CN109517884B - 一种家族性高胆固醇血症的基因检测文库的构建方法及其试剂盒 - Google Patents
一种家族性高胆固醇血症的基因检测文库的构建方法及其试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种家族性高胆固醇血症的基因检测文库的构建方法及其试剂盒,涉及LDLR、APOB、PCSK9的基因突变。为了保证目标区域(待测基因全编码区,以及可变剪切区)全部被覆盖,并避免相邻扩增子的引物之间形成引物二聚体或短片段,PCR扩增引物被分离成两个独立的引物池,分别进行多重PCR扩增,再进行引物序列消化、连接测序接头、文库纯化并质检,最终构建检测文库。该方法建库步骤简便快速,有效降低成本,减少工作量,变异类型全面、检测准确率达到100%、通量高。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,尤其涉及一种家族性高胆固醇血症的基因检测文库的构建方法和试剂盒。
背景技术
家族性高胆固醇血症(Familial Hypercholesterolemia,FH)是一种罕见的常染色体显性遗传性疾病,在人群中的发病率是1/500,根据基因型分为两个亚型,纯合型家族性高胆固醇血症(HoFH)和杂合型家族性高胆固醇血症(HeFH)。患者本身低密度脂蛋白(LDL)胆固醇数值异常超高,若为纯合子患者时其低密度脂蛋白(LDL)胆固醇数值是正常人的4~6倍,通常LDL-C为500-1200mg/dL,甚至超过700mg/dL。高胆固醇血症是心脏疾病发生的诱发因素,具有FH并且未处理的的人群患冠心病的概率是普通人的20倍左右。传统的FH诊断主要依靠临床表现、LDL-C的含量进行诊断,但存在确诊时间晚(症状出现后)、难以判断预后等问题。
家族性高胆固醇血症中,是由于基因突变导致血液中胆固醇含量很高的一种疾病。高胆固醇血症患者有很高的风险患上一种叫做冠状动脉疾病的心脏病,以及与其他组织(如肌腱和皮肤)中堆积过量胆固醇有关的健康问题。家族性高胆固醇血症往往以常染色体显性遗传方式在家族中传播。由LDLR、APOB或PCSK9基因突变引起的高胆固醇血症还有其他遗传形式。然而,大多数高胆固醇病例并不是由单一的遗传条件引起的,而是由生活方式的选择和许多基因变异的影响共同造成的。
LDLR(低密度脂蛋白受体)是一种蛋白质编码基因。与LDLR相关的疾病包括高胆固醇血症、家族性和纯合子家族性高胆固醇血症。其相关通路包括卵巢类固醇生成和脂蛋白代谢。与该基因相关的基因本体注释包括钙离子结合和低密度脂蛋白颗粒结合。该基因的一个重要副产物是LRP8。低密度脂蛋白受体(LDLR)基因家族由参与受体介导的特定配体内吞的细胞表面蛋白组成。低密度脂蛋白(LDL)通常结合在细胞膜上,进入细胞后进入溶酶体,在溶酶体中蛋白质被降解,胆固醇可用于抑制微体酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMGCoA)还原酶,这是胆固醇合成中的限速步骤。同时,胆固醇酯合成的相互刺激发生。该基因的突变导致常染色体显性障碍,家族性高胆固醇血症。交替剪接导致多种转录变体。
APOB(载脂蛋白B)是一种蛋白质编码基因。APOB相关疾病包括低倍脂蛋白血症、家族性、1型和高胆固醇血症、常染色体显性遗传、b型。与该基因相关的基因本体注释包括结合和肝素结合。该基因产物是乳糜微粒和低密度脂蛋白的主要载脂蛋白。它以apoB-48和apoB-100两种主要亚型的形式存在于血浆中:前者只在肠道中合成,后者在肝脏中合成。apoB的肠道和肝脏形式由一个非常长的单一mRNA的单个基因编码。这两个亚型具有共同的n端序列。在残基2180(CAA->UAA)上对apoB-100转录本进行RNA编辑后,产生较短的apoB-48蛋白,导致终止密码子的产生和早期翻译终止。该基因或其调控区域的突变会导致低倍脂蛋白血症、正常甘油三酸酯低倍脂蛋白血症以及配体缺陷apoB引起的高胆固醇血症,这些疾病会影响血浆胆固醇和apoB水平。
PCSK9(枯草杆菌蛋白酶蛋白质转换酶9型)是一种蛋白编码基因。与PCSK9相关的疾病包括高胆固醇血症、常染色体显性遗传、3和纯合子家族高胆固醇血症。其相关途径有脂蛋白代谢和代谢。与该基因相关的基因本体论注释包括蛋白质自缔合。该基因编码类似于亚替利辛的前蛋白转化酶家族的成员,该家族包括通过分泌途径的调控或组成分支处理蛋白质和肽前体转运的蛋白酶。编码蛋白在ER中经历自催化过程,并以非活性蛋白酶的形式分泌到细胞外基质和反式高尔基网络中。它在肝脏、肠和肾组织中表达,并护送特定受体用于溶酶体降解。它在胆固醇和脂肪酸代谢中起作用。该基因的突变与常染色体显性家族性高胆固醇血症有关。可选择的剪接导致多种转录变体。
sanger测序技术检测LDLR、APOB、PCSK9的基因突变存在很大局限性,表现在:受通量限制,该方法仅适用若干明确致病热点筛查,而对于候选基因或位点数目较多的大样本病例筛查是难以完成的,不仅耗时,投入产出比也非常低。另外,检测过程复杂,同一次检测中单核苷酸变异、短片段插入缺失与大片段缺失与重复需要两次PCR反应单独检测。
