含选自组A的至少一个核苷酸序列或其互补序列、或它们的部分序列,所述组A包含下述包括单核苷酸多态性的核苷酸序列组a~r;和/或使用包含核苷酸序列的核酸分子检测与青光眼发病有关的单核苷酸多态性或进行青光眼发病风险的预测的试剂盒,所述核苷酸序列包括:选自组B的至少一个核苷酸序列或核苷酸序列组、或它们的互补序列,所述组B包含aa~rr的核苷酸序列或核苷酸序列组。
(其中,在a~r所示的SEQ ID NO组中,各序列组对应于一个单核苷酸多态性,各核苷酸序列为在第31位碱基中含有上述单核苷酸多态性的相互对立的等位基因的核苷酸序列;
在aa~rr所示的SEQ ID NO或SEQ ID NO组中,各核苷酸序列或核苷酸序列组为用于检测一个单核苷酸多态性的核酸分子的序列或核酸分子的序列组,
a和aa、b和bb、c和cc、d和dd、e和ee、f和ff、g和gg、h和hh、i和ii、j和jj、k和kk、l和ll、m和mm、n和nn、o和oo、p和pp、q和qq、以及r和rr分别对应于相同的单核苷酸多态性)
组A
a:SEQ ID NO:203和/或SEQ ID NO:204、
b:SEQ ID NO:205和/或SEQ ID NO:206、
c:SEQ ID NO:207和/或SEQ ID NO:208、
d:SEQ ID NO:209和/或SEQ ID NO:210、
e:SEQ ID NO:211和/或SEQ ID NO:212、
f:SEQ ID NO:213和/或SEQ ID NO:214、
g:SEQ ID NO:215和/或SEQ ID NO:216、
h:SEQ ID NO:217和/或SEQ ID NO:218、
i:SEQ ID NO:219和/或SEQ ID NO:220、
j:SEQ ID NO:221和/或SEQ ID NO:222、
k:SEQ ID NO:223和/或SEQ ID NO:224、
l:SEQ ID NO:225和/或SEQ ID NO:226、
m:SEQ ID NO:227和/或SEQ ID NO:228、
n:SEQ ID NO:229和/或SEQ ID NO:230、
o:SEQ ID NO:231和/或SEQ ID NO:232、
p:SEQ ID NO:233和/或SEQ ID NO:234、
q:SEQ ID NO:235和/或SEQ ID NO:236、以及
r:SEQ ID NO:237和/或SEQ ID NO:238
组B
aa:SEQ ID NO:515和/或SEQ ID NO:533、
bb:SEQ ID NO:516、
cc:SEQ ID NO:517、
dd:SEQ ID NO:518和/或SEQ ID NO:534、
ee:SEQ ID NO:519、
ff:SEQ ID NO:520、
gg:SEQ ID NO:521、
hh:SEQ ID NO:522、
ii:SEQ ID NO:523、
jj:SEQ ID NO:524、
kk:SEQ ID NO:525、
ll:SEQ ID NO:526、
mm:SEQ ID NO:527、
nn:SEQ ID NO:528、
oo:SEQ ID NO:529、
pp:SEQ ID NO:530和/或SEQ ID NO:535、
qq:SEQ ID NO:531、以及
rr:SEQ ID NO:532
使用上述任一个单核苷酸多态性时,其中,在组A中,优选使用核酸分子检测与青光眼发病有关的单核苷酸多态性或进行青光眼发病风险的预测的试剂盒,所述核酸分子包含存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的等位基因,所述核苷酸序列为:选自下述包含单核苷酸多态性的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列、或它们的部分序列;
SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:234、SEQ IDNO:235和SEQ ID NO:238
在组B中,优选使用包含核苷酸序列的核酸分子检测与青光眼发病有关的单核苷酸多态性或进行青光眼发病风险的预测的试剂盒,所述核苷酸序列包含选自下述核苷酸序列的核苷酸序列或其互补序列。SEQ ID NO:533、SEQ ID NO:516、SEQ ID NO:517、SEQ ID NO:518、SEQ ID NO:519、SEQ ID NO:520、SEQ ID NO:521、SEQ IDNO:522、SEQ ID NO:523、SEQ ID NO:524、SEQ ID NO:525、SEQ ID NO:526、SEQ ID NO:527、SEQ ID NO:528、SEQ ID NO:529、SEQ ID NO:535、SEQ ID NO:531和SEQ ID NO:532
需要说明的是,上述核苷酸序列为用于检测高风险等位基因的核酸分子所对应的序列。
在本发明的与青光眼有关的单核苷酸多态性的检测方法和青光眼发病风险的预测方法中,将任意的两个以上单核苷酸多态性组合时,用于检测或风险预测的试剂盒优选为:使用核酸分子检测与青光眼发病有关的单核苷酸多态性或进行青光眼发病风险预测的试剂盒,所述核酸分子包含存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性,所述核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:203~514所示的核苷酸序列的、含单核苷酸多态性的核苷酸序列或其互补序列、或它们的部分序列;和/或使用包含核苷酸序列的核酸分子检测与青光眼发病有关的单核苷酸多态性或进行青光眼发病风险预测的试剂盒,所述核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:515~694所示的核苷酸序列的核苷酸序列或其互补序列,该试剂盒对应于其中两个以上不同的单核苷酸多态性;
更优选为:使用核酸分子检测与青光眼发病有关的单核苷酸多态性或进行青光眼发病风险预测的试剂盒,所述核酸分子包含存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性,所述核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:203~218所示的核苷酸序列的、含单核苷酸多态性的核苷酸序列或其互补序列、或它们的部分序列;和/或使用包含核苷酸序列的核酸分子检测与青光眼发病有关的单核苷酸多态性或进行青光眼发病风险预测的试剂盒,所述核苷酸序列包含选自SEQ IDNO:515~535所示的核苷酸序列的核苷酸序列或其互补序列,该试剂盒对应于其中两个以上不同的单核苷酸多态性;
进一步优选为:使用核酸分子检测与青光眼发病有关的单核苷酸多态性或进行青光眼发病风险预测的试剂盒,所述核酸分子包含存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性,所述核苷酸序列包含选自下述含单核苷酸多态性的核苷酸序列组的、含单核苷酸多态性的核苷酸序列或其互补序列、或它们的部分序列;和/或使用包含核苷酸序列的核酸分子检测与青光眼发病有关的单核苷酸多态性或进行青光眼发病风险预测的试剂盒,所述核苷酸序列包含选自组B的核苷酸序列或核苷酸序列组、或它们的互补序列,所述组B包含aa~rr的核苷酸序列或核苷酸序列组,该试剂盒对应于其中两个以上不同的单核苷酸多态性;
(其中,在a~r所示的SEQ ID NO组中,各序列组对应于一个单核苷酸多态性,各核苷酸序列为在第31位碱基中含有上述单核苷酸多态性的相互对立的等位基因的核苷酸序列;
在aa~rr所示的SEQ ID NO或SEQ ID NO组中,各核苷酸序列或核苷酸序列组为用于检测一个单核苷酸多态性的核酸分子的序列或核酸分子的序列组;
a和aa、b和bb、c和cc、d和dd、e和ee、f和ff、g和gg、h和hh、i和ii、j和jj、k和kk、l和ll、m和mm、n和nn、o和oo、p和pp、q和qq、以及r和rr分别对应于相同的单核苷酸多态性的)
组A
a:SEQ ID NO:203和/或SEQ ID NO:204、
b:SEQ ID NO:205和/或SEQ ID NO:206、
c:SEQ ID NO:207和/或SEQ ID NO:208、
d:SEQ ID NO:209和/或SEQ ID NO:210、
e:SEQ ID NO:211和/或SEQ ID NO:212、
f:SEQ ID NO:213和/或SEQ ID NO:214、
g:SEQ ID NO:215和/或SEQ ID NO:216、
h:SEQ ID NO:217和/或SEQ ID NO:218、
i:SEQ ID NO:219和/或SEQ ID NO:220、
j:SEQ ID NO:221和/或SEQ ID NO:222、
k:SEQ ID NO:223和/或SEQ ID NO:224、
l:SEQ ID NO:225和/或SEQ ID NO:226、
m:SEQ ID NO:227和/或SEQ ID NO:228、
n:SEQ ID NO:229和/或SEQ ID NO:230、
o:SEQ ID NO:231和/或SEQ ID NO:232、
p:SEQ ID NO:233和/或SEQ ID NO:234、
q:SEQ ID NO:235和/或SEQ ID NO:236、以及
r:SEQ ID NO:237和/或SEQ ID NO:238
组B
aa:SEQ ID NO:515和/或SEQ ID NO:533、
bb:SEQ ID NO:516、
cc:SEQ ID NO:517、
dd:SEQ ID NO:518和/或SEQ ID NO:534、
ee:SEQ ID NO:519、
ff:SEQ ID NO:520、
gg:SEQ ID NO:521、
hh:SEQ ID NO:522、
ii:SEQ ID NO:523、
jj:SEQ ID NO:524、
kk:SEQ ID NO:525、
ll:SEQ ID NO:526、
mm:SEQ ID NO:527、
nn:SEQ ID NO:528、
oo:SEQ ID NO:529、
pp:SEQ ID NO:530和/或SEQ ID NO:535、
qq:SEQ ID NO:531、以及
rr:SEQ ID NO:532
更进一步优选为:使用核酸分子检测与青光眼发病有关的单核苷酸多态性或进行青光眼发病风险预测的试剂盒,所述核酸分子包含存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性,所述核苷酸序列包含选自组A的含单核苷酸多态性的核苷酸序列或其互补序列、或它们的部分序列,所述组A包含上述含单核苷酸多态性的核苷酸序列组;和/或使用包含核苷酸序列的核酸分子检测与青光眼发病有关的单核苷酸多态性或进行青光眼发病风险预测的试剂盒,所述核苷酸序列包含选自由上述序列组构成的组B的核苷酸序列或其互补序列,该试剂盒对应于其中10个以上不同的单核苷酸多态性;
又更进一步优选为:使用核酸分子检测与青光眼发病有关的单核苷酸多态性或进行青光眼发病风险预测的试剂盒,所述核酸分子包含存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性,所述核苷酸序列包含选自组A的含单核苷酸多态性的核苷酸序列或其互补序列、或它们的部分序列,所述组A包含上述含单核苷酸多态性的核苷酸序列组;和/或使用包含核苷酸序列的核酸分子检测与青光眼发病有关的单核苷酸多态性或进行青光眼发病风险预测的试剂盒,所述核苷酸序列包含选自由上述序列组构成的组B的核苷酸序列或其互补序列,该试剂盒对应于上述所有不同的单核苷酸多态性。
另外,用于组合的单核苷酸多态性优选使用未处于连锁不平衡状态的单核苷酸多态性,从这个角度考虑,在上述组合的所有方式中,
关于上述组A,在包含属于:
a:SEQ ID NO:203和/或SEQ ID NO:204、以及
b:SEQ ID NO:205和/或SEQ ID NO:206
所组成的组的核苷酸序列或其互补序列或它们的部分序列的核苷酸序列中,以包含存在于各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的核苷酸序列所组成的组作为组1的核苷酸序列;
在包含属于:
c:SEQ ID NO:207和/或SEQ ID NO:208、以及
d:SEQ ID NO:209和/或SEQ ID NO:210
所组成的组的核苷酸序列或其互补序列或它们的部分序列的核苷酸序列中,以包含存在于各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的核苷酸序列所组成的组作为组2的核苷酸序列;
在包含属于:
j:SEQ ID NO:221和/或SEQ ID NO:222、
k:SEQ ID NO:223和/或SEQ ID NO:224、以及
l:SEQ ID NO:225和/或SEQ ID NO:226
所组成的组的核苷酸序列或其互补序列或它们的部分序列的核苷酸序列中,以包含存在于各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的核苷酸序列所组成的组作为组3的核苷酸序列;
在包含属于:
o:SEQ ID NO:231和/或SEQ ID NO:232、
p:SEQ ID NO:233和/或SEQ ID NO:234、
q:SEQ ID NO:235和/或SEQ ID NO:236、以及
r:SEQ ID NO:237和/或SEQ ID NO:238
所组成的组的核苷酸序列或其互补序列或它们的部分序列的核苷酸序列中,以包含存在于各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的核苷酸序列所组成的组作为组4的核苷酸序列;
关于上述组B,以包含下述核苷酸序列的组作为组1的核苷酸序列,所述核苷酸序列包含属于下述aa~bb组的核苷酸序列或其互补序列:
aa:SEQ ID NO:515和/或SEQ ID NO:533、以及
bb:SEQ ID NO:516
以包含下述核苷酸序列的组作为组2的核苷酸序列,所述核苷酸序列包含属于下述cc~dd组的核苷酸序列或其互补序列:
cc:SEQ ID NO:517、以及
dd:SEQ ID NO:518和/或SEQ ID NO:534
以包含下述核苷酸序列的组作为组3的核苷酸序列,所述核苷酸序列包含属于下述jj~ll组的核苷酸序列或其互补序列:
jj:SEQ ID NO:524、
kk:SEQ ID NO:525、以及
ll:SEQ ID NO:526
以包含下述核苷酸序列的组作为组4的核苷酸序列,所述核苷酸序列包含属于下述oo~rr组的核苷酸序列或其互补序列:
oo:SEQ ID NO:529、
pp:SEQ ID NO:530和/或SEQ ID NO:535、
qq:SEQ ID NO:531、以及
rr:SEQ ID NO:532
使用属于组1的核苷酸序列时,优选使用下述试剂盒,即、使用核酸分子检测与青光眼发病有关的单核苷酸多态性或进行青光眼发病风险预测的试剂盒,所述核酸分子包含组1中的任一个核苷酸序列;
使用属于组2的核苷酸序列时,优选使用下述试剂盒,即、使用核酸分子检测与青光眼发病有关的单核苷酸多态性或进行青光眼发病风险预测的试剂盒,所述核酸分子包含组2中的任一个核苷酸序列;
使用属于组3的核苷酸序列时,优选使用下述试剂盒,即、使用核酸分子检测与青光眼发病有关的单核苷酸多态性或进行青光眼发病风险预测的试剂盒,所述核酸分子包含组3中的任一个核苷酸序列;和/或
使用属于组4的核苷酸序列时,优选使用下述试剂盒,即、使用核酸分子检测与青光眼发病有关的单核苷酸多态性或进行青光眼发病风险预测的试剂盒,所述核酸分子包含组4中的任一个核苷酸序列;
并且,在上述组合的所有方式中,在组A中,优选使用核酸分子检测与青光眼发病有关的单核苷酸多态性或进行青光眼发病风险预测的试剂盒,所述核酸分子包含存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的等位基因,所述核苷酸序列包含选自下述含单核苷酸多态性的核苷酸序列的、含单核苷酸多态性的核苷酸序列或其互补序列、或它们的部分序列;
SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:234、SEQ IDNO:235和SEQ ID NO:238
在组B中,优选使用包含核苷酸序列的核酸分子检测与青光眼发病有关的单核苷酸多态性或进行青光眼发病风险预测的试剂盒,所述核苷酸序列包含:选自下述核苷酸序列的核苷酸序列或其互补序列。SEQ ID NO:533、SEQ ID NO:516、SEQ ID NO:517、SEQ ID NO:518、SEQ ID NO:519、SEQ ID NO:520、SEQ ID NO:521、SEQ ID NO:522、SEQ ID NO:523、SEQ ID NO:524、SEQ ID NO:525、SEQ ID NO:526、SEQ ID NO:527、SEQ ID NO:528、SEQ ID NO:529、SEQ ID NO:535、SEQ IDNO:531和SEQ ID NO:532
需要说明的是,上述核苷酸序列为用于检测高风险等位基因的核酸分子所对应的序列。
(分两阶段或多阶段进行发病风险预测的青光眼发病风险的预测方法)
使用本发明的单核苷酸多态性进行青光眼发病风险的预测时,可以选择认为必需精密预测青光眼发病风险的候选人,接着对上述候选人进行详细的风险预测等两阶段或两阶段以上的多阶段风险预测。
进行两阶段或两阶段以上的多阶段风险预测时,首先,对本发明的单核苷酸多态性中的至少一个、优选任一个或多个进行上述青光眼发病风险预测,接着,可以使用上述本发明的单核苷酸多态性的组合进行详细的风险预测。根据需要还可以进一步增加组合的个数,提高风险预测的精度。通过如此地进行两阶段或两阶段以上的多阶段风险预测,可以兼顾减少风险预测中的运行费用和高精度的风险预测。
最初阶段的风险预测可以采用简便的风险预测方法。例如,如下所述的方法,即、将能够检测至少一个、优选任一个或多个上述单核苷酸多态性的探针固定化,使之能够检测本发明的单核苷酸多态性中的至少一个,之后使用该固定化探针的风险预测方法简便,可用低成本进行检测。需要说明的是,这种情况下,核酸提取方法可以使用利用公知技术可以实现的、或市售的简便的核酸提取试剂盒。用于上述风险预测的固定化探针例如使用酶标记探针,之后利用比色法检测该探针,该方法简便。用于检测的样品也优选唾液、口腔粘膜细胞、尿、毛根、血液或白细胞等通过较低侵袭即可得到的样品。
下一阶段的风险预测可以采用重视精度的风险预测方法。例如,将两个或两个以上上述本发明的单核苷酸多态性组合起来,检测与青光眼发病有关的单核苷酸多态性,可以进行高精度的风险预测。
通过如此进行两阶段或多阶段的风险预测,可以降低成本,或者,在将最初阶段被验者的负担降到最低限度的同时提高风险预测的精度。
利用本发明的方法,可以判断:基因组上具有本发明所公开的、在青光眼患者中高频率确认到的等位基因或基因型者,其将来的青光眼发病风险高;而基因组上不具有在青光眼患者中高频率确认到的等位基因或基因型者,其将来的青光眼发病风险低。
另外,基因组上具有本发明所公开的、在青光眼患者中高频率确认到的等位基因或基因型者,其有可能发生初期青光眼,上述初期青光眼利用简单的青光眼判定法、例如眼压测定或眼底检查难以检测,进行视野检查后方可最初确诊,所以通过检测本发明的单核苷酸多态性,可以进行是否需要视野检查的筛选。另一方面,当青光眼疑似病例在基因组上具有本发明的与青光眼有关的等位基因或基因型时,该青光眼疑似病例诊断为青光眼的几率高。
实施例
以下列举实施例来说明本发明,但例示实施例只是为了更好地理解本发明,并不意味着本发明范围受这些实施例的限定。需要说明的是,在下述实施例中,对于没有特别详细说明的、通常所使用的分子生物学方法,采用Molexular Cloning(Joseph Sambrook等,MolexularCloning-A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,2001)等出版物中记载的方法和条件。
在本发明中,从诊断为青光眼的患者和诊断为不是青光眼且通过问诊判断不具有青光眼家族史的非患者各自的血液中提取总DNA,以人基因组上公知的约50万个单核苷酸多态性为指标,分析与疾病有关的基因座位,确认与疾病的关系。对于青光眼进展迅速的患者即青光眼进展例、和青光眼进展缓慢的患者即青光眼非进展例,同样进行单核苷酸多态性的鉴定和确认与进展的关联。
实施例1从样本中提取DNA
从样本中提取DNA时,使用市售的自动核酸提取机(QUIAGEN公司、BIOROBOT(注册商标)EZ1)和核酸提取试剂盒(EZ1 DNA Blood350μl Kit),该试剂盒适用于上述提取机,其通过磁力回收吸附在磁珠上的核酸。总DNA的提取按照仪器和试剂盒的操作说明书进行。利用本方法从350μL血液样本中得到约5μg的总DNA。
实施例2单核苷酸多态性的分析
分析单核苷酸多态性时,使用市售的微阵列型单核苷酸多态性分析试剂盒(Affimetrix公司GeneChip(注册商标)Human Mapping 500K)(以下,记作微阵列),该试剂盒可以分析人基因组上公知的约50万个单核苷酸多态性。单核苷酸多态性的检测使用适用于该试剂盒的扫描装置(Affimetrix公司GeneChip(注册商标)Scanner 3000)。单核苷酸多态性的分析使用专用分析软件(Affimetrix公司GTYPE(商标))。
按照试剂盒和仪器的说明书处理实施例1中提取的总DNA,之后将其应用于微阵列上,分析存在于自样本中提取的DNA上的单核苷酸多态性。简单说明如下:制备用限制酶NspI处理250ng总DNA而得到的样品和用限制酶StyI处理250ng总DNA而得到的样品,使衔接头结合在各样品的突出末端,利用PCR法进行扩增。回收PCR产物,用DNaseI将其片段化,使用试剂盒中所含的标记试剂对片段化的PCR产物末端进行生物素标记。向标记过的、已形成两个片段的PCR产物中加入杂交用缓冲液,在99℃下热处理10分钟,之后在49℃下温育1分钟,根据最初处理的限制酶注入到NspI处理样品用微阵列或StyI处理样品用微阵列上,在49℃下杂交16~18小时。杂交结束后,将微阵列用链霉亲和素-藻红素染色。使用上述扫描装置,读取来自藻红素的荧光,利用上述软件进行分析,所述藻红素经由生物素和链霉亲和素结合在与固定化的等位基因特异性探针杂交的样品中的DNA末端。将对应于约25万个单核苷酸多态性的探针事先分别固定在NspI处理样品用微阵列和StyI处理样品用微阵列上,将两者的结果整合,作为每个样品对应于约50万个单核苷酸多态性的分析结果。根据该方法,按照相同操作读取各单核苷酸多态性的对立等位基因,从而由该结果确定基因型。这种情况下,当检测到构成单核苷酸多态性的各等位基因两方的信号时,确定基因型为杂合子;当只检测到任一方的信号时,确定该被检测的等位基因的基因型为纯合子。
需要说明的是,根据该试剂盒的说明书,被固定在该试剂盒中的探针使用对应于基因组的有义链的探针或对应于反义链的探针。另外,根据该试剂盒的数据表,针对HapMap project中报道的单核苷酸多态性和本试剂盒中重复的单核苷酸多态性,使用270个样品比较本试剂盒的判定结果和HapMap的判定结果时,记载着显示出99%以上的一致率。
实施例3青光眼患者与非患者的单核苷酸多态性的比较
