CN103764846A - 用于路易体痴呆的诊断的遗传标志物 - Google Patents

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Abstract

发现了在BChE基因中的特异多态性，其允许确定患者是否患有路易体痴呆（DLB），并且允许区分路易体痴呆与阿尔茨海默病。本发明提供了一种用于DLB的诊断的体外方法，其包括确定来自被试者生物样品内的在丁酰胆碱酯酶（BChE）基因中的以下多态性的基因型：在NCBI登录号NG_009031（即SEQ ID NO:1）内的位置3687处的多态位点，在SEQ ID NO:1内的位置4206处的多态位点，在SEQ ID NO:1内的位置4443处的多态位点，以及在NCBI登录号NG_009031内的位置68974（即SEQ ID NO:26内的位置934）处的多态位点。

Description

用于路易体痴呆的诊断的遗传标志物
本发明涉及医学领域，而且特别涉及神经退行性疾病。其特别地涉及用于路易体痴呆的诊断的标志物。
背景技术
路易体疾病包括一组以存在称为路易体（LB）的蛋白质神经元内含物为特征的疾病。临床上，两种疾病可以被区别：帕金森病（PD）和路易体痴呆（DLB）。而PD是在老年人中最常见的进行性运动障碍，DLB是在阿尔茨海默病（AD）后第二最常见的痴呆原因。尽管LB在几乎每个脑区域的普遍分布是DLB的典型特征，但是在PD中黑质是最受影响的。
当第一次描述DLB时，DLB被认为是很少发生的疾病，但是经过过去几年的认真调查发现其占尸检病例的10%到15%。主要DLB症状包括波动性认知缺损（fluctuating cognitive impairment）、复发性视幻觉和帕金森病，但尽管如此，许多AD重叠症状导致DLB时常发生误诊。因为AD和DLB患者可能在对药物治疗的反应和预后上有差别，所以提高诊断DLB的准确性是重要的。
为了获得DLB和AD之间的更好的临床区别，在过去的几年中进行了各种纵向和比较研究。具有仅路易体（LB）病理的患者比具有仅AD病理或AD/LB混合病理的患者表现相对较不严重的缺损，但表现更显著的执行功能和注意力的衰退。而且，DLB患者比AD患者出现较慢的识别记忆的下降，却具有更多的精神症状，在AD中，这种症状学在疾病后期阶段被观察到。最后，在早期痴呆症中存在的视幻觉已被显示是DLB最特异的。值得一提的是，虽然实现了临床诊断的高特异性（在不同研究中范围从90%到99%），但其灵敏性仍然相对较低（18%到83%）。因此，在1996年制定的第一个用于可能的及潜在的DLB的临床诊断的一致指导方针已被修订以改善DLB诊断的灵敏性，但是尽管如此，许多AD重叠症状导致DLB时常发生误诊的病例在40%到80%之间。
对于DLB低诊断灵敏性的主要原因来自除LB相关病理之外还表现AD特征性变化的病例升高的百分率。为了评估这种结合病理的类型，第三DLB国际性协议（third DLB consortium）提出将AD相关病理放入LB病理背景中的模型。AD型病理的阶段越高，实现DLB的正确诊断的灵敏性越低。相应地，最近的报告证实随着AD伴随病理的增加DLB的误诊增多，但即使如此，仅约52%的患者在低AD病理阶段接受了DLB的正确诊断。
DLB的治疗是针对症状的而且是基于有限数量的临床试验和来自在AD中的试验结果的推广。现在AD治疗由以下组成：使用胆碱酯酶抑制剂通过增加脑中乙酰胆碱水平或强化神经细胞对乙酰胆碱的应答方式来改善乙酰胆碱的功效。而且，神经安定药物被用来减少在疾病过程中通常出现的精神病症状。与此相反，为治疗DLB使用神经安定药可在约50%的DLB患者中引起不良反应而且可引起死亡。
因此，在AD和DLB之间的差别诊断的能力将不仅对接受治疗的个体患者非常有利，而且对于公共卫生系统的经济压力非常有利。然而，目前，精确区分AD和DLB仅是通过验尸分析脑组织可能的。
如今，DLB的诊断是基于遵循DLB国际研讨会上通过国际性协议（theConsortium on DLB International Workshop）制定的指导方针的症状和特征的临床评定（I.G.McKeith,"Consensus guidelines for the clinical andpathologic diagnosis of dementia with Lewy bodies(DLB):report of theConsortium on DLB International Workshop",J.Alzheimer's Dis.2006,第9卷，第417-23页），但正如上文所述，其导致DLB的误诊。类似正电子断层扫描（PET）和单光子发射计算机断层扫描(SPECT)的影像方法是可用的，但是它们的灵敏性不是非常高而且其用于常规临床应用是非常昂贵的。早期明确的诊断将会给减缓或终止疾病进展提供治疗余地。
已存在寻找精确地鉴定DLB患者的遗传标志物的一些尝试。遗传测试将是一个非常实用的工具而且在DLB的预验诊断（pre-mortemdiagnosis）的日常临床实践中容易进行。在这个意义上，为了找到与DLB有关系所研究的一些蛋白质和基因是α-7烟碱乙酰胆碱受体亚基、骨桥蛋白、一氧化氮合酶、泛素羧基末端水解酶L1基因、BDNF基因、或β-突触核蛋白基因。已对其中的许多在实验水平在脑样品中进行了研究，而且因为难以获得患者脑活组织检查其在实际临床诊断中并不实用。
丁酰胆碱酯酶（BChE）是在肝脏中合成的糖蛋白酶。在人脑中其主要发现于神经胶质、特别是皮层结构和皮层下结构，但其也发现于神经元中首先是牵涉认知功能的神经元中。在AD患者中，BChE发现于淀粉状蛋白斑、以及神经原纤维缠结中。此酶作为有机磷化合物和氨基甲酸酯类化合物的解毒酶，并水解琥珀酰胆碱、阿司匹林及可卡因。在人脑中BChE的功能尚不十分清楚，但当乙酰胆碱酯酶(AChE)减少或缺乏时已知BChE水解乙酰胆碱(Ach)。BChE是确定呼吸暂停易感性的标志物。目前发现了定位在3号染色体（3q26.1-q26.2）上的BChE基因的65个变体（参考F.Parmo-Folloni等人，"Two new mutations of the human BCHE gene(IVS3-14T>C and L574fsX576)",Chemico-Biological Interactions2008，第175卷，第135-7页）。
