CN109680038A - 一种遗传性妇科肿瘤的基因文库构建方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种遗传性妇科肿瘤的基因文库构建方法和试剂盒，涉及ATM,BARD1,BRCA1，BRCA2，BRIP1，CDH1，CHEK2，NBN，PIK3CA，PALB2，PTEN，RAD51C，RAD51D，STK11，TP53，MSH2，MLH1，MSH6，PMS2，EPCAM共20个基因的突变。目标区域为以上20基因的编码氨基酸的外显子区域及外显子上下游各20碱基区域。为保证目标区域全部覆盖，PCR扩增过程中所必须的引物组被分离为两个独立引物组，分别进行目标区域扩增。而后将PCR产物进行测序标签连接、文库洗脱及再扩增，扩增后纯化，得到测序用文库。该建库方法步骤简单快速，有效降低了文库构建的成本，且涵盖了妇科肿瘤的相关基因。结合高通量测序仪，可快速准确得到相关基因变异，对遗传性妇科肿瘤有重要意义。

Description

一种遗传性妇科肿瘤的基因文库构建方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种遗传性妇科肿瘤的基因文库构建方法和试剂盒。
背景技术
遗传性妇科肿瘤中相关综合征以增加相关肿瘤的发生风险为特征，常见于以下患者：遗传性卵巢癌、乳腺癌综合征，结直肠癌，胰腺癌，黑色素瘤，弥漫性胃癌，子宫内膜癌等。遗传性妇科肿瘤的共同特点是遗传风险高，不仅局限于女性，对于男性的前列腺癌也增加发病风险。对于患者仅依靠目前常规病理检测的方法无法确定是否为遗传性疾病。在这种情况下，遗传性妇科肿瘤相关基因的检测就显示出巨大优势，对于患者所患肿瘤是否为遗传性疾病及患者本身的治疗方法的确定提供基因检测依据。
遗传性妇科肿瘤中，遗传性乳腺癌卵巢癌综合征(HBOCS)最为常见，有遗传性乳腺癌倾向的家族中，乳腺癌患者或其一、二级血亲中有两个或两个以上的卵巢癌患者则此家族属于遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征家族20世纪50年代首次出现家族性卵巢癌的文献报道，Lynch等于1972年首次描述了乳腺癌-卵巢癌综合征，并于1992年定义了3种明确的遗传性卵巢癌综合征：①遗传性非息肉性结肠直肠癌综合征(即LynchⅡ型)。②遗传位点特异性卵巢癌综合征。③遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征。后者为3种综合征中最为常见的一种。
遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征在普通人群中卵巢癌平均发病年龄为59岁，而在HBOCS家族中平均发病年龄为52岁。大多数均同意至少在一些卵巢癌家族中患病风险年龄提前。携带BRCA1突变基因的乳腺癌妇女自确诊时起5年内对侧乳房患癌的风险为25％，至70岁时为64％。患卵巢癌的寿命风险，在普通人群为1.4％，有1个一级亲属(母亲、姐妹、女儿)罹患者为7％后者获得遗传性卵巢癌综合征的几率为3％有综合征者，卵巢癌的寿命风险至少为40％。遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征者患乳腺癌和(或)卵巢癌的发生率增加，有一级亲属患卵巢癌几率为50％。
遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征是常染色体显性遗传，有多变的遗传外显特性1991年Narod等确认遗传性乳腺癌-卵巢癌的易感基因。重要特征是发病年龄早，根据其定义，该综合征表现为：在有乳腺癌倾向的家族中乳腺癌患者或其1、2级血亲中有两个或两个以上的卵巢癌患者并有以下临床特点：①家族中乳腺癌多呈早发表现，一般发病年龄＜50岁；②家族中卵巢癌患者发病年龄也较早，一般为49.6～55.3岁，平均52.4岁(散发性卵巢癌的发病年龄平均为59岁)；③家族中可有其他类型肿瘤患者，如子宫内膜癌消化道癌、前列腺癌等；④卵巢癌的病理类型以浆液性乳头状囊腺癌为多见并发症：感染、组织粘连。
BRCA1(BRCA1,DNA repair associated)基因编码一个多功能蛋白，该蛋白与肿瘤抑制子、DNA修复蛋白、细胞周期调控因子、RNA聚合酶全酶Ⅱ、转录因子、辅助抑制因子、染色体重塑酶、RNA加工因子等相互作用，BRCA1蛋白在维持基因组稳定性中起到至关重要的作用，并且参与了多种肿瘤生物学中重要的细胞转化过程，包括DNA修复，细胞周期进程，转录调控。BRCA1基因单拷贝的丢失或失活会导致突变的累积和基因组结构的改变，增加卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌致病风险。
BRCA2(BRCA2,DNA repair associated)基因编码的蛋白在DNA损伤应答和DNA修复反应中起到非常重要的作用。BRCA2蛋白是一个肿瘤抑制子，介导将RAD51重组酶蛋白富集到DNA双链断裂处。BRCA2蛋白的基本作用为促进同源重组，它是维持基因组完整性中重要的DNA修复机制，BRCA2基因单拷贝的丢失或失活都会导致突变的累计和基因组结构的改变，因此增加了癌症的风险。
遗传性乳腺癌-卵巢癌综合症(HBOC)是一种常染色体显性遗传病，是由BRCA1或BRCA2基因的胚系突变引起的。BRCA1/2基因的突变增加了乳腺-卵巢患癌的风险，同时BRCA2基因的突变同样也增加了其他一些癌症的风险，包括输卵管癌、腹膜癌、胰腺癌、黑色素瘤、男性前列腺癌和乳腺癌等。
ATM(ATM serine/threonine kinase)基因编码细胞核蛋白，其有助于控制细胞生长和分裂的速率。该蛋白在多种身体系统，包括神经系统和免疫系统的正常发育和活动中发挥重要作用。此外，ATM蛋白辅助细胞识别损伤或断裂的DNA链。DNA可能会被诸如有毒化学物质或辐射等物质损坏，细胞分裂染色体交换遗传物质时DNA链也可能发生断裂进而使到DNA损伤。ATM蛋白通过激活修复断裂链的酶来协调DNA修复。受损DNA链的有效修复有助于维持细胞遗传信息的稳定性。ATM突变增加卵巢癌的潜在致病风险。
BARD1(BRCA1 associated RING domain 1)该基因编码与BRCA1的N末端区域相互作用的蛋白质。除了能够在体内和体外结合BRCA1，它还与BRCA1最保守的两个区域具有同源性.