高通量基因测序技术检测LDLR、APOB、PCSK9的基因突变,需要制备二代测序文库。如果制备文库中涉及到基因组DNA片段化,会存在末端修复、加A、加接头等步骤,步骤多且繁琐,操作时间长,容易造成污染等问题。这是因为,物理打断需要借助打断仪,基于超声剪切原理可将DNA打断成100-1500bp片段;化学打断法主要依赖于酶打断法,经内切酶打断后能产生100-800bp的片段。通过物理打断法对DNA进行打断需要投入打断仪以及仪器维护,而且要经过磁珠纯化富集DNA片段,才能进行后续的建库步骤,进一步增加了人工操作。
因此,有必要寻找一种新的检测家族性高胆固醇血症的基因突变的方法,提高诊断准确率,降低成本和劳动强度。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明的目的在于提供一种家族性高胆固醇血症的基因检测文库的构建方法,该方法建库步骤简便快速,有效降低成本,减少工作量,变异类型全面、检测准确率达到100%、通量高。
本发明的另一目的是提供该方法获得的家族性高胆固醇血症的基因检测文库。
本发明的另一目的是提供所述文库制备的家族性高胆固醇血症的基因检测试剂盒。
为实现上述目的,本发明提供了一种家族性高胆固醇血症的基因检测文库,涉及LDLR、APOB、PCSK9的基因突变。为了保证目标区域(待测基因全编码区,以及可变剪切区)全部被覆盖,并避免相邻扩增子的引物之间形成引物二聚体或短片段,PCR扩增引物被分离成两个独立的引物池,分别进行多重PCR扩增,再进行引物序列消化、连接测序接头、文库纯化并质检,最终构建检测文库。
本发明的一种家族性高胆固醇血症的基因检测文库的构建方法,包括如下步骤:
(1)DNA质量标准:提供受试者样本的基因组DNA,经过核酸提取、质检后,要求DNA符合一定质控标准;
(2)多重PCR扩增:利用上述DNA文库从高通量测序平台自动合成覆盖全部基因的扩增引物文库,对目标区域进行多重PCR扩增;
(3)引物序列消化:将步骤2得到的引物扩增产物混合,进行消化反应;
(4)连接测序接头:连接高通量半导体测序平台专用的测序接头,含样本标签序列,在DNA连接酶的作用下,将测序接头与步骤3的消化产物连接;
(5)文库纯化:步骤(4)得到的连接产物中加入纯化磁珠,混匀,置于磁力架上,直到溶液澄清后,弃掉上清,使用乙醇清洗磁珠,离心,吸尽残余液体,干燥,加入Tris-EDTA缓冲液,吹吸混匀,室温放置,澄清后即得纯化文库;
(6)文库质检:使用Real-Time PCR对纯化文库定量质检。
本发明上述的家族性高胆固醇血症的基因检测文库构建方法,所述目标区域包含以下基因的全编码区和可变剪切区(外显子向内含子外延20bp):LDLR、APOB、PCSK9。
上述步骤(1)中所述的核酸提取的样本类型包括但不限于外周血、体液、组织器官样本等,优选核酸样本为血细胞、口腔黏膜脱落细胞。
上述步骤(1)中所述的DNA质控标准为,DNA浓度≥5ng/μL;DNA纯度:OD260/2801.8-2.0,OD260/230>2;DNA总起始量:15ng。
步骤(1)中所述的核酸提取方法、DNA质控方法均按照现有技术的操作规程进行。
上述步骤(2)中为了保证目标区域(待测基因全编码区,以及可变剪切区)全部被覆盖,并避免相邻扩增子的引物之间形成引物二聚体或短片段,优选PCR扩增引物被分离成两个独立的引物池,分别进行多重PCR扩增。
进一步优选每个引物池反应体系为5-10μL,总体积为10-20μL。更优选每个引物池反应体系为5μL,总体积为10μL。
上述步骤(2)中所述的多重PCR扩增反应体系按照下述体积比组成,扩增反应预混液:FH引物池:DNA=1:2.5:1.5;具体反应体系及反应条件见表1,引物序列见表2-3。
所述扩增反应预混液按照现有技术配制而成或者购买。
表1多重PCR扩增反应体系组分及反应条件表
表2多重PCR扩增引物池中引物序列表
本发明所述步骤(3)引物序列消化:将步骤(2)得到的两个独立引物池扩增产物混合,将消化反应预混液、无核酸水加入到混合PCR产物,其体积比为1:1:10。由于扩增产物两端是引物序列,本步骤(3)消化反应可避免扩增过程中引入引物5’端的简并碱基,减少测序长度(两端引物序列长度近40bp)。优选消化反应体系:将1μL消化反应预混液,1μL无核酸水加入到10μLPCR产物中,总体积12μL。
在PCR仪中依此按照下述条件运行:50℃保持20min;55℃保持20min;60℃保持20min,然后保持在10℃不超过1h。
本发明步骤(3)中所述的消化反应预混液是由消化酶及Tris-HCL按照现有技术配制而成或者购买。
本发明上述步骤(4)连接高通量半导体测序平台专用的测序接头(含样本标签序列),在DNA连接酶的作用下,将测序接头与步骤3的产物连接。所述连接接头反应体系按照下述体积比组成,连接反应缓冲液:DNA连接酶:接头=2:1:1。具体反应体系及反应条件见表3.