与疾病有关的单核苷酸多态性的比较按照Klein等人在老年性黄斑变性的致病基因研究中使用的方法(Science、308卷、385页、2005年)进行。
将根据青光眼学会指导原则诊断的原发性隅角开放型青光眼患者和正常眼压青光眼患者划分到青光眼患者组,将通过问诊确认不具有青光眼家族史的健康者划分到非患者组。在充分说明了研究内容的情况下、且根据参加者的自主意愿得到同意的情况下,将由418例青光眼患者组和300例非患者组提供的血液作为样本,按照实施例1中记载的方法提取总DNA,按照实施例2中记载的方法分析单核苷酸多态性。将在每一名患者中得到的单核苷酸多态性的分析结果存入采用了关系数据库的Laboratory Information Management系统(WorldFusion公司、LaboServer)中。在该系统内制作、安装单核苷酸多态性分析专用程序,进行下述分析。即,在青光眼患者组和非患者组中均舍弃检出率(call rate)不足90%的单核苷酸多态性、青光眼患者组与非患者组的检出率之差为5%以上的单核苷酸多态性、次要等位基因频率不足5%的单核苷酸多态性、以及根据卡方检验在p值为1×10-4以下判定Hardy-Weinberg’s平衡不成立的单核苷酸多态性,从而得到认为实验可靠性高的单核苷酸多态性,在组间比较该单核苷酸多态性的等位基因频率和基因型频率。将等位基因频率和基因型频率通过卡方检验进行统计学比较。对于p值为1×10-3以下的单核苷酸多态性,确认作为基因型判定依据的聚类图像。尽管聚类的分离不清楚,但基因型已判定的情况下,将该单核苷酸多态性从分析对象中除去。即,通过本操作除去基因型判定的错误。进行聚类评价时,在隐瞒单核苷酸多态性的名称和危险率值的情况下进行。p值为1×10-4以下、即-logP为4以上时等位基因或基因型显示出与青光眼相关的单核苷酸多态性见表1~2。需要说明的是,在各表中,根据下式(1)~(5)算出各等位基因与疾病相关联的比值比、基因型与疾病相关联的比值比。
等位基因频率=该组中该等位基因的测出数/该组中所有等位基因的测出数…·式(1)
基因型频率=该组中该基因型的测出数/该组中所有基因型的测出数…·式(2)
等位基因的比值比=[(青光眼患者组中的、在青光眼患者组中高频率确认到的等位基因的测出数)/(青光眼患者组中的、与在青光眼患者组中高频率确认到的等位基因对立的等位基因的测出数)]/[(非患者组中的、在青光眼患者组中高频率确认到的等位基因的测出数)/(非患者组中的、与在青光眼患者组中高频率确认到的等位基因对立的等位基因的测出数)]…·式(3)
纯合子基因型的比值比=[(青光眼患者组中的、具有在青光眼患者组中高频率确认到的等位基因的纯合子的基因型的测出数)/(青光眼患者组中的、具有在非患者组中高频率确认到的等位基因的纯合子的基因型的测出数)]/[(非患者组中的、具有在青光眼患者组中高频率确认到的等位基因的纯合子的基因型的测出数)/(非患者组中的、具有在非患者组中高频率确认到的等位基因的纯合子的基因型的测出数)]…·式(4)
杂合子基因型的比值比=[(青光眼患者组中杂合子基因型的测出数)/(青光眼患者组中的、具有在非患者组中高频率确认到的等位基因的纯合子的基因型的测出数)]/[(非患者组中杂合子基因型的测出数)/(非患者组中的、具有在非患者组中高频率确认到的等位基因的纯合子的基因型的测出数)]…·式(5)
表1和表2中列出:特定所得的公知单核苷酸多态性的dbSNP ID编号或Affimetrix阵列ID编号、构成等位基因1和等位基因2的各碱基、外显子·内含子信息(单核苷酸多态性存在于基因上时,显示基因名称和SNP所存在的外显子或内含子;单核苷酸多态性未存在于基因上时,显示邻近基因和该基因与该单核苷酸多态性间的距离)、单核苷酸多态性所存在的染色体编号、单核苷酸多态性的物理位置、通过卡方检验得到的等位基因的p值(-logP)、青光眼患者组和非患者组的高风险等位基因频率、高风险等位基因的类型(显示高风险等位基因是等位基因1或者是等位基因2)、等位基因的比值比、通过卡方检验得到的基因型的p值(-logP)、纯合子和杂合子的基因型的比值比、以及各多态性部位的包含等位基因1的序列的SEQ ID NO和包含等位基因2的序列的SEQ ID NO。需要说明的是,利用上述dbSNP ID编号或Affimetrix阵列ID编号,本领域技术人员可以由上述编号获取该单核苷酸多态性的序列或等位基因的信息。
比较不具有家族史的非患者和青光眼患者的、表1~2中记载的等位基因或基因型频率时,确认存在统计学差异。通过确定上述任一个单核苷酸多态性的等位基因,可以判定样品中是否存在在青光眼患者组中较在非患者组中高频率确认到的等位基因。
以表1~2中记载的最初的单核苷酸多态性为例进行具体说明时,在占据彼此相同的基因座位的SEQ ID NO:1或2所示的核酸分子中存在一个多态性部位。即,第31位碱基为A(等位基因1)或G(等位基因2)的单核苷酸多态性与青光眼的发病有关,以高风险等位基因的形式表示的等位基因1、即在青光眼患者组中高频率确认到该单核苷酸多态性的碱基为A的等位基因。并且,使用等位基因的比值比、纯合子和杂合子的基因型的比值比,可以预测具有该等位基因或基因型时疾病风险提高的程度。同样,表1~2所公开的序列在其序列中均具有与青光眼有关的多态性部位,在青光眼患者组中高频率确认到该多态性部位中的一个等位基因或至少一个基因型。
通过上述研究,在21个区域中发现了40个以集团形式存在于基因组上较接近的区域的单核苷酸多态性,该单核苷酸多态性的等位基因或基因型与青光眼的关联为p值1×10-4以下。
关于表1~2中记载的单核苷酸多态性,在青光眼患者组中高频率确认到的等位基因或基因型可以用作显示青光眼发病风险高的标志。另一方面,与该等位基因对立的等位基因或该基因型以外的基因型可以用作显示青光眼发病风险低的标志。
接下来,参考由HapMap project提供的数据库,确定表1~2中所示的单核苷酸多态性的周边区域和/或基因。即,根据HapMap project中的日本人与中国人合并的连锁不平衡数据,确定认为与表1~2所示的单核苷酸多态性处于连锁不平衡的单核苷酸多态性所存在的区域。
当表1~2所示的单核苷酸多态性处于包含基因的连锁不平衡区域时,确定该区域的物理位置和基因名称。而当表1~2所示的单核苷酸多态性存在于不含基因的连锁不平衡区域时,仅确定该区域的物理位置。当表1~2所示的单核苷酸多态性存在于超出连锁不平衡区域的一个基因上时,仅确定该基因名称。
各区域中以p值最低的单核苷酸多态性作为代表该区域的单核苷酸多态性,表3~4中列出:代表各区域的单核苷酸多态性、该区域所存在的染色体编号、该区域的物理位置(起点和终点)、以及区域中所含的基因名称。
【表3】
【表4】
表3~4中记载的区域认为是与表3~4中记载的、本发明的与青光眼有关的单核苷酸多态性连锁的区域或基因,认为存在于这些区域或基因中的单核苷酸多态性与本发明的单核苷酸多态性连锁。即,存在于这些区域中的任意的单核苷酸多态性与存在于该区域内的、表3~4中记载的单核苷酸多态性连锁,这些任意的单核苷酸多态性也同样可以用于青光眼的风险预测。
同样,p值为1×10-3以下、即-logP为3以上时等位基因或基因型显示与青光眼有关的单核苷酸多态性见表5~25。
表5~25中列出:特定所得的公知单核苷酸多态性的dbSNP ID编号或Affimetrix阵列ID编号、外显子·内含子信息(单核苷酸多态性存在于基因上时,显示基因名称和SNP所存在的外显子或内含子;单核苷酸多态性未存在于基因上时,显示邻近基因和该基因与该单核苷酸多态性间的距离)、该单核苷酸多态性所存在的染色体编号、该单核苷酸多态性的物理位置、通过卡方检验得到的等位基因的p值(-logP)、青光眼患者组和非患者组的高风险等位基因频率、等位基因的比值比、通过卡方检验得到的基因型的p值(-logP)、以及纯合子和杂合子的基因型的比值比。需要说明的是,表中,比值比以ND表示的部位表示作为分母的测出数均为0,比值比无法计算。
通过上述研究,发现413个等位基因或基因型与青光眼的关联为p值1×10-3以下的单核苷酸多态性。
比较不具有家族史的非患者和青光眼患者的、表5~25中记载的等位基因或基因型的频率时,确认存在统计学差异。通过确定上述任一个单核苷酸多态性的等位基因,可以判定样品中是否存在在青光眼患者组中较在非患者组中高频率确认到的等位基因。
实施例4青光眼进展例与青光眼非进展例的单核苷酸多态性的比较
进行与实施例3相同的操作,比较青光眼进展例与青光眼非进展例的单核苷酸多态性。
即,在根据青光眼学会指导原则诊断为原发性隅角开放型青光眼患者和正常眼压青光眼患者中,在充分说明研究内容的情况下、且根据参加者的自主意愿得到同意的情况下,以由一定期间内虽然给予降眼压药或进行手术等降眼压治疗但视野缺损仍在进展的210例患者(青光眼进展例)、175例视野缺损未进展的患者(青光眼非进展例)提供的血液为样本,进行与实施例3同样的分析,比较组间的等位基因频率和基因型频率。对于等位基因频率和基因型频率,也同样通过卡方检验进行统计学比较。在p值为1×10-4以下、即-logP为4以上时,等位基因或基因型显示与青光眼进展相关的单核苷酸多态性见表26~28。需要说明的是,根据下式(6)~(8)算出各表中各等位基因与青光眼进展相关联的比值比、基因型与青光眼进展相关联的比值比。等位基因的比值比=[(青光眼进展组中的、在青光眼进展组中高频率确认到的等位基因的测出数)/(青光眼进展组中的、与在青光眼进展组中高频率确认到的等位基因对立的等位基因的测出数)]/[(青光眼非进展组中的、在青光眼进展组中高频率确认到的等位基因的测出数)/(青光眼非进展组中的、与在青光眼进展组中高频率确认到的等位基因对立的等位基因的测出数)]…式(6)
纯合子基因型的比值比=[(青光眼进展组中的、具有在青光眼进展组中高频率确认到的等位基因的纯合子的基因型的测出数)/(青光眼进展组中的、具有在青光眼非进展组中高频率确认到的等位基因的纯合子的基因型的测出数)]/[(青光眼非进展组中的、具有在青光眼进展组中高频率确认到的等位基因的纯合子的基因型的测出数)/(青光眼非进展组中的、具有在青光眼非进展组中高频率确认到的等位基因的纯合子的基因型的测出数)]…式(7)
杂合子基因型的比值比=[(青光眼进展组中杂合子基因型的测出数)/(青光眼进展组中的、具有在青光眼非进展组中高频率确认到的等位基因的纯合子的基因型的测出数)]/[(青光眼非进展组中杂合子基因型的测出数)/(青光眼非进展组中的、具有在青光眼非进展组中高频率确认到的等位基因的纯合子的基因型的测出数)]…式(8)
表26~28中列出:特定所得的公知单核苷酸多态性的dbSNP ID编号或Affimetrix阵列ID编号、构成等位基因1和等位基因2的各碱基、外显子·内含子信息(单核苷酸多态性存在于基因上时,显示基因名称和SNP所存在的外显子或内含子;单核苷酸多态性未存在于基因上时,显示邻近基因和该基因与该单核苷酸多态性间的距离)、该单核苷酸多态性所存在的染色体编号、该单核苷酸多态性的物理位置、通过卡方检验得到的等位基因的p值(-logP)、青光眼进展组和青光眼非进展组的高风险等位基因频率、高风险等位基因的类型(显示高风险等位基因是等位基因1或者是等位基因2)、等位基因的比值比、通过卡方检验得到的基因型的p值(-logP)、纯合子基因型的比值比、杂合子基因型的比值比、以及各多态性部位中的包含等位基因1的序列的SEQ ID NO和包含等位基因2的序列的SEQ ID NO。需要说明的是,表中比值比以ND表示的部位表示作为分母的测出数均为0,比值比无法计算。
通过上述研究,发现了61个等位基因或基因型与青光眼进展的关联为p值1×10-4以下的单核苷酸多态性。
关于表26~28中记载的等位基因或基因型的频率,在青光眼进展例和青光眼非进展例之间,确认存在统计学差异。通过确定上述任一个单核苷酸多态性的等位基因,可以判定样品中是否存在在青光眼进展组中较在青光眼非进展组中高频率确认到的等位基因。
另外,关于表26~28中记载的单核苷酸多态性,在青光眼进展组中高频率确认到的等位基因或基因型可以用作显示青光眼的进展风险高的标志。而与该等位基因对立的等位基因或该基因型以外的基因型可以用作显示青光眼的进展风险低的标志。
同样,在p值为1×10-3以下、即-logP为3以上的情况下,等位基因或基因型显示与青光眼进展有关的单核苷酸多态性见表29~51。
表29~51中列出:特定所得的公知单核苷酸多态性的dbSNP ID编号或Affimetrix阵列ID编号、外显子·内含子信息(单核苷酸多态性存在于基因上时,显示基因名称和SNP所存在的外显子或内含子;单核苷酸多态性未存在于基因上时,显示邻近基因和该基因与该单核苷酸多态性间的距离)、该单核苷酸多态性所存在的染色体编号、该单核苷酸多态性的物理位置、通过卡方检验得到的等位基因的p值(-logP)、青光眼进展组与青光眼非进展组的高风险等位基因频率、等位基因的比值比、通过卡方检验得到的基因型的p值(-logP)、以及纯合子和杂合子的基因型的比值比。需要说明的是,表中比值比以ND表示的部位表示作为分母的测出数均为0,比值比无法计算。
通过上述研究,发现了480个等位基因或基因型与青光眼进展的关联为p值1×10-3以下的单核苷酸多态性。
关于表29~51中记载的等位基因或基因型的频率,在青光眼进展例与青光眼非进展例之间,确认存在统计学差异。通过确定上述任一个单核苷酸多态性的等位基因,可以判定样品中是否存在在青光眼进展组中较在青光眼非进展组中高频率确认到的等位基因。
实施例5利用所特定的单核苷酸多态性的周边序列确定法确认新型
单核苷酸多态性
进行表1~2或表26~28中记载的单核苷酸多态性周边的再测序,可以确认检测到的各单核苷酸多态性、以及鉴定有可能存在的未知单核苷酸多态性。再测序可以按照公知的任何方法实施,例如可以按照直接测序法来进行。
实施例6
为了判定实施例3或4中鉴定的与青光眼有关的单核苷酸多态性、或判定存在于表1~51中记载的单核苷酸多态性周边的公知单核苷酸多态性的等位基因以及基因型,可以制作固定化探针。公知的单核苷酸多态性例如可以从dbSNP或J SNP的数据库中引用。在固定化探针中,例如可以搭载寡核苷酸探针,该寡核苷酸探针被设计成使几个至数十万个左右的灵敏度、特异性、重现性达到最大。固定化探针可以按照下述方法进行制备,例如在固体载体上合成寡核苷酸的方法,或者先合成寡核苷酸,之后将其以高密度固定在固体载体上的方法等。
实施例7
使用实施例6中制备的固定化探针,可以高精度地判定是否患有青光眼。通过将多个测出与疾病有关的单核苷酸多态性的探针组合起来,评价青光眼发病风险所增加的程度。超过某阈值时,判定患有青光眼。
另外,使用实施例6中制备的固定化探针,可以比较青光眼患者和非青光眼患者的基因组上所存在的单核苷酸多态性。存在于邻近位置上的单核苷酸多态性之间有可能通过连锁不平衡进行连锁而遗传。利用固定化探针可以鉴定与表1~2或表26~28中所示的单核苷酸多态性连锁的单核苷酸多态性,可以期待着发现与青光眼的关联更强的单核苷酸多态性。
实施例8定制阵列的设计
为了在减小第一类错误的同时保持检测力,针对实施例3的一次分析中鉴定的青光眼发病相关候选单核苷酸多态性,使用独自设计的单核苷酸多态性分析用阵列(以下,记作定制阵列),进行另外收集的样品的单核苷酸多态性的二次分析。
在定制阵列中,使用Illumina公司市售的单核苷酸多态性分析试剂盒[Illumina公司iSelectTM Genotyping BeadChip]。对于实施例3中显示p值为1×10-3以下的446个青光眼发病相关单核苷酸多态性,尝试着设计特异性检测上述单核苷酸多态性的探针。由于上述探针经由珠粒被任意固定在基板上,所以特定珠粒位置的步骤(解码)是必需的。将用于检测在解码过程中无法特定位置的单核苷酸多态性的探针从分析对象中除去。其结果,446个单核苷酸多态性中,可以制作能够定型412个单核苷酸多态性的定制阵列,将上述定制阵列用于分析后述的单核苷酸多态性。需要说明的是,如珠粒阵列法的Infinium(注册商标)分析项中所述,在本分析法中有两种方法,即、使用一种探针的方法和使用两种探针的方法。基本上是,检测一个单核苷酸多态性时使用一种探针,检测一部分单核苷酸多态性时使用两种探针。
实施例9使用定制阵列的单核苷酸多态性的分析
按照Illumina公司的定制阵列试剂盒和分析仪器的说明书,使用试剂盒中所含的专用试剂进行实验。以下简单说明实验步骤。向实施例1中提取的150~300ng总DNA中加入基因组处理专用试剂和氢氧化钠溶液。接着,加入全基因组扩增酶,在37℃下温育20~24小时,扩增全基因组。再加入片段化酶,在37℃下温育1小时。利用异丙醇使DNA沉淀,之后向其中添加增溶试剂,在48℃下悬浮1小时。在95℃下热改性20分钟,将该溶液注入定制阵列中,在48℃下杂交16~24小时。
杂交结束后,对各探针进行等位基因特异性伸长反应或单核苷酸伸长反应,扩增荧光信号。信号通过适合于该试剂盒的扫描装置(Illumina公司BeadArray Reader)来读取。另外,在单核苷酸多态性的分析中使用专用软件(Illumina公司BeadStudio 3.1)。通过该分析方法,可以同时判定各单核苷酸多态性的对立等位基因,根据该分析结果确定基因型。当检测到构成各单核苷酸多态性的各等位基因两方的信号时,确定基因型为杂合子;仅检测到其中一方的信号时,确定基因型为该检测的等位基因的纯合子。
根据Illumina公司的分析手册、即Infinium(注册商标)GenotypingData Analysis,对于作为分析对象的所有单核苷酸多态性,根据显示出荧光信号分布的聚类图像,确认其基因型判定的正确性。对于正确确定的单核苷酸多态性的基因型,荧光信号形成各自完全分离的3个聚类(两种的纯合子和杂合子),显示在图像上。而对于未能正确判定的单核苷酸多态性,3个聚类的边界线不清楚。通过分析软件判定聚类分离度不高时,再次确认该单核苷酸多态性的聚类图像。虽然聚类不清楚但基因型已判定时,将该样品从以后的分析操作中除去。需要说明的是,确认聚类图像时,在掩蔽状态下即无法与该单核苷酸多态性核对单核苷酸多态性名称及p值的状态下实施。需要说明的是,对于在用于二次分析的该定制阵列和用于一次分析的Affimetrix公司GeneChip Human Mapping 500K中重复的单核苷酸多态性,使用104个样品比较基因型判定的一致率时,显示出99%以上的一致率。
实施例10青光眼患者与非患者的基因型判定
将根据青光眼学会指导原则诊断为原发性隅角开放型青光眼患者和正常眼压青光眼患者划分到青光眼患者组,将通过问诊确认不具有青光眼家族史的健康者划分到非患者组。该分析中不使用进行一次分析的实施例3中使用的相同样品,而是收集新的样品。在充分说明研究内容的情况下、且根据参加者的自主意愿得到同意的情况下,以由不同于实施例3的409例青光眼患者组、448例非患者组提供的血液作为样品,按照实施例1中记载的方法提取总DNA,按照实施例9中记载的方法分析单核苷酸多态性。将由每个患者提供的样品而得到的单核苷酸多态性的分析结果存入采用了关系数据库的LaboratoryInformation Management系统(World Fusion公司、LaboServer)中。在该系统内制作、安装单核苷酸多态性分析专用程序,进行下述分析。即,在青光眼患者组和非患者组中均舍弃检出率不足90%的单核苷酸多态性、次要等位基因频率不足5%的单核苷酸多态性,从而得到认为实验可靠性高的单核苷酸多态性。
实施例11整合分析
整合分析中使用Mantel-Haenszel法(ゎかりやすぃ医学统计学、第48-80页、森實敏夫、Medical Tribune公司)。即,对于在实施例3和实施例10所记载的两种方法中均认为实验可靠性高的402个单核苷酸多态性,采用Mantel-Haenszel卡方检验将等位基因频率和两个基因型频率(显性遗传模型、隐性遗传模型)进行统计学比较。在p值为1.2×10-4以下(进行402次多重比较时,相当于p<5×10-2的Bonferroni校正水平)、即-logP为3.91以上的条件下,在等位基因模型、显性遗传模型、隐性遗传模型中均显示与青光眼发病相关的单核苷酸多态性见表52。
Mantel-Haenszel卡方检验以及上述单核苷酸多态性的Mantel-Haenszel法的比值比和95%置信区间的计算按以下程序进行。
求出等位基因模型、显性遗传模型、隐性遗传模型的Mantel-Haenszel卡方值,与自由度1的卡方分布进行比较,算出p值。
等位基因模型的Mantel-Haenszel卡方值(xAMH 2)按下式计算。
【数学式1】
EAi=xAimAi/NAi
xAi:高风险等位基因的总测出数
yAi:低风险等位基因的总测出数
mAi:青光眼患者组的等位基因总测出数
nAi:非患者组的等位基因总测出数
NAi:等位基因的总测出数
hAi:青光眼患者组的高风险等位基因测出数
显性遗传模型的Mantel-Haenszel卡方值(xDMH 2)按下式计算。
【数学式2】
EDi=xDimDi/NDi
xDi:高风险等位基因的纯合子的总测出数与杂合子总测出数之和
yDi:低风险等位基因的纯合子的总测出数
mDi:青光眼患者组的基因型的总测出数
nDi:非患者组的基因型的总测出数
NDi:基因型的总测出数
hDi:青光眼患者组的高风险等位基因的纯合子的测出数与杂合子的测出数之和
隐性遗传模型的Mantel-Haenszel卡方值(xRMH 2)按下式计算。
【数学式3】
ERi=xRimRi/NRi
xRi:高风险等位基因的纯合子的总测出数
yRi:低风险等位基因的纯合子的总测出数与杂合子的基因型的总测出数之和
mRi:青光眼患者组的基因型的总测出数
nRi:非患者组的基因型的总测出数
NRi:基因型的总测出数
hRi:青光眼患者组的高风险等位基因的纯合子的测出数
计算等位基因模型、显性遗传模型、隐性遗传模型的Mantel-Haenszel检验的比值比。
等位基因模型的Mantel-Haenszel检验的比值比(ORaMH)按下式计算。
【数学式4】
Aai:青光眼患者组中高风险等位基因的测出数
Bai:青光眼患者组中低风险等位基因的测出数
Cai:非患者组中高风险等位基因的测出数
Dai:非患者组中低风险等位基因的测出数
Zai:等位基因的总测出数
显性遗传模型的Mantel-Haenszel检验的比值比(ORdMH)按下式计算。
【数学式5】
Adi:青光眼患者组中高风险等位基因的纯合子的测出数与青光眼患者组中杂合子的测出数之和
Bdi:青光眼患者组中低风险等位基因的纯合子的测出数
Cdi:非患者组中高风险等位基因的纯合子的测出数与非患者组中杂合子的测出数之和
Ddi:非患者组中低风险等位基因的纯合子的测出数
Zdi:基因型的总测出数
隐性遗传模型的Mantel-Haenszel检验的比值比(ORrMH)按下式计算。
【数学式6】
Ari:青光眼患者组中高风险等位基因的纯合子的测出数
Bri:青光眼患者组中杂合子的测出数与青光眼患者组中低风险等位基因的纯合子的测出数之和
Cri:非患者组中高风险等位基因的纯合子的测出数
Dri:非患者组中杂合子的测出数与非患者组中低风险等位基因的纯合子的测出数之和
Zri:基因型的总测出数
计算等位基因模型、显性遗传模型、隐性遗传模型的Mantel-Haenszel检验的比值比的95%置信区间。
等位基因模型的95%置信区间(95%CIA)按下式计算。
【数学式7】
aAi:青光眼患者组中高风险等位基因的测出数
bAi:青光眼患者组中低风险等位基因的测出数
cAi:非患者组中高风险等位基因的测出数
dAi:非患者组中低风险等位基因的测出数
zAi:等位基因的总测出数