BRIP1(BRCA1 interacting protein C-terminal helicase 1)基因编码的蛋白是RecQ DEAH螺旋酶家族的一个成员，与1型乳腺癌的BRCT结构重复相关。该复合物在乳腺癌中与双链断裂修复功能相关。BRIP1突变增加卵巢癌的致病风险。
CDH1(cadherin 1)基因编码E-cadherin。E-cadherin是依赖性粘附蛋白家族成员。
可选择的剪接导致多种转录本，其中至少有一种转录本编码经蛋白水解生成成熟糖蛋白的前原蛋白。这种依赖钙的细胞-细胞粘附蛋白由5个细胞外cadherin重复序列、跨膜区域和高度保守的区域组成。该基因的突变与胃癌、乳腺癌、结直肠癌、甲状腺癌和卵巢癌有关。这种基因功能的丧失被认为是通过增加增殖、侵袭和/或转移而导致癌症进展的原因。
CHEK2(checkpoint kinase 2)基因编码了细胞周期检测点激酶2(CHK2)，该蛋白质是肿瘤抑制因子，它防止细胞生长过快或以不受控制的方式分裂。DNA可能会被诸如有毒化学物质或辐射等物质损坏，细胞分裂染色体交换遗传物质时DNA链也可能发生断裂进而使到DNA损伤。当DNA损伤或DNA链断裂时，CHK2蛋白被激活。CHK2蛋白与数种其它蛋白质，包括肿瘤蛋白P53(其由TP53基因产生)相互作用。这些蛋白质调控细胞分裂并确定细胞是否将被修复或凋亡。这个过程防止了具有突变或损伤DNA的细胞分裂，能防止肿瘤的发展。CHEK2发生突变时患结肠癌风险增加。
PIK3CA(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalyticsubunit alpha)磷脂酰肌醇3-激酶由85kDa调节亚基和110kDa催化亚基组成。该基因编码的蛋白质利用ATP磷酸化PtdIns、PtdIns4P和PtdIns(4,5)P2。该基因已被发现是致癌基因，并与卵巢癌、乳腺癌、子宫颈癌有关。
EPCAM(epithelial cell adhesion molecule)基因编码了上皮细胞粘附分子(EpCAM)，该蛋白质存在于上皮细胞中，上皮细胞是沿着体表和腔体内表面排列的细胞。EpCAM蛋白的结构跨越包围上皮细胞的膜，它帮助细胞彼此粘附。此外，可以在特定位置切割细胞膜中的蛋白质，释放“细胞内结构域(EpICD)”片段，其有助于将来自细胞外部的信号传递到细胞核。EpICD进到细胞核并与其他蛋白质形成复合物，参与调节细胞生长、分裂、分化和迁移。EPCAM基因突变增加卵巢癌、结肠癌等多种癌症患病风险。
MLH1(mutL homolog 1)基因编码了DNA修复中起重要作用的蛋白。该蛋白质有助于修复DNA复制时产生的错误。MLH1蛋白与PMS2蛋白(由PMS2基因编码)结合以形成蛋白质复合物，此复合物协调其他蛋白质修复DNA在复制时发生的错误。通过去除含有错误的DNA片段并用校正的DNA序列替换来进行修复。MLH1基因是已知错配修复(MMR)基因组的成员。MLH1基因突变增加卵巢癌、结肠癌等多种癌症患病风险。
MSH2(mutS homolog 2)基因编码了DNA修复中起重要作用的蛋白。该蛋白质有助于修复DNA复制时产生的错误。MSH2蛋白与其它两种蛋白质MSH6或MSH3结合形成蛋白质复合物，此复合物可识别DNA链上DNA复制过程中发生的错误。MSH2基因是已知错配修复(MMR)基因组的成员。MSH2基因突变增加卵巢癌、结肠癌等多种癌症患病风险。
MSH6(mutS homolog 6)基因编码了DNA修复中起重要作用的蛋白。该蛋白质有助于修复DNA复制时产生的错误。MSH6蛋白与MSH2蛋白结合以形成蛋白质复合物。此复合物可识别DNA链上DNA复制过程中发生的错误。MSH6基因是已知错配修复(MMR)基因组的成员。MSH6基因突变增加卵巢癌、结肠癌等多种癌症患病风险。
PMS2(PMS1 homolog 2,mismatch repair system component)基因编码了在DNA修复中起重要作用的蛋白，该蛋白质有助于修复DNA复制时产生的错误。PMS2蛋白与MLH1结合以形成蛋白质复合物，此复合物协调其他蛋白质修复DNA复制期间产生的错误。PMS2基因是已知为错配修复(MMR)基因组的成员。PMS2基因突变增加卵巢癌、结肠癌等多种癌症患病风险。
PALB2(partner and localizer of BRCA2)基因编码肿瘤抑制蛋白质。它在同源重组修复(HRR)起重要的作用。PALB2基因突变增加如乳腺癌患病风险。