表3连接接头反应体系组分及反应条件表
本发明上述所述的连接反应缓冲液是指:含Tris-HCL,dNTP,Mg2+的溶液,按照现有技术配制或者购买。
本发明所述平台通用测序接头序列,A端CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAG,P端
CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT。优选是Ion Torrent平台通用测序接头序列。
本发明所述的样本标签序列在测序接头序列A端,长度为10bp,其在测序模板序列的位置如下:
A端接头序列+样本标签序列+GAT+文库序列+P端接头序列+磁珠
CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAG+CTAAGGTAAC+GAT+NNNNN+
CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT+磁珠;其中GAT序列是固定序列,为了均衡测序接头的链接效率。所述NNNNN为文库序列。
所述样本特异性标签见下表4:
步骤(5)所述的纯化过程:在扩增产物中加入24μL纯化磁珠,混匀,室温保持5min后,置于磁力架上,直到溶液澄清后,弃掉上清,使用150μL新鲜的70%乙醇清洗磁珠两次,分别弃掉上清,短暂离心后放回磁力架上,吸尽残余液体,室温干燥5min,取下EP管加入50μL的Tris-EDTA缓冲液,吹吸混匀,室温放置5min,移至磁力架上,澄清后将文库转移到干净的EP管中。
步骤(6)将纯化后的样本文库进行质检:使用Real-Time PCR进行文库定量:先将标准品按照10倍梯度稀释;将样本文库100-200倍稀释;反应体系是由下述体积比组成,2×Master Mix:20×TaqMan:样本标准品=5:0.5:4.5。具体反应体系及反应条件按照下表5配制试剂(7500/7300standard)。样本文库浓度应≥100pM。
表5 Real-Time PCR反应体系及反应条件
进一步优选,步骤(6)将纯化的样本文库进行质检:使用Real-Time PCR进行文库定量:先将标准品按照S1、S2、S3的顺序稀释,原标准品S0-68pM,10倍梯度稀释到6.8PpM、0.68pM、0.068pM,将样本文库100-200倍稀释。
本发明上述步骤(2)、步骤(4)所述的高通量半导体为Ion Torrent。
本发明进一步优选一种家族性高胆固醇血症的基因检测文库构建方法,包括如下步骤:
(1)核酸提取及质检:血细胞经过核酸提取、质检后,要求其符合一定质控标准:DNA浓度:5ng/μL;DNA纯度:OD260/280 1.8-2.0,OD260/230>2;DNA总起始量:15ng;
(2)多重PCR扩增:为了保证目标区域(待测基因全编码区,以及可变剪切区)全部被覆盖,并避免相邻扩增子的引物之间形成引物二聚体或短片段,PCR扩增引物被分离成两个独立的引物池,分别进行多重PCR扩增,每个反应为5μL,总体积为10μL。
将符合步骤(1)DNA质量标准的DNA进行多重PCR扩增,反应体系为:扩增反应预混液1μL,FH引物池2.5μL,DNA 1.5μL,合计5μL。多重PCR反应条件为:99℃保持2min,然后进行16个循环,每个循环为99℃保持15s,60℃保持4min,然后保持在10℃,结束反应。
(3)引物序列消化:将步骤(2)得到的两个独立引物池扩增产物混合,加入如下消化反应体系:10μL扩增产物+1μL消化反应预混液+1μL无核酸水,总体积12μL。消化反应条件:50℃保持20min,55℃保持20min,60℃保持20min,然后保持在10℃,不超过1h。
(4)连接接头:在消化产物中按照以下顺序加入试剂:连接反应缓冲液2μL、连接酶1μL、接头1μL,合计4μL;反应条件:22℃保持30min;72℃保持10min;最后保持在10℃不超过1h。
(5)将步骤(4)中获得的扩增产物按照以下方法进行纯化:在扩增产物中加入24μL纯化磁珠,混匀,室温保持5min后,置于磁力架上,直到溶液澄清后,弃掉上清,使用150μL新鲜的70%乙醇清洗磁珠两次,分别弃掉上清,短暂离心后放回磁力架上,吸尽残余液体,室温干燥5min,取下EP管加入50μL的Tris-EDTA,吹吸混匀,室温放置5min,移至磁力架上,澄清后将文库转移到干净的EP管中。
(6)将步骤(5)中的纯化产物按照下述方法进行质检:使用Real-Time PCR进行文库定量:先将标准品按照S1、S2、S3的顺序稀释,原标准品S0-68pM,10倍梯度稀释到6.8PpM、0.68pM、0.068pM,将样本文库100-200倍稀释;按照下述配制试剂:样本文库DNA浓度应≥100pM、2×Master Mix 5μL、20×TaqMan 0.5μL、样本(标准品)4.5μL;反应条件:50°保持2min,95°保持2min,然后40个循环,每个循环96°保持15sec,60°保持1min。
(7)乳液PCR:将上述纯化及质检后产物进行qPCR定量,上样量计算出样本上样量,然后进行油包水PCR。利用Ion PGMTMHi-QTMview OT2Kit,One Touch 2进行测序模板富集。
反应体系表6:
表6乳液PCR反应体系
组分 | 体积 |
PCR反应液 | 800μL |
PCR酶混合液 | 50μL |
ISP微珠 | 100μL |
DNA样本文库 | 25μL |
水 | 25μL |
(8)在Ion TorrentTM PGM基因测序仪上进行测序及数据分析使用软件为iAnalyses。
(9)由遗传咨询师对得到的数据分析位点进行分析解读。
本发明的另一目的是提供该方法获得的家族性高胆固醇血症的基因检测文库。
本发明的另一目的是提供所述文库制备的家族性高胆固醇血症的基因检测试剂盒,其包括基因检测文库的建库试剂、引物序列、接头序列、样品标签序列、固定序列;所述引物序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:262。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
1、本发明的文库采用高通量基因测序技术检测LDLR、APOB、PCSK9的基因突变,不需要制备二代测序文库,没有涉及到基因组DNA片段化,不存在末端修复及加A、加接头等步骤,操作简单、所用时间段,技术方法精确度高。
2、本发明的文库避免了化学打断法,不依赖于酶打断法,不容易造成污染等问题。
3、本发明的文库避免了物理打断法中打断仪的使用如超声,无需过多仪器的投入及仪器维护,减少生产成本及人工成本。
4、本发明提供一种家族性高胆固醇血症的基因检测文库的构建方法和试剂盒检测变异类型全面、准确率高达到100%、通量高。
附图说明
图1是根据本发明的方法构建的血液DNA文库2100生物分析仪检测结果。
图2是根据本发明的文库构建及测定流程图。
具体实施方式
下面结合附图,对本发明的具体实施方式进行详细描述,但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示,否则在整个说明书和权利要求书中,术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分,而并未排除其它元件或其它组成部分。
实施例1
采用16个样本进行文库构建,采用包含LDLR、APOB、PCSK9基因的全编码区和可变剪切区(外显子向内含子外延20bp)作为目标区域的引物池进行多重反应PCR,并结合高通量测序平台S5 Plus进行DNA测序,然后检测点突变(SNP)、小片段插入缺失(InDel)。具体操作流程如下:
(1)核酸提取及质检:血细胞经过核酸提取、质检后,要求其符合一定质控标准:DNA浓度:5ng/μL;DNA纯度:OD260/280 1.8-2.0,OD260/230>2;DNA总起始量:15ng;
(2)多重PCR扩增:为了保证目标区域(待测基因全编码区,以及可变剪切区)全部被覆盖,并避免相邻扩增子的引物之间形成引物二聚体或短片段,PCR扩增引物被分离成两个独立的引物池,分别进行多重PCR扩增,每个反应为5μL,总体积为10μL。
将符合步骤(1)DNA质量标准的DNA进行多重PCR扩增,反应体系为:扩增反应预混液1μL,FH引物池2.5μL,DNA 1.5μL,合计5μL。多重PCR反应条件为:99℃保持2min,然后进行16个循环,每个循环为99℃保持15s,60℃保持4min,然后保持在10℃,结束反应。
(3)引物序列消化:将步骤(2)得到的两个独立引物池扩增产物混合,加入如下消化反应体系:10μL扩增产物+1μL消化反应预混液+1μL无核酸水,总体积12μL。消化反应条件:50℃保持20min,55℃保持20min,60℃保持20min,然后保持在10℃,不超过1h。
(4)连接接头:在消化产物中按照以下顺序加入试剂:连接反应缓冲液2μL、连接酶1μL、接头1μL,合计4μL;反应条件:22℃保持30min;72℃保持10min;最后保持在10℃不超过1h。
(5)将步骤(4)中获得的扩增产物按照以下方法进行纯化:在扩增产物中加入24μL纯化磁珠,混匀,室温保持5min后,置于磁力架上,直到溶液澄清后,弃掉上清,使用150μL新鲜的70%乙醇清洗磁珠两次,分别弃掉上清,短暂离心后放回磁力架上,吸尽残余液体,室温干燥5min,取下EP管加入50μL的Tris-EDTA,吹吸混匀,室温放置5min,移至磁力架上,澄清后将文库转移到干净的EP管中。
(6)将步骤(5)中的纯化产物按照下述方法进行质检:使用Real-Time PCR进行文库定量:先将标准品按照S1、S2、S3的顺序稀释,原标准品S0-68pM,10倍梯度稀释到6.8PpM、0.68pM、0.068pM,将样本文库100-200倍稀释;按照下述配制试剂:样本文库DNA浓度应≥100pM、2×Master Mix 5μL、20×TaqMan 0.5μL、样本(标准品)4.5μL;反应条件:50°保持2min,95°保持2min,然后40个循环,每个循环96°保持15sec,60°保持1min。
(7)乳液PCR和模板富集:将上述纯化并质检后文库进行qPCR定量,计算出样本上样量,然后进行乳液PCR和模板富集,按照试剂盒操作规程进行,然后进行Ion chef上机,得到loading好的芯片。
(8)在Ion GeneStudioTMS5 Plus基因测序仪上进行测序及数据分析,使用软件为iAnalyses。
(9)由遗传咨询师对得到的数据分析位点进行分析解读,数据见下表7。
表7 16个样本的测序结果与已知结果100%一致
实施例2
本实施例采用16个样本进行文库构建,采用包含LDLR、APOB、PCSK9基因的全编码区和可变剪切区(外显子向内含子外延20bp)作为目标区域的引物池进行多重反应PCR,并结合高通量测序平台Ion Torrent PGM进行DNA测序,然后检测点突变(SNP)、小片段插入缺失(InDel)。具体操作流程如下:
(1)核酸提取及质检:血细胞经过核酸提取、质检后,要求其符合一定质控标准:DNA浓度:5ng/μL;DNA纯度:OD260/280 1.8-2.0,OD260/230>2;DNA总起始量:15ng;
(2)多重PCR扩增:为了保证目标区域(待测基因全编码区,以及可变剪切区)全部被覆盖,并避免相邻扩增子的引物之间形成引物二聚体或短片段,PCR扩增引物被分离成两个独立的引物池,分别进行多重PCR扩增,每个反应为5μL,总体积为10μL。