BChE基因的外显子4内的突变A539T的存在以Werner Kalow的名义被命名为K变体。K-变体与在DNA序列（NCBI登录号NG_009031）中的位置68974处相应的mRNA的核苷酸1615处的从鸟嘌呤到腺嘌呤的DNA转换关联，其导致氨基酸从539处的丙氨酸变成苏氨酸。
K-变体位于蛋白质的羧基末端，一方面负责其四聚体化，另一方面负责β-淀粉样原纤维形成的减弱。在血清中BChE K变体负责血清BChE活性水平的1/3减少。虽然在脑中主要的BChE功能仍未知，但是K-变体似乎减小β-淀粉样原纤维形成的减弱的速度，而加速AD进展。与此相反，携带至少一个K-等位基因的AD患者中tau蛋白是较少磷酸化的，说明了AD的保护性机制。
许多研究调查了在BChE基因、特别是BChE K变体与AD之间的潜在关联。详述了AD的主要已知遗传风险因子载脂蛋白E基因（ApoE4）的ε4等位基因和BChE基因变体的共出现影响AD病理。一些报告证明了在被试者中随着BChE野生型和ApoE4基因型的结合增加了患AD的风险。其他的报告发现BChE K和ApoE4的结合增加了患AD的风险。证明了AD中的认知下降的进展受到了BChE基因型的影响。然而，由于BChE K变体既不是AD的风险因子也不是AD的进展标志物，关于BChE K变体的作用没有明确的结论。
也研究了BChE K基因型和DLB之间的可能关联。Singleton等人（A.B.Singleton等人，"Butyrylcholinesterase K:an association with dementia withLewy bodies",Lancet1998，第351卷，第1818页）报告了与对照相比DLB中纯合的BChE K携带者的频率增加。最近的研究发现与PDD患者相比DLB患者中BChE K和ApoE4的频率增加（R.Lane等人，"BuChE-K andAPOE epsilon4allele frequencies in Lewy body dementias,and influence ofgenotype and hyperhomocysteinemia on cognitive decline",Mov.Disord.2009，第24卷，第392-400页）。基于比PDD被试者更高百分率的DLB被试者具有附加AD型病理的前提，而且附加AD型病理导致更快的认知下降，作者推断出这种基因型可能在LBD中痴呆的起始和进展中具有重要的作用。然而，最近的研究表明在BChE K变体与痴呆的DLB表型间之间无显著关联（参见W.Maetzler等人，"No differences ofbutyrylcholinesterase protein activity and allele frequency in Lewy bodydiseases",Neurobiol.Dis.2009，第35卷，第296-301页）。
因此，有必要提供准确鉴别患者患有路易体痴呆并且与阿尔茨海默病相区分的工具（means），以应用到平常的临床实践中。
发明概述
本发明人发现了在BChE基因中的特定多态性，其允许确定患者是否患有路易体痴呆DLB，并且允许区分路易体痴呆与阿尔茨海默病。
现有技术水平中有资料想要发现BChE K变体与DLB之间的关联，但是如下文所解释的，最近的研究认为无显著关联（参见W.Maetzler等人，上）。令人惊奇地，本发明的发明人发现，从BChE基因中K变体基因型与另外三个多态性的基因型的共出现获得了用于DLB诊断的特别信息。因此确定这些基因型有助于区分DLB与AD，这两个基因型组成用于DLB的特异遗传标志物。
因此，本发明人观察到，基因型的组合导致鉴别患有DLB的患者组，且区分DLB与AD。此组合由以下多态位点的基因型形成：在NCBI登录号NG_009031内的位置3687、4206和4443（即在SEQ ID NO:1内的位置分别为3687、4206和4443）处的多态位点、以及在NCBI登录号NG_009031内的位置68974（即在SEQ ID NO:26内的位置934）处的多态位点。
在BChE核苷酸序列内的多态性的位置是从相应于启动子和基因的NCBI登录号NG_009031核苷酸序列产生。该序列公开于2010年1月31日。
多态位点3687、4206和4443是在启动子区。有关这些位点，还参见SEQ ID NO:1，其相应于在NCBI中BChE的完整序列的从核苷酸1处到核苷酸5040的序列。有时所用的核苷酸的可能编号采用转录起点作为位置1且因此，该位置上游的核苷酸为负的位置。转录起始位置1处相应于NG_009031内的位置5001处。在本说明书中所用的编号和所述“负的”编号间的对应关系，在此处给出：
A3687G相应于A-1314G
A4206G相应于A-795G
C4443T相应于C-558T
在位置68974处的多态位点是在NG_009031的编码区。从NG_009031的位置68041处到位置70020的区域被包括为SEQ ID NO:26。单独用此区域，核苷酸被重新编号，所以因此，在完整基因序列中的位置68974变成SEQ ID NO:26内的位置934。此多态性与导致K变体的BChE外显子4内的氨基酸变化相关。由于不同的序列编号，文献中有关此多态性也用到的位置是1615（相对于编码无信号肽的成熟BChE蛋白的mRNA序列而言）。
如下面实施例中描述的，未发现在独立评估的BChE基因中的4个多态性的每一个和DLB间的特异关联；但是令人惊奇地，这些多态性的组合产生了用于DLB的特异信息。
因此，本发明的一方面提供了一种用于DLB的诊断的体外方法，其包括确定来自被试者的生物样品内的在丁酰胆碱酯酶（BChE）基因中的以下多态性的基因型：在NCBI登录号NG_009031（即SEQ ID NO:1）内的位置3687处的多态位点，在SEQ ID NO:1内的位置4206处的多态位点，在SEQ ID NO:1内的位置4443处的多态位点，以及在NCBI登录号NG_009031内的位置68974（即SEQ ID NO:26内的位置934）处的多态位点。