PTEN(phosphatase and tensin homolog)基因编码了在体内几乎所有组织中都存在的一种酶，该酶作为肿瘤抑制因子，有助于调控细胞生长过快或以不受控制的方式分裂。PTEN酶是化学途径的一部分，其通过调控凋亡程序来指导细胞的分裂和凋亡。研究表明，该酶有助于控制细胞的迁移、细胞对周围组织的粘附和新血管的形成。此外，它可能在维持细胞遗传信息的稳定性中起作用。所有这些功能有助于防止可导致肿瘤形成不受控制的细胞生长。PTEN基因突变增加患乳腺癌的风险。
RAD51C(RAD51 paralog C)该基因是RAD51家族的一员。RAD51家族成员与细菌RecA和酿酒酵母RAD51高度相似，已知参与DNA同源重组和修复。该基因编码蛋白以与其他RAD51家族蛋白相互作用。这种基因的突变与范可尼贫血综合征有关。该基因是定位于染色体17q23区域的4个基因之一，该区域在乳腺肿瘤中经常发生扩增，提示可能在肿瘤进展中发挥作用。
RAD51D(RAD51 paralog D)该基因编码的蛋白质是RAD51蛋白家族的一员。RAD51家族成员与细菌RecA和酿酒酵母RAD51高度相似，已知它们参与了DNA的同源重组和修复。这种蛋白质与RAD51家族的其他成员形成复合体，包括RAD51L1,RAD51L2和XRCC2。与该蛋白形成的蛋白复合物已被证明可以催化单链DNA和双链DNA之间的同源配对，并被认为在DNA重组修复的早期阶段发挥作用。该基因突变增加乳腺癌卵巢癌综合征患病风险。
STK11(serine/threonine kinase 11)该基因编码了丝氨酸/苏氨酸激酶11。该酶是肿瘤抑制基因，它有助于防止细胞生长和分裂过快或以不受控制的方式分裂。这种酶帮助某些细胞在组织内正确地定向自身(极化)。该激酶还促进细胞凋亡(一种程序性细胞死亡过程)。丝氨酸/苏氨酸激酶11除了肿瘤抑制因子的作用，在胎儿正常发育中也起到重要作用。STK11基因突变增加患非上皮性卵巢癌的风险。
NBN(nibrin)该基因编码蛋白是MRE11/RAD50双链断裂修复复合体的成员，该复合体由5个蛋白质组成。这种基因产物被认为参与DNA双链断裂修复和DNA损伤诱导检查点激活。
TP53(tumor protein p53)该基因编码了肿瘤蛋白p53，该蛋白质是肿瘤抑制因子，它防止细胞生长太快或以不受控制的方式分裂。p53蛋白位于所有细胞的细胞核内，直接结合于DNA上。当细胞中的DNA被有毒化学品、辐射或紫外线(UV)等损伤时，该蛋白质能决定是修复DNA还是让细胞凋亡。如果DNA可以修复，p53激活其他基因来修复损伤；如果DNA不能修复，这种蛋白质阻止细胞分裂并调控其进行凋亡。通过阻止具有突变或损伤的DNA的细胞分裂，p53有助于防止肿瘤的发展。因为p53能调节细胞分裂和防止肿瘤形成，所以它被称为“基因组的守护者”。TP53基因突变患乳腺癌风险增加。
传统的Sanger测序技术在检测基因核苷酸变异应用中为常用检测手段，但对于检测ATM,BARD1,BRCA1，BRCA2，BRIP1，CDH1，CHEK2，NBN，PIK3CA，PALB2，PTEN，RAD51C，RAD51D，STK11，TP53，MSH2，MLH1，MSH6，PMS2，EPCAM基因的编码氨基酸的外显子区域及附近内含子区域的基因突变存在很大局限性，表现在：检测通量受到限制，该方法仅适用于少数明确突变热点的检测，而对于候选基因数量多且为候选基因的全部编码区段时难以实现的。需要消耗大量时间，且对于待检测样本的基因组DNA消耗巨大，在实践中同一样本难以获得满足检测需求的足量DNA。因而在日常实践中难以采用Sanger方法进行多基因全部编码区段的检测需求。
采用高通量基因测序技术检测ATM,BARD1,BRCA1，BRCA2，BRIP1，CDH1，CHEK2，NBN，PIK3CA，PALB2，PTEN，RAD51C，RAD51D，STK11，TP53，MSH2，MLH1，MSH6，PMS2，EPCAM基因的突变，需要进行测序前样本文库的制备。如在样本文库制备过程中采用基因组DNA片段化方法，则后续会存在DNA末端修复、加A尾等步骤，不仅过程繁复且对于基因组DNA的需求在100ng以上，对于福尔马林固定石蜡包埋样本会存在所提取DNA量不足问题。且DNA片段化需要借助DNA破碎仪，DNA片段化后需要利用磁珠富集DNA片段，需要投入仪器的维护产生了额外的操作及成本。
因此，有必要寻找一种新的检测遗传性妇科肿瘤相关基因突变的方法，以实现检测，降低劳动强度及检测成本。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种遗传性妇科肿瘤的基因文库构建方法，该方法建库步骤简便快速，有效降低成本，检测变异类型全面、检测准确率达到100％，且可同时对多个样本进行检测。
本发明的另一目的是提供该方法获得的遗传性妇科肿瘤的基因检测文库。
本发明的另一目的是提供所述文库制备的遗传性妇科肿瘤的基因检测试剂盒。