将符合步骤(1)DNA质量标准的DNA进行多重PCR扩增,反应体系为:扩增反应预混液1μL,FH引物池2.5μL,DNA 1.5μL,合计5μL。多重PCR反应条件为:99℃保持2min,然后进行16个循环,每个循环为99℃保持15s,60℃保持4min,然后保持在10℃,结束反应。
(3)引物序列消化:将步骤(2)得到的两个独立引物池扩增产物混合,加入如下消化反应体系:10μL扩增产物+1μL消化反应预混液+1μL无核酸水,总体积12μL。消化反应条件:50℃保持20min,55℃保持20min,60℃保持20min,然后保持在10℃,不超过1h。
(4)连接接头:在消化产物中按照以下顺序加入试剂:连接反应缓冲液2μL、连接酶1μL、接头1μL,合计4μL;反应条件:22℃保持30min;72℃保持10min;最后保持在10℃不超过1h。
(5)将步骤(4)中获得的扩增产物按照以下方法进行纯化:在扩增产物中加入24μL纯化磁珠,混匀,室温保持5min后,置于磁力架上,直到溶液澄清后,弃掉上清,使用150μL新鲜的70%乙醇清洗磁珠两次,分别弃掉上清,短暂离心后放回磁力架上,吸尽残余液体,室温干燥5min,取下EP管加入50μL的Tris-EDTA,吹吸混匀,室温放置5min,移至磁力架上,澄清后将文库转移到干净的EP管中。
(6)将步骤(5)中的纯化产物按照下述方法进行质检:使用Real-Time PCR进行文库定量:先将标准品按照S1、S2、S3的顺序稀释,原标准品S0-68pM,10倍梯度稀释到6.8PpM、0.68pM、0.068pM,将样本文库100-200倍稀释;按照下述配制试剂:样本文库DNA浓度应≥100pM、2×Master Mix 5μL、20×TaqMan 0.5μL、样本(标准品)4.5μL;反应条件:50°保持2min,95°保持2min,然后40个循环,每个循环96°保持15sec,60°保持1min。
(7)乳液PCR:将上述纯化及质检后产物进行qPCR定量,上样量计算出样本上样量,然后进行油包水PCR。利用Ion PGMTMHi-QTMview OT2 Kit,One Touch 2进行测序模板富集。
反应体系表8:
表8乳液PCR反应体系
组分 | 体积 |
PCR反应液 | 800μL |
PCR酶混合液 | 50μL |
ISP微珠 | 100μL |
DNA样本文库 | 25μL |
水 | 25μL |
(8)在Ion TorrentTM PGM基因测序仪上进行测序及数据分析使用软件为iAnalyses。
(9)由遗传咨询师对得到的数据分析位点进行分析解读,数据见下表9。
表9 16个样本的测序结果与已知结果100%一致
实施例3
本实施例采用16个样本进行文库构建,采用包含LDLR、APOB、PCSK9基因的全编码区和可变剪切区(外显子向内含子外延20bp)作为目标区域的引物池进行多重反应PCR,并结合高通量测序平台Ion Torrent PGM进行DNA测序,然后检测点突变(SNP)、小片段插入缺失(InDel)。具体操作流程如下:
(1)核酸提取及质检:口腔粘膜脱落细胞经过核酸提取、质检后,要求其符合一定质控标准:DNA浓度:5ng/μL;DNA纯度:OD260/280 1.8-2.0,OD260/230>2;DNA总起始量:15ng;
(2)多重PCR扩增:为了保证目标区域(待测基因全编码区,以及可变剪切区)全部被覆盖,并避免相邻扩增子的引物之间形成引物二聚体或短片段,PCR扩增引物被分离成两个
独立的引物池,分别进行多重PCR扩增,每个反应为5μL,总体积为10μL。
将符合步骤(1)DNA质量标准的DNA进行多重PCR扩增,反应体系为:扩增反应预混液1μL,FH引物池2.5μL,DNA 1.5μL,合计5μL。多重PCR反应条件为:99℃保持2min,然后进行16个循环,每个循环为99℃保持15s,60℃保持4min,然后保持在10℃,结束反应。
(3)引物序列消化:将步骤(2)得到的两个独立引物池扩增产物混合,加入如下消化反应体系:10μL扩增产物+1μL消化反应预混液+1μL无核酸水,总体积12μL。消化反应条件:50℃保持20min,55℃保持20min,60℃保持20min,然后保持在10℃,不超过1h。
(4)连接接头:在消化产物中按照以下顺序加入试剂:连接反应缓冲液2μL、连接酶1μL、接头1μL,合计4μL;反应条件:22℃保持30min;72℃保持10min;最后保持在10℃不超过1h。
(5)将步骤(4)中获得的扩增产物按照以下方法进行纯化:在扩增产物中加入24μL纯化磁珠,混匀,室温保持5min后,置于磁力架上,直到溶液澄清后,弃掉上清,使用150μL新鲜的70%乙醇清洗磁珠两次,分别弃掉上清,短暂离心后放回磁力架上,吸尽残余液体,室温干燥5min,取下EP管加入50μL的Tris-EDTA,吹吸混匀,室温放置5min,移至磁力架上,澄清后将文库转移到干净的EP管中。
(6)将步骤(5)中的纯化产物按照下述方法进行质检:使用Real-Time PCR进行文库定量:先将标准品按照S1、S2、S3的顺序稀释,原标准品S0-68pM,10倍梯度稀释到6.8PpM、0.68pM、0.068pM,将样本文库100-200倍稀释;按照下述配制试剂:样本文库DNA浓度应≥100pM、2×Master Mix 5μL、20×TaqMan 0.5μL、样本(标准品)4.5μL;反应条件:50°保持2min,95°保持2min,然后40个循环,每个循环96°保持15sec,60°保持1min。
(7)乳液PCR:将上述纯化质检后产物进行qPCR定量,计算出样本上样量,然后进行油包水PCR,反应体系为表8;利用Ion PITMHi-QTMOT2 200Kit,One Touch 2仪器上进行反应,制备测序模板。
表10乳液PCR反应体系
组分 | 体积 |
PCR反应液 | 1920μL |
PCR酶混合液 | 120μL |
ISP微珠 | 100μL |
文库 | 80μL |
水 | 100μL |
(8)在Ion Proton基因测序仪上进行测序,在Ion GeneStudioTMS5 Plus上进行数据分析,使用软件为iAnalyses。
(9)由遗传咨询师对得到的数据分析位点进行分析解读,数据见下表9。
表10 16个样本的测序结果与已知结果100%一致
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式,并且很显然,根据上述教导,可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用,从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 北京安智因生物技术有限公司
<120> 一种家族性高胆固醇血症的基因检测文库的构建方法及其试剂盒
<160> 262
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 1
ccggaccctc aactcagttt t 21
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 2
gggcatgtga taaagagaaa ttaacaacag 30
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 3
gtggagatgc ctttcttgtc tttct 25
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 4
cacaccgtga cttcagtgc 19
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 5
acagtttggt ttttacgtgt agggtat 27
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 6
ccacttggag tgccagtttg a 21
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 7
aaagtctgcg atcttgttgg cta 23
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 8
cgtgcaaact tgacttcaga gaaatac 27
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 9
tttggtgtac acaaaggcag ttg 23
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 10
cagaagatca gatggaaaaa tgaagtcc 28
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 11
tgtggttgat tgcagctttt tcag 24
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 12
gatccagatg gaaaagggaa agagaa 26
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 13
gaggccctct agctgtaagt g 21
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 14
gatgtcaagg gttcggttct ttct 24
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 15
ttgaaatcat acttaaattc catggaggaa ga 32
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 16
agtacaaatt agagggcacc acaag 25
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 17
tgcccatggc aggaataaaa atatg 25
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 18
tccagttgtc aatgttgaag tgtct 25
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 19
gatttgatgc tctgactgat aaactcaca 29
<210> 20
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 20
gtaggaataa atggagaagc aaatctgga 29
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 21
tcttccctgt taaccttaat ggaaaacg 28
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 22