如下面实施例中显示的，分析了AD（n=26）、纯DLB（n=12）、普通DLB（n=24）以及对照（n=23）的验尸样品，以及从223个AD被试者和160个对照被试者获得的临床诊断的样品。结果，描述了两个有关的基因型组合（genotypic combinations）。
遗传标志物中的一个是基因型组合AAAGCCK+。其是由以下多态位点的特定基因型构成：在位置3687（此位点处两个等位基因均含有腺嘌呤）、位置4206（一个等位基因含有腺嘌呤且另一个等位基因含有鸟嘌呤）、位置4443（两个等位基因均含有胞嘧啶）以及位置68974（两个等位基因中的至少一个含有腺嘌呤）处的多态位点。在痴呆患者中的此基因型组合的确定作为提供DLB的临床诊断的鉴别诊断标志物但其也可作为用于无症状个体的DLB早期诊断标志物。
在另一个实施方案中，本发明涉及为AAAAC+KW的基因型组合的遗传标志物。其是由以下多态位点的特定基因型构成：在位置3687（此位点处的两个等位基因均含有腺嘌呤）、位置4206（此位点处的两个等位基因均含有腺嘌呤）、位置4443（此位点处的两个等位基因中的至少一个含有胞嘧啶）以及位置68974（一个等位基因含有腺嘌呤且另一个等位基因含有鸟嘌呤）处的多态位点。在痴呆患者中的此基因型组合的确定作为提供DLB的临床诊断的鉴别诊断标志物但是其也可作为用于无症状个体的DLB早期诊断标志物。
有利地，在DLB的极大异质性内且根据本实施例，本发明的方法允许区别检测DLB病例中的30%到60%，这些病例否则将被诊断为AD。在临床实践中难以诊断的这部分患者，将会从疾病起始时接受正确的诊断。此疾病的特异性为96.8%。其代表了用于DLB的第一个特异标志物。
直到现在，现有技术中的可用的工具不允许在临床实践中DLB的特异性鉴定。这样，当被试者被诊断为AD时，其受到用神经安定药物治疗，这是对AD中精神病症状的最适当的治疗但多于50%的DLB患者对这种类型的治疗表现不良反应，在许多病例中导致死亡。本发明的方法是重要的，因为其使医学界能够为患有DLB的患者施用适当的治疗而没有不适当治疗的风险。因此，本发明方法的应用，增加了用于DLB诊断的特异性，此外将减少用神经安定药治疗的不良反应引起的死亡。
而且，因为本发明的方法允许患有DLB的患者的特异性诊断，有可能在临床试验中包括确定的患者组。
就“诊断”来说在医学上是指由疾病或病症表面的病征、症状以及潜在的生理/生化原因来识别其的动作或过程。
就“确定基因型”来说在本说明书中是指鉴别指定位置处的核苷酸。
在本说明书中“在一个等位基因中的指定核苷酸”是指被试者对于该基因中的该核苷酸是杂合子，而“在两个等位基因中”，其对于该核苷酸是纯合子。
根据本发明，该方法包括确定BChE基因上的指明的多态性，但还包括用所述多态性确定连锁不平衡中的多态性，这将给出相同的信息。在群体遗传学中，连锁不平衡是在两个或更多基因座处的等位基因的非随机关联，这些基因座不一定在同一条染色体上。
根据本发明的诊断方法，DLB的分析将如下：具有痴呆的疑似发作和/或具有不确定的临床家族性评估的患者将通过确定上述BChE基因的多态性的遗传测试被诊断。在检测到DLB特定基因型的情况下，将无需另外的测试或试验即可正确诊断DLB。基因分型的直接应用表示了在日常临床实践中的重要金钱节约。
本发明的方法可用于下述的疑似诊断：可能的（probable）AD对潜在的（possible）DLB；潜在的AD对可能的DLB；潜在的AD对潜在的DLB；可能的AD对可能的DLB；可能的AD对潜在的AD；潜在的DLB；以及可能的DLB。医师基于覆盖个人病史和家族病史，结合任何神经学上的、精神病学的以及实验室实施的测试的结果的完整的病人会诊诊断潜在的AD。当患者主诉记忆衰减的逐渐进展，且医师未能发现任何其他能够解释记忆丧失的病症时，医师很可能认为是AD。医师将会寻找以下疾患：例如抑郁或甲状腺功能减退、中风引起的神经损伤、或能促成记忆丧失的任何药物治疗。不能发现任何有助症候导致确定AD是潜在的。可能的AD是在潜在的阿尔茨海默病后的下一步并且意味着医师“相对地肯定”患者患有该疾病。
有利地，本发明的方法允许DLB的诊断而无需通过类似活组织检查的侵袭性方法获得样品；所述活组织检查在这种情况下为脑组织显微活检。本发明的遗传测试方法，因为其可应用到身体的任何细胞类型，所以可对取自被试者的任何生物样品进行。特别地，血液、上皮细胞、以及任何其他在本领域已知的细胞样品的可能来源，能用作本发明方法中的样品。
在另一个实施方案中，基因型的确定通过选自由以下组成的组的技术中的一个进行：引物特异性多重PCR随后检测（primer-specific PCRmultiplex followed by detection）、多重等位基因特异引物延伸、基于微阵列的方法以及动态等位基因特异性杂交。在一个特别的实施方案中，其通过引物特异性多重PCR随后检测进行。可选地，可进行个体PCR扩增反应以对不同多态位点以及K变体的基因型进行扩增。
聚合酶链式反应（PCR）是应用最广泛的核酸体外扩增方法。PCR可以是实时PCR，其中通过标记探针检测靶基因型的存在几乎是与扩增同时的。
可以通过以下方法进行靶多态性的扩增：引物特异性多重PCR随后是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、通过遗传分析仪分析、或通过特异探针杂交检测。另外，可进行各种PCR反应，随后是琼脂糖凝胶电泳、测序、或特异探针杂交。优选地，特异探针可被固定在微阵列中。
基因型的确定可通过等位基因特异引物延伸（ASPE）进行。这是一种序列特异性酶促反应技术，其可用于在单管中分析多个SNP。ASPE方法包括两个阶段：确定靶基因型的酶促反应；随后为在固体微球表面捕获以检测。利用溶液相动力学，此技术允许使用序列标记的微球来检测新模板。这是在连接到等位基因特异寡核苷酸的适当捕获的序列的帮助下完成的。