为实现上述目的，本发明提供了一种遗传性妇科肿瘤的基因检测文库，涉及目标区域为以上20基因的编码氨基酸的外显子区域及外显子上下游各20碱基区域。为保证目标区域全部覆盖，PCR扩增过程中所必须的引物组被分离为两个独立引物组，分别进行目标区域扩增，而后将PCR产物进行测序标签连接、文库洗脱及再扩增，扩增后纯化，得到测序用文库。
本发明的一种遗传性妇科肿瘤的基因文库构建方法，包括如下步骤：
(1)DNA质量标准：受试者样本的基因组DNA，经过核酸提取、质量检测后，要求基因组DNA符合相应的控制标准；
(2)目标区域扩增：利用上述(1)DNA及合成的5’端磷酸化修饰的相应引物组，对目标区域进行PCR扩增；
(3)测序标签连接：在DNA连接酶作用下利用上述步骤(2)的PCR产物连接高通量测序平台专用测序标签，测序标签含有区分样本的特异性标签序列；
(4)文库纯化：步骤(3)的产物中加入纯化磁珠后混匀纯化；
(5)产物洗脱及扩增：在上述步骤(4)中加入PCR扩增预混液，进行PCR扩增反应；
(6)扩增产物纯化：在上述步骤(5)的PCR产物中加入磁珠纯化即得文库；
(7)文库质检：使用Qubit荧光计对步骤(6)中文库进行定量质检。
本发明上述的遗传性妇科肿瘤的基因检测文库构建方法，所述目标区域包含以下基因的全编码区和可变剪切区(外显子向内含子外延20bp)：ATM,BARD1,BRCA1，BRCA2，BRIP1，CDH1，CHEK2，NBN，PIK3CA，PALB2，PTEN，RAD51C，RAD51D，STK11，TP53，MSH2，MLH1，MSH6，PMS2，EPCAM。
上述步骤(1)中所述的核酸提取的样本类型包括但不限于外周血、口腔拭子、肿瘤冰冻组织、福尔马林固定石蜡包埋样本等，优选核酸样本为外周血白细胞、口腔黏膜脱落细胞。
上述步骤(1)中所述的DNA质控标准为，DNA浓度≥1ng/μL；DNA纯度：OD260/2801.8-2.0，OD260/230>2；DNA总起始量:2ng。
步骤(1)中所述的核酸提取方法、DNA质控方法均按照现有技术的操作规程进行。
上述步骤(2)中为了保证目标区域(待测基因全编码区，以及可变剪切区)可全部被扩增，并避免相邻扩增子的引物之对DNA模板产生竞争结合，优选PCR扩增引物被分离成两个独立的引物组，分别进行目标区域扩增。所用两个独立的引物组中每条引物为5’端磷酸化修饰引物。引物组氨基酸序列见表2。
进一步优选每个引物组反应体系为5-10μL，总体积为10-20μL。更优选每个引物组反应体系为5μL，总体积为10μL。
上述步骤(2)中所述的目标区域扩增反应体系按照下述体积比组成，PCR扩增预混液：引物组：DNA＝1:1:3；具体反应体系及反应条件见表1。
所述PCR扩增预混液为包含DNTP，DNA聚合酶，Tris-HCL，Mg2+按照现有技术配置成的混合液或购买获得。
表1目标区域扩增反应体系组分及反应条件表
表2引物组氨基酸序列(简称GO108引物组)
本发明步骤(3)中所述的连接预混液为含Tris-HCL的溶液，按照现有技术制备或购买获得。
本发明上述步骤(3)连接高通量半导体测序平台专用的测序标签(含区分样本的特异性标签序列)，在DNA连接酶的作用下，将测序标签与步骤2的产物连接。所述连接标签反应体系按照下述体积比组成，连接反应缓冲液：DNA连接酶：测序标签＝2:1:1。具体反应体系及反应条件见表3。
表3连接接头反应体系组分及反应条件表
本发明所述平台通用测序标签序列，A端CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAG，P端
CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT。优选是Ion Torrent平台通用测序接头序列。
本发明所述的样本标签序列在测序接头序列A端，长度为10bp,其在测序模板序列的位置如下：
A端接头序列+样本特异性标签+GAT+文库序列+P端接头序列+磁珠
CCATCTCATCCCT*G*CGTGTCTCCGACTCAG+CTAAGGTAAC+GAT+NNNNN+
CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT+磁珠；其中GAT序列是固定序列，为了均衡测序接头的链接效率。所述NNNNN为文库序列。
所述样本特异性标签见下表4：
步骤(4)所述的纯化过程：步骤(3)的产物中加入纯化磁珠后混匀，放置于磁力架上吸附磁珠，待溶液澄清后弃掉上清，采用70％乙醇清洗两遍磁珠，室温晾干磁珠。
步骤(4)中所述连接反应产物与纯化磁珠的体积比为1:1.5。