ctggctccct caacttttct aaact 25
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 23
ttccagaaga agtccatgct atgtg 25
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 24
gaacggagca tgggagtgaa 20
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 25
agtgatggaa gctgcgatac c 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 26
tgccagactt ccgtttacca g 21
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 27
aagtcaattg taaaggaagg aatgtgga 28
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 28
gaaagcattg gtagagcaag ggt 23
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 29
tccatttgat acattcggtc tcgtg 25
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 30
gaggtgactc agagactcaa tgg 23
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 31
cttgacagca tcatcaataa atccaacc 28
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 32
ttttgaagta gctgagaaaa tcaatgcc 28
<210> 33
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 33
tattcagaat ggaagtcctt aagagcaac 29
<210> 34
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 34
tgaaagaaaa cctatgcctt aatcttcata agt 33
<210> 35
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 35
ctctaacatc aatagcctca atgtgttgt 29
<210> 36
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 36
gatgagcact atcatatccg tgtaaattta gt 32
<210> 37
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 37
catatatgtc tgcagttgag atagtttttc att 33
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 38
tggaaaacgt acagagaaac ctgaa 25
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 39
cttctcaacg gcatctctca tctc 24
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 40
catcagtgca gctcttgaac ac 22
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 41
ccatttgtat gtgcatcgat ggtc 24
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 42
acacatctat gccatctctt ctgc 24
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 43
aatagggctg tagctgtaaa ttaacagttt 30
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 44
cagagctatc actgggaagt gc 22
<210> 45
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 45
ctggtagata ttccatcttg gccaat 26
<210> 46
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 46
ctgacaccaa tgggaagtat aagaactt 28
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 47
ttggtgcctt ggaggtagga 20
<210> 48
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 48
gaaacaaccc agtctcaaaa ggtttac 27
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 49
tgcacccttt acctgagcat ag 22
<210> 50
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 50
gagagttcca agtccctact tttacc 26
<210> 51
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 51
ctttcattta ctttgcatgg ttcaagaag 29
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 52
gctcatccaa gcccattacc t 21
<210> 53
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 53
tccattcaaa ttcaatcttc tcttcatctg a 31
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 54
gcagaagcca gaagtgagat cc 22
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 55
gaagattacg tagcacctct gtgg 24
<210> 56
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 56
gggatataca ctagggagga actttg 26
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 57
attgttgagg gctctctctg c 21
<210> 58
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 58
gaatctactg agggcaaaac gtctta 26
<210> 59
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 59
tacatgtctt ctcctcatga attctgaac 29
<210> 60
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 60
ctgaattgtt ttgggaacat aatcaccat 29
<210> 61
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 61
ggctagaatt aaaataggta acccggaat 29
<210> 62
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 62
ctgggaagct gaagtttatc attcct 26
<210> 63
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 63
tttaacaaga aatgcaccct ggaaga 26
<210> 64
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 64
agacttactt ttatttgctc tcccttgtt 29
<210> 65
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 65
ccaagatgcg gaggtaggc 19
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 66
agtgtctccc tgttcctcac c 21
<210> 67
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 67
gggaaagaag aaagcctcag aatca 25
<210> 68
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 68
atccaaataa ctaccttcct aaagaaagca t 31
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 69
ctttgactct tgcaccccaa gta 23
<210> 70
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 70
cccatattgc caatatcttg aactcaga 28
<210> 71
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 71
cattccccta gtaccttcca aatcc 25
<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 72
ccttttactt ccctctcctg cac 23
<210> 73
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 73
tgtttgctga tttcttattt caagtcatta cc 32
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 74
ttcaacatgg cgagggatca g 21
<210> 75
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 75