任选地，可通过以下进行检测：用任何机理沉积的寡核苷酸制成的DNA生物芯片/微阵列、由光刻或任何其他机理原位合成的寡核苷酸制成的DNA生物芯片。允许在总的人基因组DNA内多重SNP基因分型而不需要靶扩增或复杂性减少的基于微阵列的方法也能被用于BChE多态性的基因分型。这种直接SNP基因分型方法学不需要酶而依赖于金纳米颗粒探针的高灵敏性。特异性来自被等位基因特异的表面固定的捕获探针和基因特异寡核苷酸官能化的金纳米颗粒探针对靶的两次连续寡核苷酸杂交。这种测定形式是简单、快速、且强大的，指出其用于在“医疗点”（point of care）的多重SNP谱分析（multiplex SNP profiling）的适合性。
而且，基因型的确定可通过动态等位基因特异性杂交(DASH)进行，其代表了在一些实验室利用通量SNP基因分型的基础。DASH的核心反应原理是在DNA变性过程中等位基因特异性差别的实时（动态）追踪。为了实现这个，寡核苷酸探针首先被杂交到靶DNA上，基本上所有基因分型方法的必需部分。靶DNA包括固定在固体表面上的PCR产物的一条链、以及使用与靶等位基因中的一个互补的单探针。这种测定概念被证明是非常精确的（大于99.9%的准确）。
在第二方面，本发明提供了用于进行如上限定的方法的试剂盒，其包括用于确定在BChE基因中的多态性的基因型的充足工具。
特别地，试剂盒包括能够产生扩增子的引物，所述扩增子包括在SEQID NO:1的位置3687处、位置4206处以及位置4443处的多态性，以及在SEQ ID NO:26的位置934处的多态性。更特别地，引物由SEQ ID NO:8-19组成，如实施例（表2）中所描述的。用这些引物，获得了四个可由毛细管电泳按大小分离的扩增子。
在一个特别的实施方案中，试剂盒包括用于进行引物特异性多重PCR扩增的充足工具。引物被允许鉴定产生的4个扩增子的不同的荧光团标记。
本发明提供的试剂盒可用来在日常的临床实践中鉴定患有DLB的患者，因此区分所述患者与患AD的其他患者。用本发明的试剂盒，临床医师将能够对患有DLB的患者应用更个体化且风险调整的治疗策略。
在另一个方面，本发明涉及如上限定的试剂盒用于DLB的诊断的应用。
本发明还涉及一种通过分析在BChE基因内的上述多态性的基因型确定被试者是否将对神经安定药治疗作出反应的方法。由于此方法允许确定患者是患有DLB还是AD，给予适当的治疗是可能的。
预期了DLB内的BChE过表达且因此通常的治疗是胆碱酯酶抑制剂的给予。在具有升高的BChE水平的患者，此治疗将会成功。与此相反，携带基因型组合AAAGCCK+或AAAAC+KW的患者将不会对此治疗作出反应。
在整个说明书和权利要求书中，词语“包括（comprise）”和该词语的变化形式，如“包括（comprising）”，并不旨在排除其他技术特征、添加物、组分或步骤。本发明的另外的目的、优势和特征将使本领域技术人员在检查本说明书时变得明白或可通过本发明的实践中获知。而且，本发明覆盖了此处描述的特别的和优选的实施方案的所有可能的组合。下面的实施例和附图通过举例说明的方式提供，且并不应是本发明的限制。
附图简述
图1显示在DLB样品的额皮质中的BChE表达水平。如对基因型组合AAAGCCK+观察到的接近1的表达水平（EL），与对照的表达水平相似。携带作为基因型组合AAAAC+KW的一部分的KW基因型的DLB脑，在额皮质中显示了甚至更低的BChE表达水平。所有既未携带基因型组合AAAGCCK+也未携带基因型组合AAAAC+KW的DLB脑在额皮质中过表达BChE。
实施例
验尸样品（Post-mortem sample）
验尸额皮质样品及其临床和神经病理诊断由巴塞罗那大学神经组织库（Neurological Tissue Bank）和神经病学脑库（Neuropathology Brain Bank）的Bellvitge研究所（BrainNet Europe）根据当地伦理委员会的既定规则协助。其相应于具有普通路易体疾病（cLBD）的24个脑（死亡年龄：79.9，年龄范围从64到90；女性与男性比例1.5:1）、具有纯路易体痴呆（pDLB）的12个脑（死亡年龄：74.4，年龄范围从60到80；女性与男性比例1:2）、26个AD脑（死亡年龄：78.1，年龄范围从61到95；女性与男性比例1:1.1）以及23个对照脑（死亡年龄：68.5，年龄范围从54到83；女性与男性比例1:1.1）。
神经病理检查发现所有AD脑呈现Braak和Braak的AD VI期。Braak和Braak是评估/定量脑中AD的分期。其被神经病理学家用来评估淀粉样蛋白斑和神经原纤维缠结的密度。按照Braak和Braak，AD分期为I-VI：神经原纤维缠结；A-C：淀粉样蛋白斑。cLBD样品中的两个相应于Braak和Braak III期，3个相应于Braak和Braak IV期以及19个剩余样品相应于V和VI期。在pDLB脑中检测到Braak和Braak0到II期并且在对照样品中缺乏AD相关变化。然而AD和对照脑均未显示PD-关联病理，所有pDLB及cLBD样品呈现按照Braak和Braak的分类相应于PD-相关变化的5和6期。
临床诊断样品
从223个在我们医院Germans Trias i Pujol的神经内科依据NINCDS-ADRDA和DSM-IV标准诊断的AD患者（年龄：71.1；年龄范围从49到86岁；女性与男性比例1:1.6）获得血液样品。而且，59个年龄匹配的对照被试者（年龄：68.8；年龄范围从46到91岁；女性与男性比例1:1.5）。
在一个另外试验中，采用了160个年龄匹配的对照被试者的样品（年龄：68.8；年龄范围从46到91岁；女性与男性比例1:1.5）。此研究在医院伦理委员会授权和获得签署知情同意书后进行。
DNA提取
使用TRI试剂依据制造商的说明从冰冻脑样品提取DNA。TRI试剂溶液在单相溶液中合并苯酚和硫氰酸胍以及用于从同一样品连续提取RNA、DNA和蛋白质。经分光光度法确定纯度和浓度后，DNA样品存储于4℃直至使用。依据基于DNA-结合在玻璃滤器膜上的标准程序从血液提取DNA。
BChE启动子测序