ORaMH:等位基因模型的Mantel-Haenszel检验的比值比
显性遗传模型的95%置信区间(95%CId)按下式计算。
【数学式8】
aDi:青光眼患者组中高风险等位基因的纯合子的测出数与青光眼患者组中杂合子的测出数之和
bDi:青光眼患者组中低风险等位基因的纯合子的测出数
cDi:非患者组中高风险等位基因的纯合子的测出数与非患者组中杂合子的测出数之和
dDi:非患者组中低风险等位基因的纯合子的测出数
zDi:基因型的总测出数
ORdMH:显性遗传模型的Mantel-Haenszel检验的比值比
隐性遗传模型的95%置信区间(95%CIr)按下式计算。
【数学式9】
aRi:青光眼患者组中高风险等位基因的纯合子的测出数
bRi:青光眼患者组中杂合子的测出数与青光眼患者组中低风险等位基因的纯合子的测出数之和
cRi:非患者组中高风险等位基因的纯合子的测出数
dRi:非患者组中杂合子的测出数与非患者组中低风险等位基因的纯合子的测出数之和
zRi:基因型的总测出数
ORrMH:隐性遗传模型的Mantel-Haenszel检验的比值比
表52中列出:特定所得的公知单核苷酸多态性的dbSNP ID、单核苷酸多态性所存在的染色体编号、单核苷酸多态性的物理位置、外显子·内含子信息(单核苷酸多态性存在于基因上时,显示基因名称和单核苷酸多态性所存在的外显子或内含子;单核苷酸多态性未存在于基因上时,显示邻近基因和该基因与该单核苷酸多态性间的距离)、连锁不平衡状态的信息(对存在于同一连锁不平衡区域的单核苷酸多态性赋予编号LD1~LD4)、构成等位基因1和等位基因2的各碱基、高风险等位基因的碱基、青光眼患者组和非患者组的高风险等位基因频率、3种的Mantel-Haenszel检验(等位基因频率、显性遗传模型、隐性遗传模型)中p值最低的检验方法中的p值、其检验种类、比值比、95%置信区间、各多态性部位中的包含等位基因1的序列的SEQ ID NO和包含等位基因2的序列的SEQ ID NO、以及显示二次分析时所用探针的核酸序列的SEQ ID NO(基本上是利用同一种探针检测两方的等位基因,但在使用两种探针识别等位基因时,将两个SEQ ID NO同时标记)。需要说明的是,利用上述dbSNP ID编号,本领域技术人员可以由上述编号获取该单核苷酸多态性的序列或等位基因的信息。
比较非患者与青光眼患者的、表52的单核苷酸多态性的等位基因或基因型的频率时,通过Mantel-Haenszel卡方检验确认到存在统计学差异。与实施例3的情形一样,通过确定上述任一个单核苷酸多态性的等位基因,可以判定样品中是否存在在青光眼患者组中较在非患者组中高频率确认到的等位基因。
通过上述研究,在11个区域中发现了18个以集团形式存在于基因组上较接近的区域的单核苷酸多态性,该单核苷酸多态性的等位基因或基因型与青光眼的关联为p值1.2×10-4以下。
关于表52中记载的单核苷酸多态性,在青光眼患者组中高频率确认到的等位基因(即高风险等位基因)或基因型(即,当高风险等位基因符合显性遗传模型时,基因型为高风险等位基因的纯合子或杂合子;当高风险等位基因符合隐性遗传模型时,基因型为高风险等位基因的纯合子)可以用作显示青光眼的发病风险高的标志。而与该等位基因对立的等位基因或该基因型以外的基因型可以用作显示青光眼的发病风险低的标志。
同样,在p值为1×10-2以下、即-logP为2以上时,等位基因或基因型显示与青光眼发病相关的单核苷酸多态性见表53~62。
表53~62中记载的单核苷酸多态性同样可以用作用于预测青光眼发病风险的标志。
接下来,参考由HapMap project提供的数据库,确定表52所示的单核苷酸多态性的周边区域和/或基因。即,根据HapMap project中的日本人和中国人合并的连锁不平衡数据,确定认为与表52所示的单核苷酸多态性处于连锁不平衡的单核苷酸多态性所存在的区域。
当表52所示的单核苷酸多态性存在于包含基因的连锁不平衡区域时,确定该区域的物理位置和基因名称。而当表52所示的单核苷酸多态性存在于不含基因的连锁不平衡区域时,仅确定该区域的物理位置。当表52所示的单核苷酸多态性存在于超出连锁不平衡区域的1个基因上时,确定该基因名称以及该基因的物理位置。
在各区域中,以p值最小的单核苷酸多态性作为代表该区域的单核苷酸多态性,表63~70中列出:代表各区域的单核苷酸多态性、该区域所存在的染色体编号、该区域的物理位置(起点和终点)、以及区域中所含的基因名称。
【表63】
【表64】
【表65】
【表66】
【表67】
【表68】
【表69】
【表70】
表63~70中记载的区域是认为与表53~62中记载的、与本发明的青光眼发病有关的单核苷酸多态性连锁的区域或基因,认为存在于这些区域或基因中的单核苷酸多态性与本发明的单核苷酸多态性连锁。即,存在于上述区域中的任意的单核苷酸多态性与存在于该区域内的表53~62中记载的单核苷酸多态性连锁,上述任意的单核苷酸多态性也同样可以用于预测青光眼的发病风险。
实施例12逻辑回归分析
在本发明中,采用逻辑回归分析来研究通过将判定与青光眼发病有关的任意两个以上单核苷酸多态性组合起来,与各单核苷酸多态性单独使用时相比,疾病危险性的预测精度提高的程度。在该分析中,通过将等位基因或基因型的频率进行统计比较,可以使用判定为与青光眼的发病显著相关的上述单核苷酸多态性中任意的组合。其中一个例子为:对即使进行Bonferroni校正也显示出显著差异的17个单核苷酸多态性进行逻辑回归分析。
首先,利用逐步回归法从17个在Bonferroni校正下具有显著性的单核苷酸多态性中进一步减少用于逻辑回归分析的单核苷酸多态性。采用逐步回归法时,变数取·/舍的基准采用0.01。另外,应用逐步回归法时,属于同一LD区段的单核苷酸多态性(表52中,连锁不平衡的栏内具有相同记载的单核苷酸多态性)用属于各LD区段的任一个单核苷酸多态性来代表,并进行设定使上述任一个单核苷酸多态性成为采纳对象。以缩减过的各单核苷酸多态性作为独立变数(∏)(一方的等位基因的纯合子=0、杂合子=1、对立等位基因的纯合子=2),通过逻辑回归分析求出回归系数(λ),来确定下式(18)。
式(18)
Φ=1/{1+exp[-(λ0+λ1∏1+λ2∏2+λ3∏3+…)]}
接下来,在各样品中,将各自的单核苷酸多态性所对应的变数代入该式,计算风险预测值(Φ)。Φ大于0.5时,判断该样品的提供者存在发病风险。通过核对该判定结果与具有该单核苷酸多态性的样品提供者实际上是否是青光眼患者,算出一致率。并且,求出采纳的各单核苷酸多态性单独和任意两个以上单核苷酸多态性的所有组合的上述一致率,对于每一个用于组合的单核苷酸多态性求出一致率的平均值和标准偏差。表71中列出:单独和任意个数的单核苷酸多态性的组合、将任意个数的单核苷酸多态性组合时的组合数、以及一致率的平均值和标准偏差的关系。需要说明的是,所有计算均使用SASInstitute Japan株式会社的Windows(注册商标)版SAS 9.1.3来进行。
如表71所示,利用逐步回归法,17个单核苷酸多态性中,将属于同一LD区段的单核苷酸多态性分别看作一个时,10个全部入选(rs7081455、rs693421、rs9358578、rs7961953、rs16935718、rs11123034、rs13110551、rs7559118、rs10517556、rs6451268)。上述10个单核苷酸多态性中,对于各自单独或任意两个以上的组合,使用逻辑回归式算出每个症例的风险预测值(Φ)。风险预测值的截断值为0.5时,各单核苷酸多态性单独使用时的一致率的平均值±标准偏差为54.7±1.4%。该一致率随着用于组合的单核苷酸多态性数的增大而增加,将10个全部组合时达到最大值59.9%。
【表71】
SNP数 | 组合数 | 一致率(平均值) | 标准偏差 |
1 | 10 | 54.7 | 1.4 |
2 | 45 | 55.7 | 1.1 |
3 | 120 | 56.3 | 1.0 |
4 | 210 | 57.0 | 1.0 |
5 | 252 | 57.5 | 1.0 |
6 | 210 | 58.0 | 1.0 |
7 | 120 | 58.4 | 1.0 |
8 | 45 | 58.8 | 1.0 |
9 | 10 | 59.1 | 0.9 |
10 | 1 | 59.9 | - |
由此可知:通过单核苷酸多态性判定青光眼的发病风险时,即使单独使用各单核苷酸多态性也可得到良好的一致率,但通过将它们组合起来可以进一步提高诊断精度。
综上所述,基因组上具有本发明所公开的、在青光眼患者中高频率确认到的等位基因或基因型者,将来其青光眼的发病风险高;而基因组上不具有在青光眼患者中高频率确认到的等位基因或基因型者,将来其青光眼的发病风险低。
产业实用性
根据本发明的方法,通过分析样品中的本发明的单核苷酸多态性的等位基因或基因型,可以判定样品提供者的青光眼发病风险的高低。根据该风险,样品提供者可以采取预防青光眼的措施、或者接受适当的治疗。基因组上具有本发明的单核苷酸多态性的、在青光眼患者中高频率确认到的等位基因或基因者,可以接受精密检查以判断是否为通过眼压或眼底照片难以充分判别的初期青光眼。当诊断为青光眼时,可以早期开始治疗,所以本发明的方法是有用的。
序列表
<110>参天制药株式会社
木下茂
田代启
<120>青光眼发病风险的判定方法
<130>08-017-PCTJP
<150>JP 2007-108688
<151>2007-04-17
<160>694
<170>PatentIn version Ver.3.3
<210>1
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>1
cggtgctgca ccgtggatgt gagtccttgc acagtggtga aatgtagtag aggagtgatc 60
t 61
<210>2
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>2
cggtgctgca ccgtggatgt gagtccttgc gcagtggtga aatgtagtag aggagtgatc 60
t 61
<210>3
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>3
ccggagtatc ccgctttctt tggaggaaac aaccgcatca gatctgcgct gcggcagagg 60
c 61
<210>4
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>4
ccggagtatc ccgctttctt tggaggaaac caccgcatca gatctgcgct gcggcagagg 60
c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>5
tcagcaccct gcaccagtcc aagtacatga cagataccac agggaaggag ttcagaactg 60
t 61
<210>6
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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tcagcaccct gcaccagtcc aagtacatga tagataccac agggaaggag ttcagaactg 60
t 61
<210>7
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ttctccatca tcctctttct ctattctcca gacattaggc acccactgtg tgcccagcac 60
a 61
<210>8
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>8
ttctccatca tcctctttct ctattctcca tacattaggc acccactgtg tgcccagcac 60
a 61
<210>9
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>9
gtttccagaa ctctttttgg ccaggctcca agctaagctc tgtaggaagc ttgatgatgg 60
g 61
<210>10
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>10
gtttccagaa ctctttttgg ccaggctcca ggctaagctc tgtaggaagc ttgatgatgg 60
g 61
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<213>Homo sapiens
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cctgcagagg ggatttgctt tgctaaagga gtcaccacag agcacccgag agtaacaggt 60
t 61
<210>12
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>12
cctgcagagg ggatttgctt tgctaaagga ttcaccacag agcacccgag agtaacaggt 60
t 61
<210>13
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>13
gagtgggcag ttggaaacag ctatgaaacc agcatttagt gatggggcag tagggctggg 60
g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>14
gagtgggcag ttggaaacag ctatgaaacc ggcatttagt gatggggcag tagggctggg 60
g 61
<210>15
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>15
aaccccatgc ctacatccat tatcaaccta cgcctatgct aaagcttgtt acaatgagca 60
g 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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aaccccatgc ctacatccat tatcaaccta tgcctatgct aaagcttgtt acaatgagca 60
g 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ttccctgact cttgaagagg acagtggaca atgctgttta atggtggaca cagaaggatc 60
a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ttccctgact cttgaagagg acagtggaca gtgctgttta atggtggaca cagaaggatc 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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tatggaagca ctgtgaaaga caaactactc cgaatactga aagtttcttt tacaaaaaca 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>20
tatggaagca ctgtgaaaga caaactactc tgaatactga aagtttcttt tacaaaaaca 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>21
ataacacctg ccactgacct tccatgagca gtgactatgt ggtttcaaca ttggtcccac 60
c 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>22
ataacacctg ccactgacct tccatgagca ttgactatgt ggtttcaaca ttggtcccac 60
c 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>23
gccactgcca ccactcctgc agattgttcc agctgtgtta ctaaatacag gttgcttttc 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>24
gccactgcca ccactcctgc agattgttcc cgctgtgtta ctaaatacag gttgcttttc 60
t 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gtgagccacc atgcccagcc ctgtcatcta cctttctgag agcagcttct acccatctga 60
a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>26
gtgagccacc atgcccagcc ctgtcatcta tctttctgag agcagcttct acccatctga 60
a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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cttgtcttca agagcagatg cagattatcc cgagcccagg ggacctatgt gagggagctt 60
c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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cttgtcttca agagcagatg cagattatcc tgagcccagg ggacctatgt gagggagctt 60
c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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agtgggaccc tgtgaggcaa acatcaccac aaggctggga acagcaggac tcaggcactg 60
c 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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agtgggaccc tgtgaggcaa acatcaccac gaggctggga acagcaggac tcaggcactg 60
c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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tatataataa agacatctga taacatgaca gctaaggctc cttctaggta taaaacgtta 60
t 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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tatataataa agacatctga taacatgaca tctaaggctc cttctaggta taaaacgtta 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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atggcagggg ccagggtgag tggagaatac cgcttgatga gagaacccca aggcggagag 60
g 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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atggcagggg ccagggtgag tggagaatac tgcttgatga gagaacccca aggcggagag 60
g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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cccttttctt tcttgttctt tttaagactc aatctcaaat ctgcaaccta cctaccataa 60
g 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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cccttttctt tcttgttctt tttaagactc gatctcaaat ctgcaaccta cctaccataa 60
g 61
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<213>Homo sapiens
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a 61
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a 61
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<212>DNA
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c 61
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acaaagcagc tatgatcata ggcacatgaa cgcaaaatgt actggtgatt tcatgttcct 60
c 61
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<213>Homo sapiens
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aagagatagg aaaagacaca gagacacaga cgggaatgcc gggtgaagac agaggaaaat 60