acatagctgc cttgaacaca gt 22
<210> 76
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 76
gcctcagtga tgaagcagtc a 21
<210> 77
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 77
tatccttgag tccctggaaa ctgg 24
<210> 78
<211> 22
<212> DNA
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<400> 78
aagtaccact gggaacacac ag 22
<210> 79
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 79
agcagacatt taacagggct cag 23
<210> 80
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 80
cttgggtaga tgcagagaca gg 22
<210> 81
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 81
ttgtattaat aagaggatgc tccttgctg 29
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 82
aaggatgttg cccgtgttga 20
<210> 83
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 83
tgcaaacaca caagttcata cctca 25
<210> 84
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 84
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 85
cacaccacga tgccatctca 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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cctccctcct gaaaggtgaa ac 22
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<400> 88
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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<211> 22
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 115
aggcggctta ccttcgag 18
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<211> 23
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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<400> 117
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 120
gcctcctacc tgtgaggac 19
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 122
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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cgtagacaac acgtgtgtag tca 23
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 124
catccccatc ccctcgtg 18
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 125
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 134
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 135
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 137
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 138
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 141
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 142
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 143
gacctggctc tggaaagacc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 144
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 145
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 146
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 147
ctgtggctaa cttcaatccc ctt 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 148
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 149
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 150
acaggcattc catcacaaat cct 23
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 151
gtagacgcat ttcaggaatt gttaaagg 28
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 152
ggcatccaca aacaatgaag gg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 153
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 155
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 156
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 157
tgtttgattt tccctcaata gcatttcc 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 158
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 159
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 160
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 161
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 162
catgaaggcc aaattccgag aga 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 163
ttcagctttt tgtggtagtt ccaga 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 164
aagcaatgtc ctacaacaag ttaagataaa aga 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 165
cttcatacct ctcgattaac tcatggac 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 166
acagaatata gacatccagc acctagc 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 167
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 168
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 169
ggctgctctg tattttctta caaattgatc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 170
acttttactc agtgagccca tcaatatc 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 171
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 173
tagcaacagt gtctgcttta tagctt 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 174
acttgacaac atttacagct ctgaca 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 175
tgctgtcgac acccagaatc 20
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 176
tgacaaaatt aatagtggtg ctcacaag 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 177
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 178
agcccaagag gtatttaaag ccatt 25
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 179
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 180