因为BChE启动子序列由约5000bp构成，所以3个重叠PCR片段被扩增用于其序列分析。PCR1（引物BChEprom1UA和BChEprom1L；表1）产生从位置-1869处跨越到-1031处的838bp片段。在PCR2（引物BChEprom2UA和BChEpromS6；表1）中获得了从位置-1152处跨越到-315处的837bp片段以及在PCR3（引物BChEprom2UB和BChEprom2L；表1）中获得了从位置-473到位置+231处的688bp片段。具有15μl终体积的PCR反应，包含1.7mM MgCl2、200μM的每种dNTP（Ecogen）、2pmol的各引物、1单位的EcoTaq DNA聚合酶（Ecogen）以及约300ng的DNA。标准PCR程序具有PCR1的58℃的以及PCR2和PCR3的60℃的退火温度，由PCR1的30个循环和PCR2及PCR3的35个循环构成。
表1：用于BChE启动子测序的引物
引物名称 引物序列(5’->3’) SEQ ID NO
BChEprom1UA TGATAGGCTGACCGTATGCT SEQ ID NO:2
BChEprom1L ACCTCATCAGATGAGAAAGC SEQ ID NO:3
BChEprom2UA TCTCTTGGAAGCAGTTGACAT SEQ ID NO:4
BChEpromS6 CCATTATAGCTTCAATCTGTGC SEQ ID NO:5
BChEprom2UB AGATACATATCAGAGACATCCATT SEQ ID NO:6
BChEprom2L GAAGAGATCACTCTCATCCC SEQ ID NO:7
用ExoSap-IT试剂盒（GE Healthcare）纯化PCR产物。用BigDye（BigDyeTM终止子对1.1循环测序试剂盒，Perkin Elmer）、10pmol/μl的各自引物以及3.5μl的纯化的PCR产物进行测序反应。在循环测序法和DNA沉淀后，在ABI PRISMTM3100（Perkin Elmer）上获得序列。
BChE启动子多态性的分析
在BChE基因的启动子区发现了4个新的多态性。用突变特异性-PCR（MS-PCR）研究了其中的三个，以及众所周知的K-变体多态性：A3687G、A4206G、C4443T以及BChE-K。具有15 μl终体积的每种PCR反应，包含1.7 mM MgCl2、200 μM的每种dNTP（Ecogen）、2 pmol的三种引物的每一种（表2）、1单位的EcoTaq DNA聚合酶（Ecogen）以及300 ng的DNA。进行了35个循环的标准PCR程序，具有在A3687G、BChE-K扩增情况下的62℃的以及在A4206G、C4443T扩增情况下的57℃的退火温度。获得的PCR片段在高分辨率的琼脂糖凝胶上分离。153 bp的片段代表了BChE A3687G多态性的A-等位基因以及133 bp片段代表了G-等位基因。149 bp片段代表了K-等位基因以及169 bp条带代表了K-变体多态性的野生型相应等位基因。BChE A4206G多态性的A-等位基因是124 bp的长度以及G-等位基因是104 bp。最后，在C4443T多态性的情况下，T-等位基因相应于145 bp的片段以及C-等位基因相应于125 bp的片段。
表2：用于BChE启动子基因分型的引物
多态性1：多态性名称
统计分析
对应分析（CORRESPONDENCE，版本1.1，Data Theory Scaling SystemGroup(DTSS)，Faculty of Social and Behavioral Sciences,Leiden University,The Netherlands）允许获得在神经病理诊断患者组的情况下的对应表。用SSPS版本11.0计算了两个患者组（神经病理和临床诊断）的基因型组合的分布。
临床和神经病理诊断的匹配
首先在从神经组织库中获得的样品中分析了临床和神经病理诊断间的匹配。虽然100%的AD患者与其临床和神经病理诊断一致，且42%的pDLB患者接受了DLB的诊断，仅仅17%的cDLB患者接受了DLB的临床诊断。相反，其中的62%曾被诊断为AD而21%相应于其他的痴呆相关疾患。此观察结果与缺乏对cDLB诊断标准完全一致。
结果
BChE K-变体的表征和疾病关联
BChE K-变体由在位置68974处从g到a的单核苷酸置换组成，其中g-等位基因被命名为W（野生型）而a-等位基因被命名为K（突变）。此分析的有趣的发现是与对照组相比不但在cLBD中而且在pDLD及AD中的携带K-等位基因的基因型的比例过高（overrepresentation）（在cLBD中的0.62，在pDLB中的0.42，以及在AD中的0.38对在对照组中的0.13，分别为p<0.001，p=0.090及p=0.058）。进一步基因型分析发现，KW基因型在AD和对照组中呈现了相似的频率，在pDLB中轻微地提高了，而大约三分之一的cLBD样品是KW-基因型携带者（表3）。然而在所研究的样品中既不存在H-变体也不存在J变体，携带A-变体的基因型被发现以非常低的频率呈现在不同的疾病中（在cLBD中的0.04，在pDLB中的0.08，以及在AD中的0.04对在对照组中的0，分别为p=1，p=0.34及p=1）。
表3：BChE K-变体多态性的等位基因和基因型分布
Figure BDA0000463459140000151
1n：样品编号；2p：用于每种疾病和对照之间的基因型比较的精确检验p值。
BChE启动子多态性的表征和疾病关联
三个BChE启动子多态性是单核苷酸变化：在位置3687处，其中A被改变为G，在位置4206处A被G取代以及在位置4443处的C到T。
为确定多态性是否表现出疾病特异性关联，在神经病理诊断的包括cLBD、pDLB、AD以及对照组的脑样品中确定启动子多态性的等位基因和基因型频率。首先，独立地分析了多态性以及然后，还测试了基因型组合的存在。