进一步优选，步骤(4)所述的纯化过程：在连接产物中加入21μL纯化磁珠,涡旋混匀后，室温吸附2～5min，而后置于磁力架上，待溶液澄清后，弃掉上清，使用100μL 70％乙醇清洗磁珠三次，最后一次清洗时需将可见液体全部移除，保持离心管在磁力架上晾干磁珠。
步骤(5)所述的产物洗脱及扩增过程：待磁珠晾干后将离心管从磁力架上取下，加入50μLPCR扩增预混液及2μLPCR引物的混合液，涡旋混匀后，室温静止2～5min吸附，而后置于磁力架上，待溶液澄清后将上清吸取至新的PCR管中按照下述反应条件进行PCR扩增。具体反应体系及反应条件见表5。
所述PCR引物的序列：5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTC，5'-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG
表5文库扩增反应条件
步骤(6)扩增产物纯化：在上述步骤(5)的PCR产物中加入磁珠，混匀后置于磁力架上吸附磁珠，吸取上清液，在上清液中加入相应体积的磁珠混匀后置于磁力架上进行吸附，带溶液澄清后弃掉上清，采用70％乙醇清洗两遍磁珠，室温晾干磁珠，加入Tris-EDTA，上清液即为文库。
步骤(6)中PCR产物与纯化磁珠两轮纯化，其体积比为1:0.5:1.2。
进一步优选，步骤(6)所述的扩增产物纯化过程：在上述步骤5扩增后的文库中加入25μL磁珠，涡旋混匀后，室温吸附2～5min，而后置于磁力架上，待溶液澄清后，吸取上清至新的离心管中并加入60μL磁珠，将离心管置于磁力架上吸附磁珠，待溶液澄清后，弃掉上清，保持离心管在磁力架上，使用100μL 70％乙醇清洗磁珠三次，最后一次清洗时需将可见液体全部移除，保持离心管在磁力架上晾干磁珠，加入Tris-EDTA，涡旋混匀后室温静置2～5min，而后将离心管置于磁力架上吸附磁珠，此时上清液即为文库。
步骤(7)所述文库质检过程：使用Qubit荧光剂对文库进行定量质检。两个独立引物组的扩增产物均在125-275bp，结合Ion平台测序标签后，平均长度为275bp，18ng/mL为100pM。
本发明上述步骤(3)、步骤(7)所述的高通量半导体为Ion Torrent。
本发明一种遗传性妇科肿瘤的基因文库构建方法，包括如下步骤
(1)核酸提取及质检：外周血样本所提取基因组DNA、质检后，要求其符合一定质控标准：DNA浓度:≥1ng/μL；DNA纯度：OD260/280 1.8-2.0，OD260/230>2；DNA总起始量:≥2ng；
(2)目标区域扩增：利用上述(1)DNA及合成的5’端磷酸化修饰的相应引物组，对目标区域进行PCR扩增，为了保证目标区域待测基因全编码区，以及可变剪切区可全部被扩增，并避免相邻扩增子的引物之对DNA模板产生竞争结合，PCR扩增引物被分离成两个独立的引物组，分别进行目标区域扩增；每个反应体系为5～10μL，总体系为10～20μL；反应体系为：PCR扩增预混液1μL，引物组1μL，DNA 3μL，合计5μL；目标区域扩增反应条件为：99℃保持2min，而后进行16～19个循环的扩增过程，每个循环为99℃保持15s，60℃保持4～8min，最终在10℃保持不超过12h，反应结束；
(3)测序标签连接：将步骤(2)得到的两个独立引物组扩增产物混合，加入如下测序标签连接反应体系：10μL扩增产物、2μL连接反应缓冲液、1μLDNA连接酶、1μL测序标签，总体积14μL，连接反应条件：22℃保持30min,72℃保持5～20min，而后保持在10℃，不超过1h；
(4)文库纯化：将步骤(3)中获得的连接产物按照以下方法进行纯化：在连接产物中加入21μL纯化磁珠,涡旋混匀后，室温吸附2～5min，而后置于磁力架上，待溶液澄清后，弃掉上清，使用100μL70％乙醇清洗磁珠三次，最后一次清洗时需将可见液体全部移除，保持离心管在磁力架上晾干磁珠；
(5)产物洗脱及扩增：将步骤(4)中的纯化产物按照下述方法进行洗脱及扩增：待磁珠晾干后将离心管从磁力架上取下，加入50μLPCR扩增预混液及2μLPCR引物的混合液，涡旋混匀后，室温静止2～5min吸附，而后置于磁力架上，待溶液澄清后将上清吸取至新的PCR管中按照下述反应条件进行PCR扩增；反应条件：98℃保持2min，而后进行5～10个循环的扩增过程，每个循环98℃保持15sec，64℃保持1min，而后保持在10℃，不超过12h。程序结束；
(6)扩增产物纯化：在步骤(5)扩增后的文库中加入25μL磁珠，涡旋混匀后，室温吸附2～5min，而后置于磁力架上，待溶液澄清后，吸取上清至新的离心管中并加入60μL磁珠，将离心管置于磁力架上吸附磁珠，待溶液澄清后，弃掉上清，保持离心管在磁力架上，使用100μL 70％乙醇清洗磁珠三次，最后一次清洗时需将可见液体全部移除，保持离心管在磁力架上晾干磁珠，加入Tris-EDTA，涡旋混匀后室温静置2～5min，而后将离心管置于磁力架上吸附磁珠，此时上清液即为文库；