gctcaatgga gagtccaacc t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 181
gtggtcccca ggaactagat g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 182
ctctggaaat gtactgctta atttaaccaa tg 32
<210> 183
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 183
ggagaggcac ttgcagttga ta 22
<210> 184
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 184
tgaatgactg atgtctgact gtgg 24
<210> 185
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 185
atccatgtat ttattgactg gcagactc 28
<210> 186
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 186
ggctgaacta gtaccattca caactatt 28
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 187
ccatttggag aagcagtttg gc 22
<210> 188
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 188
tgaaccatcc ttgtatctgg ttttgat 27
<210> 189
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 189
acctcagtaa ttttcttgtt ctgaatgtcc 30
<210> 190
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 190
gcttcttacc acacatctct tgattct 27
<210> 191
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 191
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 193
ccactgagca gcttgactgg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 194
gggactgaag tatttaatga atctgaatag gtt 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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atcttttcgg gcttgtgcag 20
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
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acaacaaaga aacctgatgc catttt 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 199
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<212> DNA
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tggtgtgtca gctcaaaata tacttctt 28
<210> 203
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 203
gggtgaatag ctcttactta ctcttgg 27
<210> 204
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 204
gacagtgata accatctcct cttttga 27
<210> 205
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 205
aatgacctgc attgaagaaa agaaacaa 28
<210> 206
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 206
gggttaccaa gtcctgactc tct 23
<210> 207
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 207
ggctcagcgc atacaaggt 19
<210> 208
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 208
aggtggtctg tataacttta tccatgtct 29
<210> 209
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 209
tggacacctc aatcagctgt g 21
<210> 210
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 210
gagatgaaga aagctagagt tcctttga 28
<210> 211
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 211
acaggtttgc ctggaacaga g 21
<210> 212
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 212
atgcttttaa cagaagatac agggactg 28
<210> 213
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 213
ctggtctcta acacatgaag atgagttt 28
<210> 214
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 214
ttccagcaag ttgtaatgga gaagg 25
<210> 215
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 215
ggaaagctgt gggctctagg 20
<210> 216
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 216
cccctctctg cccagaattg 20
<210> 217
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 217
tcttctcagc tttgaagaca cttctc 26
<210> 218
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 218
tctctctgtt tagtcctctc cagataaaaa 30
<210> 219
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 219
ctcttcaccg gagacccaaa tac 23
<210> 220
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 220
cccacgtcat ttacagcatt tcaat 25
<210> 221
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 221
ccatcgctcc gtctctagc 19
<210> 222
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 222
gatgaaactc ccccaccact g 21
<210> 223
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 223
gaggtggcca gcaatagaat ct 22
<210> 224
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 224
caggacagag tcggtccagt a 21
<210> 225
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 225
cctccagcct cacagctatt c 21
<210> 226
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 226
aaccttcagg gagcagcttg 20
<210> 227
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 227
ttgtcatctt ccttgctgcc t 21
<210> 228
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 228
acgagatcat cagctatacc agaaga 26
<210> 229
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 229
cacacgcctt gtttctgcgt 20
<210> 230
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 230
gtcagaaatc agatcacctc ttcagg 26
<210> 231
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 231
gacgtttatt tattctttca gaggctgag 29
<210> 232
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 232
ctgaagggac ccgtctctg 19
<210> 233
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 233
atgcccgtgt tttcactcca 20
<210> 234
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 234
atgggctctg gctttctaga ga 22
<210> 235
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 235