A3687G多态性的研究发现，当与cLBD、pDLB以及对照组相比较时在AD中AA基因型的约3倍增加（在AD中的0.54对在cLBD中的0.21，p=0.152；在pDLB中的0.16，p=0.298以及对照组中的0.13，p<0.001）。与此相反，相应于A4206G多态性的携带G-等位基因的基因型与对照比较积聚在cLBD、pDLB、以及AD中（在cLBD中的0.33，在pDLB中的0.17以及在AD中的0.23对在对照中的0.04，分别地，p=0.023，p=0.262以及p=0.105）。虽然携带G-等位基因的基因型的积聚不是疾病特异的，但是这种积聚似乎有一定的重要性，因为携带G-等位基因的基因型在对照组中几乎不存在。相应于C4443T多态性的CC-基因型当与cLBD以及对照相比时在pDLB中以很低频率存在。相反，TC-基因型的频率与AD比较时在pDLB和cLBD中提高了几乎2倍而且其还显著高于对照。
基因型组合的分析
对应分析
通过对应分析研究了从3个BChE启动子多态性：（1）在位置3687（多态性：A3687G）处的1314AA；（2）在位置4206（多态性：A4206G）处的795AG；（3）在位置4443（多态性：C4443T）处的558CC；以及BChE-K（在位置68974处的KW或KK）（在外显子4内的普通多态性KW）产生的基因型组合（GenComb）。在对应表（表4）中表示的结果允许疾病特异基因型组合的容易检测。
表4：包括3个疾病组和一个对照组的神经病理样品的BChE基因型组合的对应表
AD pDLB cDLB 对照
1 AAAACCKK 2 0 0 0
2 AAAACCKW 0 0 1 1
3 AAAACCWW 0 1 0 0
4 AAAATCWW 0 0 0 2
5 AAAATCKK 0 1 0 0
6 AAAATCWW 1 0 0 0
7 AAAATTKK 1 0 0 0
8 AAAATTWW 5 0 0 0
9 AAAGCCKK 0 0 3 0
10 AAAGCCKW 0 0 1 0
11 AAAGTTKK 1 0 0 0
12 AGAACCKK 0 0 0 1
13 AGAACCWW 0 0 0 1
14 AGAATCKK 2 0 2 0
15 AGAATCKW 0 1 2 0
16 AGAATCWW 0 2 2 5
17 AGAATTKW 0 0 1 0
18 AGAATTWW 5 1 3 5
19 AGAGTCKK 2 1 3 0
20 AGAGTCKW 2 0 1 0
21 GGAACCWW 1 0 0 0
22 GGAATCWW 0 0 1 2
23 GGAATTKW 0 1 1 0
24 GGAATTWW 3 3 3 5
25 GGAGCCKW 0 0 0 1
26 GGAGTCKK 0 1 0 0
27 GGAGTTWW 1 0 0 0
26 12 24 23
共同基因型组合（Common genotype combination）
首先，整体分析发现了27个不同GenComb（表3）的存在。因为其中的大多数（59%）仅仅存在于一个或两个样品中，其频率是非常低的（0.01和0.02）。两个最频繁的GenComb(N°18和24)，代表了整个样品的32.9%而且在所有组中以相似的频率存在。
疾病特异性基因型组合
当按疾病分析时，可检测到两个重要疾病特异性GenComb。一方面，GenComb AAAATTWW以0.19的相对高频率仅仅存在于AD样品中。
当合并基因型组合9与10并限定其作为共同GenComb AAAGCCK+时，此GenComb是在LBD中发现的最频繁(0.17)的疾病特异性GenComb。
在临床样品中的基因型组合分析
为了证实由验尸样品的研究获得的数据，还研究了包括一组223个AD患者和一组160个对照个体的临床样品。AD患者在1998年到2002年之间确诊，但是因为用于临床DLB诊断的最新指导方针在2005年被制定，可以预计这些AD患者中的20%到40%应该是误诊的DLB患者。
对应分析
对应表（表5）显示了产生的GenComb的分布。考虑到GenComb由4个多态性构成，非常令人惊讶地发现在由383个个体构成的样品中仅仅有25个不同的GenComb（表5）。所有检测到的GenComb中的63.6%在两个样品中相符。
表5在包括阿尔茨海默病和对照组的临床样品中的BChE基因型组合对应表
AD C
1 AAAACCKK 1 0
2 AAAACCKW 7 2
3 AAAACCWW 2 3
4 AAAATCKW 4 0
5 AAAATCWW 5 1
6 AAAATTKK 1 0
7 AAAATTWW 5 5
8 AAAGCCKK 6 2
9 AAAGCCKW 5 1
10 AAAGCCWW 0 1
11 AAAGTCKW 4 6
12 AGAACCKK 0 1
13 AGAACCKW 2 2
14 AGAACCWW 0 1
15 AGAATCKK 0 1
16 AGAATCKW 24 27
17 AGAATCWW 24 20
18 AGAATTKW 2 1
19 AGAATTWW 32 25
20 AGAGTCKW 19 8
21 AGAGTCWW 0 1
22 AGAGTTKW 1 0
23 AGAGTTWW 1 0
24 GGAATTKW 2 4
25 GGAATTWW 76 49
223 161
共同基因型组合
四个最频繁的GenComb中的三个在两个样品中一致：组合25（在表4中的24）的0.33频率对验尸样品中的0.16频率，组合19（在表4中的18）的0.15频率对验尸样品中的0.16频率，组合17（在表4中的16）的0.11频率对验尸样品中的0.11频率以及组合16（在表4中的15）的0.13频率对验尸样品中的0.03频率（表5）。
疾病特异性基因型组合
当在验尸样品中分析检测为DLB-和AD-特异性的GenComb的分布时，仅在2%的AD患者中而且还在3.1%的对照个体中检测到了GenCombAAAATTWW（表5）。这些频率表明AAAATTWW不适合被视为疾病标志物。
GenComb AAAGCCK+被发现在AD中具有0.05的频率且在对照组中具有0.02的频率（表5）。
考虑到这些AD患者大约在8年前被临床确诊，在用于DLB诊断的新指导方针制定之前很久，所以修订了携带GenComb AAAGCCK+的11个患者的临床病史。所有的11个患者出现了与DLB相符的症状中的至少一个，证实AAAGCCK+作为潜在的DLB标志物。