(7)文库质检：使用Qubit荧光剂对文库进行定量质检。按照现有标准操作流程进行。两个独立引物组的扩增产物均在125-275bp，结合Ion平台测序标签后，平均长度为275bp，18ng/mL为100pM。本发明的制备方法还包括步骤(8)-(10)。
(8)测序模板制备：将步骤7中文库根据质检结果稀释至18ng/mL，将稀释后的20个样本文库等体积混合，根据Ion 510TM&Ion 520TM&Ion 530TMKit–Chef试剂盒操作规程利用Ion Chef进行测序模板；
(9)利用Ion GeneStudio S5基因测序仪及步骤8所得产物进行测序过程，所得测序结果利用iAnalyses进行下机数据分析并得到单碱基突变(SNP)、小片段插入缺失(InDel)结果；
(10)由遗传咨询师对步骤9所得数据进行解读。
本发明的另一目的是提供该方法获得的遗传性妇科肿瘤的基因检测文库。
本发明的另一目的是提供所述文库制备的遗传性妇科肿瘤的基因检测试剂盒，其包括文库构建试剂及序列。
所述的建库试剂包括但不限于PCR扩增预混液、连接反应缓冲液、DNA连接酶等。
所述的序列包括所述引物序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:294。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明的文库采用高通量基因测序技术检测ATM,BARD1,BRCA1，BRCA2，BRIP1，CDH1，CHEK2，NBN，PIK3CA，PALB2，PTEN，RAD51C，RAD51D，STK11，TP53，MSH2，MLH1，MSH6，PMS2，EPCAM的基因突变，不涉及基因组DNA片段化，DNA末端修复、加A尾等步骤，操作简单，对DNA需求量低，可适用于福尔马林固定石蜡包埋样本。
2、本发明的文库避免了化学打断法，不依赖于酶切方法进行基因组DNA片段化，不容易造成污染等问题。
3、本发明的文库避免了物理打断法中DNA破碎仪的使用，无需投入DNA破碎仪，减少了仪器维护及操作产生的费用，节约了成本。
4、本发明提供一种遗传性妇科肿瘤的基因文库构建方法和试剂盒检测变异类型全面、准确率高达到100％、通量高。
附图说明
图1是根据本发明的方法构建的外周血DNA文库2100生物分析仪检测结果。
图2是根据本发明的方法构建的福尔马林固定石蜡包埋DNA文库2100生物分析仪检测结果。
图3是根据本发明的文库构建及序列测定流程图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
实施例1
采用20个外周血样本提取的基因组DNA进行文库构建，采用包含ATM,BARD1,BRCA1，BRCA2，BRIP1，CDH1，CHEK2，NBN，PIK3CA，PALB2，PTEN，RAD51C，RAD51D，STK11，TP53，MSH2，MLH1，MSH6，PMS2，EPCAM，共20基因的编码氨基酸的外显子区域及外显子上下游各20碱基区域作为目标区域的引物组进行目标区域扩增反应，并结合高通量测序平台IonGeneStudio S5进行测序，对于待检测样本进行单碱基突变(SNP)、小片段插入缺失(InDel)检测及分析。具体操作流程如下：
(3)核酸提取及质检：外周血样本所提取基因组DNA、质检后，要求其符合一定质控标准：DNA浓度:≥1ng/μL；DNA纯度：OD260/280 1.8-2.0，OD260/230>2；DNA总起始量:≥2ng；
(4)目标区域扩增：利用上述(1)DNA及合成的5’端磷酸化修饰的相应引物组，对目标区域进行PCR扩增。为了保证目标区域(待测基因全编码区，以及可变剪切区)可全部被扩增，并避免相邻扩增子的引物之对DNA模板产生竞争结合，优选PCR扩增引物被分离成两个独立的引物组，分别进行目标区域扩增。每个反应体系为5～10μL，总体系为10～20μL。将符合步骤(1)DNA质量标准的DNA进行目标区域扩增，反应体系为：PCR扩增预混液1μL，GO108引物组1μL，DNA 3μL，合计5μL。目标区域扩增反应条件为：99℃保持2min，而后进行16～19个循环的扩增过程，每个循环为99℃保持15s，60℃保持4～8min，最终在10℃保持不超过12h，反应结束。
(3)测序标签连接：将步骤(2)得到的两个独立引物组扩增产物混合，加入如下测序标签连接反应体系：10μL扩增产物+2μL连接反应缓冲液+1μLDNA连接酶+1μL测序标签，总体积14μL。连接反应条件：22℃保持30min,72℃保持5～20min，而后保持在10℃，不超过1h。