a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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aagagatagg aaaagacaca gagacacaga ggggaatgcc gggtgaagac agaggaaaat 60
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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taatatactg caaccacatg agatttatct aagaagtgca agttttgttt aacatgcaga 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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taatatactg caaccacatg agatttatct gagaagtgca agttttgttt aacatgcaga 60
a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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tgcaaagaaa atgaatcact catgggtata caaaatgtta cagcctcttt ggaaaacagt 60
t 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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tgcaaagaaa atgaatcact catgggtata taaaatgtta cagcctcttt ggaaaacagt 60
t 61
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ccggagtatc ccgctttctt tggaggaaac aaccgcatca gatctgcgct gcggcagagg 60
c 61
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ccggagtatc ccgctttctt tggaggaaac caccgcatca gatctgcgct gcggcagagg 60
c 61
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tcagcaccct gcaccagtcc aagtacatga cagataccac agggaaggag ttcagaactg 60
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tcagcaccct gcaccagtcc aagtacatga tagataccac agggaaggag ttcagaactg 60
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ttctccatca tcctctttct ctattctcca gacattaggc acccactgtg tgcccagcac 60
a 61
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ttctccatca tcctctttct ctattctcca tacattaggc acccactgtg tgcccagcac 60
a 61
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tagggagcaa caccatggtg gtagagaacc gaagtttatt agcatctcta aactcatata 60
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aatgatatat caatgatata ttgaggagcc cagtaagatc ttaaatctag agggaaggta 60
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<213>Homo sapiens
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ggaagggaac ctgagtatga gaaggacaga cgaggagaag ttggttaatg tttacaaact 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ggaagggaac ctgagtatga gaaggacaga tgaggagaag ttggttaatg tttacaaact 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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cttgatttta ttgctaggga ttgtggtaaa acacccaaag aatgtgggta tgtgcctact 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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cttgatttta ttgctaggga ttgtggtaaa gcacccaaag aatgtgggta tgtgcctact 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<211>61
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<213>Homo sapiens
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g 61
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<213>Homo sapiens
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g 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gtttgtccct ttttaaagtt gttggtttaa aatttctctg atacaaaaat agtgacccag 60
g 61
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<213>Homo sapiens
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g 61
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<213>Homo sapiens
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c 61
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<213>Homo sapiens
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c 61
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<213>Homo sapiens
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a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gagctctctg gatagatatt tccattccac tgtcgcatct tcccagcaga gtgtgggtga 60
a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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t 61
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<213>Homo sapiens
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t 61
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<213>Homo sapiens
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t 61
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<213>Homo sapiens
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t 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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g 61
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t 61
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<213>Homo sapiens
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t 61
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<213>Homo sapiens
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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t 61
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<213>Homo sapiens
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t 61
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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g 61
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<213>Homo sapiens
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c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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tagaaataat gtaaatcgat actgctctga tgtttttctt tgtatttact gatcagatat 60
c 61
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<213>Homo sapiens
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t 61
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<213>Homo sapiens
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t 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<213>Homo sapiens
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g 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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t 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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t 61
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<213>Homo sapiens
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t 61
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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c 61
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<213>Homo sapiens
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t 61
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<211>61
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<213>Homo sapiens
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t 61
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<211>61
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<213>Homo sapiens
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c 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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c 61
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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accttaatca gaaatttcca gtttccaaaa gttgtattat actcaggttg gccctaggtt 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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ggaactagag tttctgagag caaggtgaga ggattatgca tgaagacact gggctgtcat 60
c 61
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<213>Homo sapiens
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t 61
<210>156
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>156
ttagaaaata actgagaagt aaagtgtaga tgaaggaaag tgtatattgg taaaagcata 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>157
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<213>Homo sapiens
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t 61
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<213>Homo sapiens
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t 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>160
attctcgttt gaggaagatt ttctaagtca ttaacctgta atcttcctat tacaaccaat 60
t 61
<210>161
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ttctgtttaa caattaatat tttatctgag actattgtgc actgtaattt ttatgaactt 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>162
ttctgtttaa caattaatat tttatctgag cctattgtgc actgtaattt ttatgaactt 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ctaagcagga gtctttcagg actgaaaaaa cgttatgagg ctgttggtga aacttgaatg 60
g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>164
ctaagcagga gtctttcagg actgaaaaaa tgttatgagg ctgttggtga aacttgaatg 60
g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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taagcctagc tgggggagta gaacacatta caattgaaca caaattataa taatgcaagg 60
c 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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agttttaggt gacttcctca aattccccaa tcctaaattc tatttgctta ttttacttct 60
g 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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acagtggaga cttcgtgctc agagaagaga agggaagttt tcttggtccg ccctagtgtt 60
t 61
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<213>Homo sapiens
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acagtggaga cttcgtgctc agagaagaga cgggaagttt tcttggtccg ccctagtgtt 60
t 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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agcaaaggag gtaaatggtg tccttgaaaa tacttgcctg tgagtttctg gatctccatg 60
c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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agcagcacag aattgcaggt ggactcttta cagctattct gttctgctaa caaggagcaa 60
g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gtccctcact ggaacaagat ctgtgagtga tgtaaagctt tctggtaaag gcaaaggaag 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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cacatgtgta gaccctggtc tatgcaagca gcatatattt tctcatttat ttcttaccac 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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t 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ttggtctatt ttggtgaaaa gcagatatta ggcctatttg tccccttcca cagtgtgacc 60
t 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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t 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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tttgatgaca tattctgaga gatgttctga gtattaaata cttggttttg aaaacaagtt 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<213>Homo sapiens