当进一步考虑到AD患者组中的20%到40%可能是被误诊的DLB患者，AAAGCCK+的疾病特异性频率增加而且可能范围在15%到30%之间。AAAGCCK+的特异性是98.1%而且灵敏性在15%和30%之间。
依赖于相对BChE表达的基因型组合
为了检测用于DLB AAAGCCK+-携带者的潜在的特异特征，确定了与13个AD及12个对照样品相比较的在22个DLB样品中的额皮质中BChE表达水平。
RNA的分离和逆转录
TRI-试剂（MRC，辛辛那提，美国）根据制造商的方案用于RNA的分离。简要地，将100mg组织样品用无菌活塞在含有1.0ml TRI-试剂的1.5ml管中匀浆。室温下孵育匀浆5分钟并且然后在4℃，12,000g离心10分钟以沉淀不溶解的物质及高分子量DNA。相分离后，用异丙醇沉淀RNA然后在合适体积DEPC-处理的水中重悬RNA。用分光光度法在A260确定RNA的量，由在260nm和280nm下吸光度比值确定RNA纯度。利用Agilent2100生物分析仪（Agilent Technologies，圣克拉克，美国）确定RNA完整性。仅RIN值高于6的样品被存储在-80℃直至使用。
用Ready-to-go TM You-Prime First-Strand Beads（Amersham PharmaciaBiotech，乌普萨拉，瑞典）合成cDNA第一链。2mg RNA与随机六聚体及第一链珠在37℃孵育1小时。产生的cDNA或立即用于PCR或存储在-20℃直至使用。
实时PCR
用Rotor-Gene6000（Corbett Life Science,悉尼，澳大利亚）确定BChEmRNA的相对表达。QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒（QiaGen,希尔登，德国）用于将引物二聚体含量减到最少。15ml反应物还含有16pmol各种引物（BChE2U GAGTAGATCCATAGTGAAACGG,SEQ ID NO:20，和BChE6LRNA CAGCGATGGAATCCTGCTTT,SEQ ID NO:21）及1ml的cDNA。为了研究相对BChE量，也分析了两个看家基因，β-肌动蛋白（引物：β-肌动蛋白U2TCTACAATGAGCTGCGTGTG,SEQ ID NO:22,和β-肌动蛋白L3TAGATGGGCACAGTGTGGGT,SEQ ID NO:23）以及β-葡萄糖醛酸酶（GUS;引物：GUS-U1ATGTGGTTGGAGAGCTCATT,SEQ ID NO:24和GUS–L2TGTCTCTGCCGAGTGAAGAT,SEQ ID NO:25）（M.Barrachina等人，"TaqMan PCR assay in the control of RNA normalization inhuman post-mortem brain tissue",Neurochem Int2006，第49卷，第276-84页）。
15分钟变性步骤，随后所有BChE、GUS、及β-肌动蛋白在56℃退火30秒后，在标准的72℃延伸过程中获得了终点荧光数据（endfluorescence data）。为所有产物运行了最终的熔解曲线分析以确定特异性扩增。由基于相似PCR效率的假设的ΔΔCt方法获得相对表达数据以分析相对基因表达（T.D.Schmittgen等人，"Analyzing real-time PCR data by thecomparative C(T)method",Nat Protoc2008，第3卷，第1101-8页）。因此，测试了每个基因和亚型的不同引物对以获得以相似效率扩增的长度在100和150碱基对之间的片段。由于在每次运行中PCR效率可以不同，标准曲线被列入每一次运行中而不仅在起始运行中。仅有具有相似效率与正确标准曲线（R>0.99和R^2>0.99）的运行适合于进一步分析。通过扩增相同的连续稀释的cDNA对照样品产生标准曲线。所有测定都被进行两次并且独立地进行以确保其重复性和将可能误差减到最少，在每一次运行中另外包括阴性对照。
结果
当与对照组相比时，主要的相对表达分析在DLB中发现了轻微的、但不是显著的BChE表达的增加：1.53（1.13到2.07），但在AD中未发现增加：1.26（1.17到1.36）。特别地DLB病例显示了方差估计的宽范围。在分析BChE表达与GenComb的依赖性时，发现了DLB-AAAGCCK+-携带者（n=3）以及对照样品出现了相似的BChE表达水平（图1）。具有KW基因型的DLB样品(n=7)也表现了相似于对照的BChE表达水平。
相反，剩余的所有DLB样品（n=12）显示显著的BChE过表达（图1）。重要的是要提到，在所有3个DLB组即AAAGCCK+-携带者组、KW-携带者组以及剩余样品组中方差估计的范围是非常低的。
由于已经描述了DLB的特征是甚至比AD更高的胆碱能缺乏，因此可以预见的是在DLB中BChE表达尤其增加了。事实上，本研究发现，所有DLB患者的约60%显示超过3倍的BChE过表达。相反，其余患者是关联到较低BChE表达水平的BChE基因型组合/基因型的携带者（图1）。
第二DLB-特异的BChE-基因型组合的鉴定
由于BChE表达分析的结果，在临床样品中重新分析了所有基因型组合。发现了KW基因型携带者在AD和对照组中具有相似的频率。相反，GenComb AAAAC+KW，存在于AD组的11个患者中（0.05的频率）以及对照组的2个个体中（0.012的频率）。临床病史的修订还在他们所有人中发现与DLB一致的症状。
考虑到我们的AD组的20%到40%事实上是DLB患者，类似GenComb AAAGCCK+，AAAAC+KW-的频率将范围在15%到30%之间。 AAAAC+77KW的特异性将是98.7%且其灵敏性在15%和30%之间。
如果再将两种GenComb组合，BChE基因型组合AAAGCCK+与 AAAAC+KW的测试将允许检测30%到60%的DLB病例，其具有96.8% 的特异性。
说明书中引用的参考文献