(4)文库纯化：将步骤(3)中获得的连接产物按照以下方法进行纯化：在连接产物中加入21μL纯化磁珠,涡旋混匀后，室温吸附2～5min，而后置于磁力架上，待溶液澄清后，弃掉上清，使用100μL70％乙醇清洗磁珠三次，最后一次清洗时需将可见液体全部移除，保持离心管在磁力架上晾干磁珠。
(5)产物洗脱及扩增：将步骤(4)中的纯化产物按照下述方法进行洗脱及扩增：待磁珠晾干后将离心管从磁力架上取下，加入50μLPCR扩增预混液及2μLPCR引物的混合液，涡旋混匀后，室温静止2～5min吸附，而后置于磁力架上，待溶液澄清后将上清吸取至新的PCR管中按照下述反应条件进行PCR扩增；反应条件：98℃保持2min，而后进行5～10个循环的扩增过程，每个循环98℃保持15sec，64℃保持1min，而后保持在10℃，不超过12h。程序结束。
(6)扩增产物纯化：在步骤(5)扩增后的文库中加入25μL磁珠，涡旋混匀后，室温吸附2～5min，而后置于磁力架上，待溶液澄清后，吸取上清至新的离心管中并加入60μL磁珠，将离心管置于磁力架上吸附磁珠，待溶液澄清后，弃掉上清，保持离心管在磁力架上，使用100μL 70％乙醇清洗磁珠三次，最后一次清洗时需将可见液体全部移除，保持离心管在磁力架上晾干磁珠，加入Tris-EDTA，涡旋混匀后室温静置2～5min，而后将离心管置于磁力架上吸附磁珠，此时上清液即为文库。
(7)文库质检：使用Qubit荧光剂对文库进行定量质检。按照现有标准操作流程进行。两个独立引物组的扩增产物均在125-275bp，结合Ion平台测序标签后，平均长度为275bp，18ng/mL为100pM。
(8)测序模板制备：将步骤7中文库根据质检结果稀释至18ng/mL，将稀释后的20个样本文库等体积混合，根据Ion 510TM&Ion 520TM&Ion 530TMKit–Chef试剂盒操作规程利用Ion Chef进行测序模板。
(9)利用Ion GeneStudio S5基因测序仪及步骤8所得产物进行测序过程，所得测序结果利用iAnalyses进行下机数据分析并得到单碱基突变(SNP)、小片段插入缺失(InDel)结果。
(10)由遗传咨询师对步骤9所得数据进行解读，数据见下表6。
表6 20例样本的测序结果与Sanger证结果100％一致
样本编号 基因 碱基改变 氨基酸改变 Sanger验证结果
HEIT4669 BRCA2 c.8021dupA p.Ile2675Aspfs*6 一致
OIFB9682 BRCA1 c.4327C>T p.Arg1443Term 一致
B00684 CDH1 c.2076T>C p.Ala692Ala 一致
B00685 BRIP1 c.3440delA p.Asn1147fs 一致
B00686 ATM c.5948A>G p.Asn1983Ser 一致
B00687 CDH1 c.2076T>C p.Ala692Ala 一致
B00688 BRIP1 c.3411T>C p.Tyr1137Tyr 一致
B00689 BARD1 c.1518_1519CA — 一致
B00690 EPCAM c.458G>C p.Arg153Thr 一致
B00691 PMS2 c.1621A>G p.Lys541Glu 一致
B00692 PMS2 c.1454C>A p.Thr485Lys 一致
B00693 MSH2 IVS12-6T>C — 一致
B00694 PMS2 IVS11-4C>T — 一致
B00695 NBN c.1197T>C p.Asp399Asp 一致
B00696 PMS2 IVS11-4C>T — 一致
B00697 RAD51D c.234C>T p.Ser78Ser 一致
B00698 BARD1 c.70C>T p.Pro24Ser 一致
B00699 CHEK2 c.252A>G p.Glu84Glu 一致
B00700 MLH1 c.1151T>A p.Val384Asp 一致
B00701 PMS2 c.1621A>G p.Lys541Glu 一致
实施例2
采用20个福尔马林固定石蜡包埋样本提取的基因组DNA进行文库构建，采用包含ATM,BARD1,BRCA1，BRCA2，BRIP1，CDH1，CHEK2，NBN，PIK3CA，PALB2，PTEN，RAD51C，RAD51D，STK11，TP53，MSH2，MLH1，MSH6，PMS2，EPCAM，共20基因的编码氨基酸的外显子区域及外显子上下游各20碱基区域作为目标区域的引物组进行目标区域扩增反应，并结合高通量测序平台Ion Torrent PGM进行测序，对于待检测样本进行单碱基突变(SNP)、小片段插入缺失(InDel)检测及分析。具体操作流程如下：