gttcctgatc ggatgacatt tctgg 25
<210> 236
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 236
ataaatgcat atcatgccca aaggg 25
<210> 237
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 237
cgtccccggc tatagaatgg 20
<210> 238
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 238
gtggagctgt tgcactgga 19
<210> 239
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 239
aagatggctc ggatgagtgg 20
<210> 240
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 240
aatcactgca tgtcccacac c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 241
attatatgaa tgagtgccaa gcaaactg 28
<210> 242
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 242
acagcactca tgtctcagtc c 21
<210> 243
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 243
tacagccgcg tcctcaac 18
<210> 244
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 244
ggttcggcct ccaggaac 18
<210> 245
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 245
tcctcacctt tccaggtcat ca 22
<210> 246
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 246
gaccctgact gccaaaggg 19
<210> 247
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 247
ccgagttgag gcagagactg 20
<210> 248
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 248
gtctttgact ctaaggccca agg 23
<210> 249
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 249
cctccttaca cagacaaggg aga 23
<210> 250
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 250
gatgaggagc tgctgagctg 20
<210> 251
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 251
ccgcgtgaag tgaggagt 18
<210> 252
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 252
taggtctcct cgccaggac 19
<210> 253
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 253
ccctacaccc gcaccttg 18
<210> 254
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 254
tgcactttgg cctcacagaa 20
<210> 255
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 255
gtgctgcctg tagtgctga 19
<210> 256
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 256
gtttcttcca tgtcatcatg ttcctc 26
<210> 257
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 257
agccctatca ggaagtgcca 20
<210> 258
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 258
ttgccccatg tcgactacat c 21
<210> 259
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 259
aggtgctgag tcccaaagc 19
<210> 260
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 260
cagccacctg ctgatttgtt atag 24
<210> 261
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 261
ccaggtccag atggagagag a 21
<210> 262
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 262
gtctttgact ctaaggccca agg 23
Claims (8)
1.一种家族性高胆固醇血症的基因检测文库的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)DNA质量标准:提供受试者样本的基因组DNA,血细胞经过核酸提取、质检后,要求DNA符合一定质控标准:DNA浓度≥5ng/μL;DNA纯度OD260/280=1.8~2.0,OD260/230>2;DNA总起始量15ng;
(2)多重PCR扩增:利用上述DNA文库从高通量测序平台自动合成覆盖全部基因的扩增引物文库,对目标区域进行多重PCR扩增;所述的目标区域包含LDLR、APOB、PCSK9基因的全编码区和外显子向内含子外延20bp的可变剪切区;PCR扩增引物被分离成两个独立的引物池,分别进行多重PCR扩增;所述引物池1的引物序列为SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:132所示;所述引物池2的引物序列为SEQ ID NO:133至SEQ ID NO:262所示;
(3)引物序列消化:将步骤(2)得到的引物扩增产物混合,进行消化反应;
(4)连接测序接头:连接高通量半导体测序平台专用的测序接头,含样本标签序列,在DNA连接酶的作用下,将测序接头与步骤(3)的消化产物连接;所述高通量测序平台为IonTorrent平台,其通用测序接头序列,A端CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAG,P端CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT;所述的样本标签序列在测序接头序列A端,长度为10bp, 其在测序模板序列的位置如下:
A端接头序列+样本标签序列+GAT+文库序列+P端接头序列+磁珠;
(5)文库纯化:步骤(4)得到的连接产物中加入纯化磁珠, 混匀,置于磁力架上,直到溶液澄清后,弃掉上清,使用乙醇清洗磁珠,离心,吸尽残余液体,干燥,加入Tris-EDTA缓冲液, 吹吸混匀,室温放置,澄清后即得纯化文库;
(6)文库质检:使用Real-Time PCR对纯化文库定量质检;
(7)乳液PCR:将上述纯化及质检后产物进行qPCR定量,然后进行油包水PCR,利用IonPGM TMHi-QTMview OT2 Kit,One Touch 2进行测序模板富集;
(8)在Ion TorrentTMPGM基因测序仪上进行测序及数据分析使用软件为iAnalyses;
(9)由遗传咨询师对得到的数据分析位点进行分析解读。
2.如权利要求1所述的一种家族性高胆固醇血症的基因检测文库的构建方法,其特征在于,每个引物池反应体系为5-10μL,总体积为10-20μL;多重PCR扩增反应体系按照扩增预混液、引物池、DNA体积比为1:2.5:1.5组成;反应条件:99℃保持2min;然后进行16个循环,每个循环为99℃15s,60℃4min;最后保持在10℃不超过12h。
3.如权利要求1所述的一种家族性高胆固醇血症的基因检测文库的构建方法,其特征在于,所述步骤(3)中将步骤(2)得到的两个独立引物池扩增产物混合,将消化反应预混液、无核酸水加入到混合PCR产物,其体积比为1:1:10;反应条件:50℃保持20min,55℃保持20min,60℃保持20min,然后保持在10℃不超过1h。
4.如权利要求1所述的一种家族性高胆固醇血症的基因检测文库的构建方法,其特征在于,步骤(4)在消化产物中按照顺序加入连接接头反应体系,其中连接接头反应体系为连接反应缓冲液、DNA连接酶、接头按体积比为2:1:1组成;所述反应条件:22℃保持30min,72℃保持10min,最后保持在10℃不超过1h。
5.如权利要求1所述的一种家族性高胆固醇血症的基因检测文库的构建方法,其特征在于,所述步骤(5)将步骤(4)中获得的连接产物按照以下方法进行纯化:在连接产物中加入24μL纯化磁珠,混匀,室温保持5min后,置于磁力架上,直到溶液澄清后,弃掉上清,使用150μL新鲜的70%乙醇清洗磁珠两次,分别弃掉上清,短暂离心后放回磁力架上,吸尽残余液体,室温干燥5min,取下EP管加入50μL的Tris-EDTA, 吹吸混匀,室温放置5min,移至磁力架上,澄清后将文库转移到干净的EP管中。
6.如权利要求1所述的一种家族性高胆固醇血症的基因检测文库的构建方法,其特征在于,步骤(6)使用Real-Time PCR进行文库定量:先将标准品按照10倍梯度稀释;将样本文库100-200倍稀释,样本文库浓度应≥100pM;反应体系是由2×Master Mix、20×TaqMan、样本按体积比5:0.5:4.5组成;反应条件:50℃保持2min,95℃保持2min;然后40个循环,每个循环96℃保持15sec;60℃保持1min。
7.如权利要求1所述的一种家族性高胆固醇血症的基因检测文库的构建方法,其特征在于,所述的步骤(7)中乳液PCR反应体系
。
8.一种家族性高胆固醇血症的基因检测试剂盒,其特征在于,包括权利要求1-7任意一项中所述的基因检测文库的构建方法中使用的试剂、引物序列;所述引物序列为SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:262所示。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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