-I.G.McKeith,"Consensus guidelines for the clinical and pathologicdiagnosis of dementia with Lewy bodies(DLB):report of the Consortium onDLB International Workshop",J.Alzheimer's Dis.2006，第9卷，第417-23页
-F.Parmo-Folloni等人，"Two new mutations of the human BCHE gene(IVS3-14T>C和L574fsX576)"Chemico-Biological Interactions2008，第175卷，第135-7页
-A.B.Singleton等人，"Butyrylcholinesterase K:an association withdementia with Lewy bodies",Lancet1998，第351卷，第1818页
-R.Lane等人，"BuChE-K and APOE epsilon4allele frequencies in Lewybody dementias,and influence of genotype and hyperhomocysteinemia oncognitive decline",Mov.Disord.2009，第24卷，第392-400页
-W.Maetzler等人，"No differences of butyrylcholinesterase proteinactivity and allele frequency in Lewy body diseases",Neurobiol.Dis.2009,第35卷，第296-301页
-M.Barrachina等人，"TaqMan PCR assay in the control of RNAnormalization in human post-mortem brain tissue",Neurochem Int2006，第49卷，第276-84页
-T.D.Schmittgen等人，"Analyzing real-time PCR data by thecomparative C(T)method",Nat Protoc2008，第3卷第5期，第1101-8页
Figure IDA0000463459190000011
Figure IDA0000463459190000021
Figure IDA0000463459190000031
Figure IDA0000463459190000041
Figure IDA0000463459190000061
Figure IDA0000463459190000071

Claims (14)

1.一种用于路易体痴呆的诊断的体外方法，所述方法包括确定来自被试者生物样品内的在丁酰胆碱酯酶（BChE）基因中的以下多态性的基因型：
在NCBI登录号NG_009031（即SEQ ID NO:1）内的位置3687处的多态位点，
在SEQ ID NO:1内的位置4206处的多态位点，
在SEQ ID NO:1内的位置4443处的多态位点，以及
在NCBI登录号NG_009031内的位置68974（即SEQ ID NO:26内的位置934）处的多态位点。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述基因型是：
在位置3687处的两个等位基因为腺嘌呤，
在位置4206处的一个等位基因为腺嘌呤且另一个等位基因为鸟嘌呤，
在位置4443处的两个等位基因为胞嘧啶，以及
在位置68974处的一个等位基因为腺嘌呤，
为此基因型指示路易体痴呆并且将路易体痴呆与阿尔茨海默病区分开。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述基因型是：
在位置3687处的两个等位基因为腺嘌呤，
在位置4206处的两个等位基因为腺嘌呤，
在位置4443处的一个等位基因为胞嘧啶，以及
在位置68974处的一个等位基因为腺嘌呤且另一个等位基因为鸟嘌呤，
为此基因型指示路易体痴呆并且将路易体痴呆与阿尔茨海默病区分开。
4.如权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述基因型的确定通过选自由以下组成的组的技术中的一个进行：个体PCR扩增反应、引物特异性多重PCR随后检测、多重等位基因特异引物延伸、基于微阵列的方法以及动态等位基因特异性杂交技术。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述确定通过以下进行：引物特异性多重PCR扩增随后检测。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述检测通过用特异探针杂交进行。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述特异探针被固定在微阵列中。
8.如权利要求1到7中任一项所述的方法，其中所述生物样品是血液样品。
9.如权利要求1到7中任一项所述的方法，其中所述生物样品是上皮细胞样品。
10.一种用来进行如权利要求1到9中任一项所限定的方法的试剂盒，所述试剂盒包括用于确定在BChE基因中的多态性的基因型的充足工具。
11.如权利要求8所述的试剂盒，所述试剂盒包括能够产生扩增子的引物，所述扩增子包括在SEQ ID NO:1的位置3687处、位置4206处以及位置4443处的多态性，以及在SEQ ID NO:26的位置934处的多态性。
12.如权利要求11所述的试剂盒，其中所述引物由SEQ ID NO:8-19组成。
13.如权利要求10到12中任一项所述的试剂盒，其中所述引物是被荧光团剂标记并且所述试剂盒包括用来运行引物特异性多重PCR的试剂。
14.如权利要求10到13中任一项所限定的试剂盒用于路易体痴呆的诊断的应用。
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