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cgttctgatc aagggctgta agtactagaa tggaagaaca gtgtgctgtg ggaagaaatg 60
g 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<213>Homo sapiens
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tgaaggatct cctgccaggt aaagcaaatg gaacttaaca tatcaacgtt aaagaattga 60
c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>197
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t 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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t 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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t 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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tgtatttaaa aatggggcta attatgccca catcatgatg ggatgaagtg ttgtaaggct 60
t 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>206
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c 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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atctaagtaa ggttagaaat gcttcggcct gtatgacttt ttaacctggt acacttaaac 60
c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>214
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g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>215
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a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gctgtatata atatttgaaa atgacactga gcaagcgaag attacagtgg tttttcttct 60
t 61
<210>221
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>221
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g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>222
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g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>224
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a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>225
acaaataaaa tttcttcttt caatcattcc ataattccct ggggctacag ccactttggt 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>226
acaaataaaa tttcttcttt caatcattcc gtaattccct ggggctacag ccactttggt 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>227
aagttcctat accgtgaagc tggccaaaac agtataatct caatatttac acttaaagtt 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>228
aagttcctat accgtgaagc tggccaaaac ggtataatct caatatttac acttaaagtt 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>229
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t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>230
gccactgcca ccactcctgc agattgttcc cgctgtgtta ctaaatacag gttgcttttc 60
t 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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acttttctca taataaaacc tttattgctc caggtgcctc aaattggttt cgcttaactt 60
g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>234
gtgacctgtc cttgtgactt ggaaaaaatg gcatcatgtt ctgtccgatg tgtttccgct 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>235
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a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>236
cccaaaataa aactctccta ttattgtgac ccttggatgg ccccatccaa cagcaaaatc 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>237
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a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ctgtactttt atatacgcct aatttgttcc gtctcaatga caatattccc cacatctaat 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>239
accccaaaag tggtttataa aacattgact ccacatcact gtagttaacc caaaccaaaa 60
g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>240
accccaaaag tggtttataa aacattgact gcacatcact gtagttaacc caaaccaaaa 60
g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>241
acatcactgt agttaaccca aaccaaaaga ctgtcgcttg acactgagaa aaatcccctc 60
a 61
<210>242
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>242
acatcactgt agttaaccca aaccaaaaga gtgtcgcttg acactgagaa aaatcccctc 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>244
gcagagggat cagagacagc tcgaggagag ggcatattcc atagttcaga gacagcatac 60
c 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>245
tttgcaacca gtgtgcatga aactggagga actcatccta agtgaaatgt caggcataga 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>246
tttgcaacca gtgtgcatga aactggagga cctcatccta agtgaaatgt caggcataga 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>247
tttcaaaatt aattttcaaa tttctactgg acgataacta ataatcattt atttaaaact 60
t 61
<210>248
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>248
tttcaaaatt aattttcaaa tttctactgg gcgataacta ataatcattt atttaaaact 60
t 61
<210>249
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>249
gcaatagaga gaaatgagct tctgaaatgc aaaactatgg attaatttca gaaatattat 60
a 61
<210>250
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>250
gcaatagaga gaaatgagct tctgaaatgc gaaactatgg attaatttca gaaatattat 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>251
tctgctcaac cagttctttt gcttcctctg aattcatcac tgggggcagg aggagtctgc 60
a 61
<210>252
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>252
tctgctcaac cagttctttt gcttcctctg gattcatcac tgggggcagg aggagtctgc 60
a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>253
ttgactttat atggggatgg aggccgcctc aggtagtctt tgcaggagga ctgtgggttt 60
g 61
<210>254
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>254
ttgactttat atggggatgg aggccgcctc gggtagtctt tgcaggagga ctgtgggttt 60
g 61
<210>255
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>255
atagagtagt tatgttttca gcatctccac atgaatgaat agcaatcacc ttgaaaagtg 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>256
atagagtagt tatgttttca gcatctccac gtgaatgaat agcaatcacc ttgaaaagtg 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>257
cctatgcgtg tgcctttctt acctctgaca acatctagtt ccatcttgtt aggaggccta 60
a 61
<210>258
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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cctatgcgtg tgcctttctt acctctgaca gcatctagtt ccatcttgtt aggaggccta 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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aacctgttac tctcgggtgc tctgtggtga atcctttagc aaagcaaatc ccctctgcag 60
g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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aacctgttac tctcgggtgc tctgtggtga ctcctttagc aaagcaaatc ccctctgcag 60
g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gtttccagaa ctctttttgg ccaggctcca agctaagctc tgtaggaagc ttgatgatgg 60
g 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ggccatggct gagttgactg ggttcagatt gtggttcagc agtgtggtct cgggcaagtt 60
g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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acaagttgca gagaaacctt taataattac accagagctg ggcacagtgg ctcacacctg 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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t 61
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<211>61
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<213>Homo sapiens
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a 61
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<213>Homo sapiens
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a 61
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<213>Homo sapiens
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c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ataaccacag atgttctatt tcaagcaatt caaggcatta atctcatact aagtggatcg 60
c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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t 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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t 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>278
agagctatgt tggggaagat ggtgaagcca cgtctaaatt cagcaaataa ataaataaat 60
a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<213>Homo sapiens
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ccggagtatc ccgctttctt tggaggaaac caccgcatca gatctgcgct gcggcagagg 60
c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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tttagtcatg ggcaattagt aagcattaac actcctggtg atttacactg tatttcttag 60
a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>284
tttagtcatg ggcaattagt aagcattaac cctcctggtg atttacactg tatttcttag 60
a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gttctccatg gtactaaccc attctcttca gtaaaagcat agtcagcctg acctatggaa 60
g 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>287
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a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>290
atctggtaaa aattttcata agcattagac gtatcaaact taaaaacaca cacacacaat 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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taagagagcc tctaggttag cgccgctgaa ggagctagtg gaggaggagt gtgagactga 60
g 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>295
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a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>307
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a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gatgttgctg tatcgctcag atctaatgtt ctgtggccca ttttaccatg gtatcactga 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>309
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c 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gtttaaatgt aaaaatttaa attatgagaa gcagttgaca tttcaggttt atattcttaa 60
c 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>311
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g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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atagagcata agaatctata gcataaaaga caatgatgtg aattaacact gcagcatcgc 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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tctaaagtga aagtaaaata gctgagatat gggtgaaaag agagacagat acaagtgtgt 60
g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapi ens
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a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>318
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a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>320
tgtgctgggc acacagtggg tgcctaatgt ctggagaata gagaaagagg atgatggaga 60
a 61
<210>321
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ctccatatcc cctccatccc atgctacccc gatttcagct gctttaagga aaaagatgtt 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>324
aagtttgtaa acattaacca acttctcctc gtctgtcctt ctcatactca ggttcccttc 60
c 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>325
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t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>326
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t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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cttgatttta ttgctaggga ttgtggtaaa gcacccaaag aatgtgggta tgtgcctact 60
t 61
<210>331
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
<210>332
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>332
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a 61
<210>333
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>334
aagtgttaga catcaaactg atgcttgaaa gtgaaaatgt aaagtggtaa aaacttgaat 60
c 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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tagggagcaa caccatggtg gtagagaacc gaagtttatt agcatctcta aactcatata 60
g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>337
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a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>338
aatcacaggc tagactatta gtgaaggtct gttcctacaa tgaacacctg taaaggccaa 60
a 61
<210>339
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>339
tacgcaccag gcagtgaggg aaaaggagca actgaacctc tccccacaca gcaagtgagc 60
c 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>340
tacgcaccag gcagtgaggg aaaaggagca gctgaacctc tccccacaca gcaagtgagc 60
c 61
<210>341
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ctggcaccat gtctgctcca ttcaccatca atgcacatca gagtgacata acctgtgtgt 60
c 61
<210>342
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>342
ctggcaccat gtctgctcca ttcaccatca gtgcacatca gagtgacata acctgtgtgt 60
c 61
<210>343
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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caatgtgagc tgcacattgt aaacaccagc gttattagat gtctgtatcg tttttagcct 60
a 61
<210>345
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
<210>346
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>346
aagagatagg aaaagacaca gagacacaga ggggaatgcc gggtgaagac agaggaaaat 60
a 61
<210>347
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>347
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a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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aactgttttc caaagaggct gtaacatttt gtatacccat gagtgattca ttttctttgc 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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t 61
<210>350
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>350
ccaatcatac accaagaaca tggtcttaca cagtgagggt gtggcaggct tcaccatggt 60
t 61
<210>351
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>351
tggggcctga tgagttgtga ttggcctctg attagagcac agcatagccg aagaagagag 60
t 61
<210>352
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>352
tggggcctga tgagttgtga ttggcctctg gttagagcac agcatagccg aagaagagag 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>353
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g 61
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<211>61
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<213>Homo sapiens
<400>354
ctgtgaaagc agaggctcga gggaccattc gcttttgttt tcttataaat ggtaaaacaa 60
g 61
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<211>61
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<213>Homo sapiens
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agaatcattc tttctccttc ctactccttc atatctgctc agtacaacat cagacaagca 60
t 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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t 61
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<213>Homo sapiens
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t 61
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<213>Homo sapiens
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a 61
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<213>Homo sapiens
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a 61
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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a 61
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<213>Homo sapiens
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a 61
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<213>Homo sapiens
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t 61
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<213>Homo sapiens
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cccttgtatt acacatgaat tattatttgg gaaaactgaa aggctaaaat atcttcagaa 60
t 61
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<213>Homo sapiens
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c 61
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<213>Homo sapiens
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a 61
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<213>Homo sapiens
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a 61
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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g 61
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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g 61
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<213>Homo sapiens
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g 61
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<213>Homo sapiens
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g 61
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t 61
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<213>Homo sapiens
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t 61
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<213>Homo sapiens
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a 61
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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t 61
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<213>Homo sapiens
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t 61
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<213>Homo sapiens
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c 61
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<213>Homo sapiens
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c 61
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<213>Homo sapiens
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a 61
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<213>Homo sapiens
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agaagggaag tataatttca gaggcctggc cataaagcac tggagaaagg atatttggaa 60
a 61
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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a 61
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<213>Homo sapiens
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g 61
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<213>Homo sapiens
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g 61
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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a 61
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<213>Homo sapiens
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t 61
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<213>Homo sapiens
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t 61
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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t 61
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<213>Homo sapiens
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t 61
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<211>61
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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a 61
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<213>Homo sapiens
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a 61
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<213>Homo sapiens
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c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<213>Homo sapiens
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g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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tgtgaatggc tgcttggaac acagtgttga gaaggattcc gaggctgtgt ccaggttcag 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>422
tcaatcttat cccacactct ggtcatacaa ggtttctaag actgctgctt tttctaaatc 60
c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<213>Homo sapiens
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agagacttgg taaacaaacc aactaggccc gaccacaaca tgttgaggct gactttctaa 60
c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gcagatggaa gatgccgggc ttttcatttc gaggactgag taggaaggtt aatgatggaa 60
g 61
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<213>Homo sapiens
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c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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tgtgcatcct aaaagcagtg acaggttaga gagaactgtg ctagaattct agctgtatta 60
c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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t 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gacctcagta aatatgttga tggtccagac gaaaatgtgt agataatatc cattcgtgat 60
t 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<213>Homo sapiens
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c 61
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<213>Homo sapiens
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a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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acttttgggt tgtagctgcc tatagctgcc gagtagcccc agggagtagt ggaagggcag 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>437
taccttctgt taaaacttct ttgtctggct aaacccaaaa actttagggg agattgaagt 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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taccttctgt taaaacttct ttgtctggct gaacccaaaa actttagggg agattgaagt 60
a 61
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<211>61
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<213>Homo sapiens
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aagacttttt tttttttttt ggtagaatca acaacttaga tagattgctt actttttcag 60
g 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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aagacttttt tttttttttt ggtagaatca ccaacttaga tagattgctt actttttcag 60
g 61
<210>441
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>441
ggtcagcagg cagagattct gtgacggact aaagctctca agaaaacatc ttaaaacatg 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>442
ggtcagcagg cagagattct gtgacggact gaagctctca agaaaacatc ttaaaacatg 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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caatttgacc ttcttcacag ggctgcttgg aaacctatag agtgatatgg atataactgt 60
g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>445
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c 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>446
atgggctagg ccacaagctc ttctcagctc gatctcacaa ttggcagatt aaccaagacc 60
c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<213>Homo sapiens
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aaaggaaggg tctctccagc ttgtggacaa gagacctaat ggttcccccg gtgaccctct 60
c 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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tacttaagca gcacgtgctc ttcatttcaa gttcagatgt gtcacctccc aactaacaat 60
a 61
<210>451
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>451
cacagctgag ctgtgggagg gcagaagtga aggatctttg aaggaaaaga aagtgaatgg 60
a 61
<210>452
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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cacagctgag ctgtgggagg gcagaagtga gggatctttg aaggaaaaga aagtgaatgg 60
a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gacaggtggc tagataattc tgaggaaaaa atgggaatgt cagtttcatg gagtttcgaa 60
t 61
<210>454
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>454
gacaggtggc tagataattc tgaggaaaaa ttgggaatgt cagtttcatg gagtttcgaa 60
t 61
<210>455
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>455
ttcagatttt ggggtcacac tgcagacacc aggctttctt ttccctccac attttaacat 60
a 61
<210>456
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>456
ttcagatttt ggggtcacac tgcagacacc gggctttctt ttccctccac attttaacat 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>457
cggtgctgca ccgtggatgt gagtccttgc acagtggtga aatgtagtag aggagtgatc 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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cggtgctgca ccgtggatgt gagtccttgc gcagtggtga aatgtagtag aggagtgatc 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gagtgcctgg ctggtgacag gggagaaaag aagaacgggt ctgcaggtgg aaagaggtgt 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>460
gagtgcctgg ctggtgacag gggagaaaag gagaacgggt ctgcaggtgg aaagaggtgt 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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caaggggtag aatctatgga aggaagcgag agcatgtcat aaaatctcag tgagacatta 60
a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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caaggggtag aatctatgga aggaagcgag ggcatgtcat aaaatctcag tgagacatta 60
a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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actctacttc cttcctgttt aactgtacca acttcttccc tctgactcaa attcatgagc 60
t 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ctgctcattg taacaagctt tagcataggc ataggttgat aatggatgta ggcatggggt 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ctgctcattg taacaagctt tagcataggc gtaggttgat aatggatgta ggcatggggt 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ctctattcaa taaatggtgc tgggataatg ggttagacgt atacagaagg gtgaacctgg 60
a 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ctaattctca ccaatggaat gtgtgtggaa ataatgcgtc tccttcaggc tgaggcagtt 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>470
ctaattctca ccaatggaat gtgtgtggaa gtaatgcgtc tccttcaggc tgaggcagtt 60
a 61
<210>471
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>471
aactcttaat aaacattcac tgttcaatgg atagtcatca tagtgattga cactgcatat 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>472
aactcttaat aaacattcac tgttcaatgg gtagtcatca tagtgattga cactgcatat 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>473
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c 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>474
agaaatgcag attctcgggt ccaaccgcca gacttactaa atcagaaacc ctgagaacgg 60
c 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gcttgagcca ccgtgcccag cctcagagtc agtgattttt aagtctccaa ccccaacatg 60
c 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gcttgagcca ccgtgcccag cctcagagtc ggtgattttt aagtctccaa ccccaacatg 60
c 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>477
cccttttctt tcttgttctt tttaagactc aatctcaaat ctgcaaccta cctaccataa 60
g 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>478
cccttttctt tcttgttctt tttaagactc gatctcaaat ctgcaaccta cctaccataa 60
g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>479
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a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>480
acacatgctt aatatgaatg ctttaatcaa ttcataatca gatggtactt gccctaccta 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>481
ttggattggt actttccatt accaactgat agcttttaga ccattgtcca aattacccat 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>482
ttggattggt actttccatt accaactgat tgcttttaga ccattgtcca aattacccat 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<213>Homo sapiens
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tgaggctgtc ttgagacttg actgatagaa gcgcccagtg aactgtgaaa gctccagcag 60
c 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>485
cttttttcta tttctttcct ttctacatac ataacacaga tcacacatat atatccatac 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>486
cttttttcta tttctttcct ttctacatac gtaacacaga tcacacatat atatccatac 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>487
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t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>488
agactatgct tttttcattg aatcgccttt gtgtgttttt cataaatcag ttgactacat 60
t 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gtcactcagt gagcaagagg ttgatttttt aaacttcatg acaactatga cattatgctg 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gtcactcagt gagcaagagg ttgatttttt gaacttcatg acaactatga cattatgctg 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>491
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g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>492
gaataacaga agaatgcaca cacattccaa gtaagggcct ttctcacaaa cacatcagaa 60
g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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atagatgtag tatccagttc tgatgtcagg gttagagaaa ttatctttgg ctaaggttat 60
c 61
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>497
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a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>498
ggaggaggta gcttgaacta ggatgacggc ggtgggaata aaaagagttg gatgaattca 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>499
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a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>502
aatatatcaa agacatgtag ctaaaaagat cttcctacat cctcactggt gaacacaaag 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ataaatactc tctggaaaaa tctaccttca atctaggcct tgaacagctc acacagataa 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>504
ataaatactc tctggaaaaa tctaccttca gtctaggcct tgaacagctc acacagataa 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>505
gagacattca gtcttgtctt aagtcatata ctagctatcc aacttagaga atgtctcaaa 60
t 61
<210>506
<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>506
gagacattca gtcttgtctt aagtcatata gtagctatcc aacttagaga atgtctcaaa 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>507
acagcaaaag cagatggaag ggaggttaat attatgacat aggaaataat gtagtatcaa 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>508
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t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>509
tctcttttcc tggaaactcc accaggaagc agtgccatag accccaaaga catccaggtc 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>510
tctcttttcc tggaaactcc accaggaagc cgtgccatag accccaaaga catccaggtc 60
a 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>511
gcctatgggc tgccttcctg aaaactatct agcttgtggt tacatgaagc cagagtccac 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>512
gcctatgggc tgccttcctg aaaactatct ggcttgtggt tacatgaagc cagagtccac 60
t 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gcaaacagat gaattcagcc cctccaaacc aagcgcggag cgcgctgctt ttgtgcgcca 60
g 61
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<211>61
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gcaaacagat gaattcagcc cctccaaacc gagcgcggag cgcgctgctt ttgtgcgcca 60
g 61
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<211>50
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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cagacttctt gaatgtatcc ccagttaaca gcacagcgtt tatctagcag 50
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<211>50
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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<211>50
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>518
tgagttagtt actccaggag tgggttcctg gtaaaatggt aggtttagta 50
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<211>50
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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tgatgctctt cagtgaaggt atctaagtaa ggttagaaat gcttcggcct 50
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<211>50
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>520
taggctctcc tgttagactg catgggctcc agttctggct ccagcagtga 50
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<211>50
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>521
aaaattcccc cagattgaaa gcaaaaccag taaatctaac tgcaattgtg 50
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<211>50
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>522
tcaatcagac ctcccagggt ttcagatggg tagaagctgc tctcagaaag 50
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<211>50
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gaggatcatt ctcttgaaga aagaagaaaa accactgtaa tcttcgcttg 50
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<211>50
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>524
attcagtttg ctaaaggccc attagccatg aacactaaag aaatagcctg 50
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<211>50
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gaggaggttc tctttttagc tgattcctca taaaaggata agatttagct 50
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>526
gtaggaacgt atctatacaa taccaaagtg gctgtagccc cagggaatta 50
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>527
aaagatctta tcaaagcttc aagttcctat accgtgaagc tggccaaaac 50
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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gtggttccat ggaatttccc acttttctca taataaaacc tttattgctc 50
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gtgagtcctg ggtgcacttg tgacctgtcc ttgtgacttg gaaaaaatgc 50
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ttaaaaaata gtgtttggcc tgattttgct gttggatggg gccatccaag 50
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>532
ctattataat gctactcaac ctgtactttt atatacgcct aatttgttcc 50
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>533
cagacttctt gaatgtatcc ccagttaaca gcacagcgtt tatctagcac 50
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>534
tgagttagtt actccaggag tgggttcctg gtaaaatggt aggtttagtt 50
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>535
gtgagtcctg ggtgcacttg tgacctgtcc ttgtgacttg gaaaaaatgg 50
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>536
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>537
tttataaaac attgactcca catcactgta gttaacccaa accaaaagac 50
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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aaaaaaggga aatcctgcca tttgcaacca gtgtgcatga aactggagga 50
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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agaatttggt gaatgaatct tttcaaaatt aattttcaaa tttctactgg 50
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<211>50
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>541
tcataggatg ggagtactca gcaatagaga gaaatgagct tctgaaatgc 50
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<211>50
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>542
gctatgttag aagggtgtct tctgctcaac cagttctttt gcttcctctg 50
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<211>50
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>543
taaatctggg aggtcagttt ttgactttat atggggatgg aggccgcctc 50
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<211>50
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>544
ggtggattca gttgcataac tcacttttca aggtgattgc tattcattca 50
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<211>50
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ctcctcagaa acaagagcca ttaggcctcc taacaagatg gaactagatg 50
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<211>50
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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acctgccttg acacgccatg aacctgttac tctcgggtgc tctgtggtga 50
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ggctggggct gcagcctagt cccatcatca agcttcctac agagcttagc 50
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<213>Homo sapiens
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ctgacagcct aggggacagg gccatggctg agttgactgg gttcagattc 50
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ctggagacac tgctaagagt acaagttgca gagaaacctt taataattac 50
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
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ggtaccagag atgagaactt caacattatc tttctgaggg atacaactca 50
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<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>551
ttgtgtcagc atgtcttgga gcgatccact tagtatgaga ttaatgcctt 50
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<211>50
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>552
cagttattgc cccaggttct ttttcataag acattatact ctagccatga 50
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<211>50
<212>DNA
<213>Homo sapiens
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gtgctgtgag attctgctgg atgggggcag ctgatgaccc tttgctcctc 50
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<213>Homo sapiens
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tcggggtaac ctcttggcat cagttacatg ttggatcaca gtgaggttgt 50
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<211>50
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<213>Homo sapiens
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gataaatagt ggatgcctga agagctatgt tggggaagat ggtgaagcca 50
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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Claims (34)
1.是否存在青光眼风险的判定方法,该方法包括以下步骤:
步骤A:在来自受检者的样品中,在体外检测存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的等位基因和/或基因型的步骤,所述核苷酸序列为:选自SEQ ID NO:203~514所示的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列;以及
步骤B:将上述步骤A中检测到的等位基因和/或基因型与SEQ IDNO:203~514所示的核苷酸序列中包含高风险等位基因的至少一个等位基因和/或基因型进行比较的步骤;
当上述步骤A中检测到的等位基因为上述高风险等位基因时,判定存在青光眼风险;或者,当上述高风险等位基因符合显性遗传模型、且上述步骤A中检测到的基因型为包含上述高风险等位基因的基因型的纯合子或杂合子时,判定存在青光眼风险;当上述高风险等位基因符合隐性遗传模型、且上述步骤A中检测到的基因型为包含上述高风险等位基因的基因型的纯合子时,判定存在青光眼风险。
2.权利要求1所述的判定方法,其中青光眼风险为青光眼的发病风险。
3.权利要求2所述的判定方法,其中核苷酸序列选自SEQ ID NO:203~238所示的核苷酸序列。
4.权利要求3所述的判定方法,其中,选择SEQ ID NO:203~238所示的核苷酸序列中包含高风险等位基因的任意的两个以上等位基因和/或基因型并组合起来,进行步骤B中的比较;当上述步骤A中检测到的等位基因为上述步骤B中为了比较而选择的上述任一个等位基因时,判定存在青光眼风险;或者,当上述高风险等位基因符合显性遗传模型、且上述步骤A中检测到的基因型为上述步骤B中为了比较而选择的上述任一个基因型的纯合子或杂合子时,判定存在青光眼风险;当上述高风险等位基因符合隐性遗传模型、且上述步骤A中检测到的基因型为上述步骤B中为了比较而选择的上述任一个基因型的纯合子时,判定存在青光眼风险。
5.权利要求4所述的判定方法,其中,选择SEQ ID NO:203~238所示的核苷酸序列中包含高风险等位基因的所有等位基因和/或基因型并组合起来,进行步骤B中的比较;当上述步骤A中检测到的等位基因为上述步骤B中为了比较而选择的上述任一个等位基因时,判定存在青光眼风险;或者,当上述高风险等位基因符合显性遗传模型、且上述步骤A中检测到的基因型为上述步骤B中为了比较而选择的上述任一个基因型的纯合子或杂合子时,判定存在青光眼风险;当上述高风险等位基因符合隐性遗传模型、且上述步骤A中检测到的基因型为上述步骤B中为了比较而选择的上述任一个基因型的纯合子时,判定存在青光眼风险。
6.权利要求2所述的判定方法,其中进一步包括预测发病风险的高低的步骤。
7.权利要求1所述的判定方法,其中青光眼为:原发性隅角开放型青光眼简称POAG或正常眼压青光眼简称NTG。
8.是否存在青光眼风险的判定方法,该方法包括以下步骤:
步骤C1:在来自受检者的样品中,在体外检测存在于核酸分子中的如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的等位基因和/或基因型的步骤,所述核酸分子包含选自SEQ ID NO:203~514所示的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列;或
步骤C2:使用含有核苷酸序列的核酸分子,在体外检测上述单核苷酸多态性的等位基因和/或基因型的步骤,所述核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:515~694所示的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列;以及
步骤D:将上述步骤C1或C2中检测到的等位基因和/或基因型与至少一个核酸分子进行比较的步骤,上述核酸分子含有SEQ IDNO:203~514所示的核苷酸序列中包含高风险等位基因的等位基因和/或基因型;
当上述步骤C1或C2中检测到的等位基因为上述高风险等位基因时,判定存在青光眼风险;或者,当上述高风险等位基因符合显性遗传模型、且上述步骤C1或C2中检测到的基因型为包含上述高风险等位基因的基因型的纯合子或杂合子时,判定存在青光眼风险;当上述高风险等位基因符合隐性遗传模型、且上述步骤C1或C2中检测到的基因型为包含上述高风险等位基因的基因型的纯合子时,判定存在青光眼风险。
9.权利要求8所述的判定方法,其中青光眼风险为青光眼的发病风险。
10.权利要求9所述的判定方法,其中上述步骤C1和D中的核苷酸序列选自SEQ ID NO:203~238所示的核苷酸序列;或者,上述步骤C2中的核苷酸序列选自SEQ ID NO:515~535所示的核苷酸序列。
11.权利要求10所述的判定方法,其中,选择任意的两个以上核酸分子并组合起来,进行步骤D中的比较,所述核酸分子含有SEQID NO:203~238所示的核苷酸序列中包含高风险等位基因的等位基因和/或基因型;当上述步骤C1或C2中检测到的等位基因为上述步骤D中为了比较而选择的上述任一个核酸分子中的高风险等位基因时,判定存在青光眼风险;或者,当上述高风险等位基因符合显性遗传模型、且上述步骤C1或C2中检测到的基因型为上述步骤D中为了比较而选择的上述任一个核酸分子中的基因型的纯合子或杂合子时,判定存在青光眼风险;当上述高风险等位基因符合隐性遗传模型、且上述步骤C1或C2中检测到的基因型为上述步骤D中为了比较而选择的上述任一个核酸分子中的基因型的纯合子时,判定存在青光眼风险。
12.权利要求12所述的判定方法,其中,选择所有核酸分子并组合起来,进行步骤D中的比较,所述核酸分子含有SEQ ID NO:203~238所示的核苷酸序列中包含高风险等位基因的等位基因和/或基因型;当上述步骤C1或C2中检测到的等位基因为上述步骤D中为了比较而选择的上述任一个核酸分子中的高风险等位基因时,判定存在青光眼风险;或者,当上述高风险等位基因符合显性遗传模型、且上述步骤C1或C2中检测到的基因型为上述步骤D中为了比较而选择的上述任一个核酸分子中的基因型的纯合子或杂合子时,判定存在青光眼风险;当上述高风险等位基因符合隐性遗传模型、且上述步骤C1或C2中检测到的基因型为上述步骤D中为了比较而选择的上述任一个核酸分子中的基因型的纯合子时,判定存在青光眼风险。
13.权利要求9所述的判定方法,其中进一步包括预测发病风险的高低的步骤。
14.权利要求8~13中任一项所述的判定方法,其中使用核酸分子作为探针。
15.权利要求14所述的判定方法,其中核酸分子为23碱基~55碱基。
16.权利要求14所述的判定方法,其中探针被固定化。
17.权利要求8所述的判定方法,其中青光眼为:原发性隅角开放型青光眼简称POAG或正常眼压青光眼简称NTG。
18.判定是否存在青光眼风险的试剂盒,该试剂盒含有下述核酸分子:包含选自SEQ ID NO:203~514所示的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列或它们的部分序列的核酸分子,该核酸分子包含存在于各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性;和/或含有核苷酸序列的核酸分子,所述核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:515~694所示的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列;该试剂盒用于在体外检测在来自受检者的样品中上述单核苷酸多态性的等位基因和/或基因型。
19.权利要求18所述的试剂盒,其中青光眼风险为青光眼的发病风险。
20.权利要求19所述的试剂盒,其中核苷酸序列选自SEQ ID NO:203~238所示的核苷酸序列、和/或选自SEQ ID NO:515~535所示的核苷酸序列。
21.权利要求20所述的试剂盒,其中含有任意的两个以上核酸分子,所述核酸分子为:包含SEQ ID NO:203~238所示的核苷酸序列或其互补序列或它们的部分序列的核酸分子、和/或包含SEQ IDNO:515~535所示的核苷酸序列或其互补序列的核酸分子。
22.权利要求21所述的试剂盒,其中含有所有的核酸分子,所述核酸分子为:包含SEQ ID NO:203~238所示的核苷酸序列或其互补序列或它们的部分序列的核酸分子、和/或包含SEQ ID NO:515~535所示的核苷酸序列或其互补序列的核酸分子。
23.权利要求19所述的试剂盒,该试剂盒用于进一步进行发病风险高低的预测。
24.权利要求18~23中任一项所述的试剂盒,其中使用核酸分子作为探针。
25.权利要求24所述的试剂盒,其中核酸分子为23碱基~55碱基。
26.权利要求24所述的试剂盒,其中探针被固定化。
27.权利要求18所述的试剂盒,其中青光眼为:原发性隅角开放型青光眼简称POAG或正常眼压青光眼简称NTG。
28.是否存在青光眼风险的判定方法,该方法包括以下步骤:
步骤(i):从来自受检者的样品中提取核酸分子的步骤;
步骤(ii):对于上述步骤(i)中提取的核酸分子,检测存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的等位基因的步骤,所述核苷酸序列为选自SEQ ID NO:203~514所示的核苷酸序列或其互补序列的至少一个核苷酸序列;
步骤(iii):根据上述步骤(ii)中检测到的等位基因判定是否存在青光眼风险的步骤。
29.权利要求28所述的判定方法,其中步骤(iii)包括:根据上述步骤(ii)中检测到的等位基因来确定基因型的步骤。
30.权利要求28或29所述的判定方法,其中步骤(iii)包括:判定上述步骤(ii)中检测到的等位基因是否是高风险等位基因的步骤。
31.权利要求30所述的判定方法,其中步骤(iii)包括:当上述步骤(ii)中检测到的等位基因为高风险等位基因时,判定青光眼风险高的步骤。
32.核酸分子在判定青光眼风险中的应用,所述核酸分子包含选自SEQ ID NO:203~514所示的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列、或它们的部分序列,并且包含存在于上述各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的等位基因和/或基因型。
33.青光眼的诊断方法,该方法包括以下步骤:
步骤E:在来自受检者的样品中,在体外检测存在于如下各核苷酸序列的第31位的单核苷酸多态性的等位基因和/或基因型的步骤,所述核苷酸序列为选自SEQ ID NO:203~514所示的核苷酸序列的至少一个核苷酸序列或其互补序列;以及
步骤F:将上述步骤E中检测到的等位基因和/或基因型与SEQ IDNO:203~514所示的核苷酸序列中包含高风险等位基因的至少一个等位基因和/或基因型进行比较的步骤;
当上述步骤E中检测到的等位基因为上述高风险等位基因时,诊断为青光眼;或者,当上述高风险等位基因符合显性遗传模型、且上述步骤E中检测到的基因型为包含上述高风险等位基因的基因型的纯合子或杂合子时,诊断为青光眼;当上述高风险等位基因符合隐性遗传模型、且上述步骤E中检测到的基因型为包含上述高风险等位基因的基因型的纯合子时,诊断为青光眼。
34.青光眼发病风险的判定方法,该方法包括以下步骤:
步骤(I):使用权利要求3所述的判定方法,判定是否存在青光眼发病风险的步骤;
步骤(II):在上述步骤(I)中,当根据至少任一个单核苷酸多态性判定存在发病风险时,判定需要进行进一步的风险判定的步骤;
步骤(III):在上述步骤(II)中,当判定需要进行进一步的风险判定时,使用权利要求5所述的判定方法,进一步判定是否存在青光眼发病风险的步骤。
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