(1)核酸提取及质检：外周血样本所提取基因组DNA、质检后，要求其符合一定质控标准：DNA浓度:≥1ng/μL；DNA纯度：OD260/280 1.8-2.0，OD260/230>2；DNA总起始量:≥2ng；
(2)目标区域扩增：利用上述(1)DNA及合成的5’端磷酸化修饰的相应引物组，对目标区域进行PCR扩增。为了保证目标区域(待测基因全编码区，以及可变剪切区)可全部被扩增，并避免相邻扩增子的引物之对DNA模板产生竞争结合，优选PCR扩增引物被分离成两个独立的引物组，分别进行目标区域扩增。每个反应体系为5～10μL，总体系为10～20μL。将符合步骤(1)DNA质量标准的DNA进行目标区域扩增，反应体系为：PCR扩增预混液1μL，GO108引物组1μL，DNA 3μL，合计5μL。目标区域扩增反应条件为：99℃保持2min，而后进行16～19个循环的扩增过程，每个循环为99℃保持15s，60℃保持4～8min，最终在10℃保持不超过12h，反应结束。
(3)测序标签连接：将步骤(2)得到的两个独立引物组扩增产物混合，加入如下测序标签连接反应体系：10μL扩增产物+2μL连接反应缓冲液+1μLDNA连接酶+1μL测序标签，总体积14μL。连接反应条件：22℃保持30min,72℃保持5～20min，而后保持在10℃，不超过1h。
(4)文库纯化：将步骤(3)中获得的连接产物按照以下方法进行纯化：在连接产物中加入21μL纯化磁珠,涡旋混匀后，室温吸附2～5min，而后置于磁力架上，待溶液澄清后，弃掉上清，使用100μL70％乙醇清洗磁珠三次，最后一次清洗时需将可见液体全部移除，保持离心管在磁力架上晾干磁珠。
(5)产物洗脱及扩增：将步骤(4)中的纯化产物按照下述方法进行洗脱及扩增：待磁珠晾干后将离心管从磁力架上取下，加入50μLPCR扩增预混液及2μLPCR引物的混合液，涡旋混匀后，室温静止2～5min吸附，而后置于磁力架上，待溶液澄清后将上清吸取至新的PCR管中按照下述反应条件进行PCR扩增；反应条件：98℃保持2min，而后进行5～10个循环的扩增过程，每个循环98℃保持15sec，64℃保持1min，而后保持在10℃，不超过12h。程序结束。
(6)扩增产物纯化：在步骤(5)扩增后的文库中加入25μL磁珠，涡旋混匀后，室温吸附2～5min，而后置于磁力架上，待溶液澄清后，吸取上清至新的离心管中并加入60μL磁珠，将离心管置于磁力架上吸附磁珠，待溶液澄清后，弃掉上清，保持离心管在磁力架上，使用100μL 70％乙醇清洗磁珠三次，最后一次清洗时需将可见液体全部移除，保持离心管在磁力架上晾干磁珠，加入Tris-EDTA，涡旋混匀后室温静置2～5min，而后将离心管置于磁力架上吸附磁珠，此时上清液即为文库。
(7)文库质检：使用Qubit荧光剂对文库进行定量质检。按照现有标准操作流程进行。两个独立引物组的扩增产物均在125-275bp，结合Ion平台测序标签后，平均长度为275bp，18ng/mL为100pM。
(8)测序模板制备：将步骤7中文库根据质检结果稀释至18ng/mL，将稀释后的20个样本文库等体积混合，根据Ion PGMTMHi-QTMview OT2Kit试剂盒操作规程利用One Touch 2系统进行测序模板制备。反应体系见7：
表7 One Touch 2系统模板制备反应体系：
组分 体积
扩增反应预混液 800μL
扩增酶 50μL
ISP微珠 100μL
混合后文库 2μL
无核酸酶水 48μL
(9)利用Ion TorrentTMPGM基因测序仪及步骤8所得产物进行测序过程，所得测序结果利用iAnalyses进行下机数据分析并得到单碱基突变(SNP)、小片段插入缺失(InDel)结果。
(10)由遗传咨询师对步骤9所得数据进行解读，数据见下表8
表8 20例样本的测序结果与Sanger证结果100％一致
实施例3
采用20个口腔拭子样本提取的基因组DNA进行文库构建，采用包含ATM,BARD1,BRCA1，BRCA2，BRIP1，CDH1，CHEK2，NBN，PIK3CA，PALB2，PTEN，RAD51C，RAD51D，STK11，TP53，MSH2，MLH1，MSH6，PMS2，EPCAM，共20基因的编码氨基酸的外显子区域及外显子上下游各20碱基区域作为目标区域的引物组进行目标区域扩增反应，并结合高通量测序平台IonTorrent PGM进行测序，对于待检测样本进行单碱基突变(SNP)、小片段插入缺失(InDel)检测及分析。具体操作流程如下：
(3)核酸提取及质检：外周血样本所提取基因组DNA、质检后，要求其符合一定质控标准：DNA浓度:≥1ng/μL；DNA纯度：OD260/280 1.8-2.0，OD260/230>2；DNA总起始量:≥2ng；
(4)目标区域扩增：利用上述(1)DNA及合成的5’端磷酸化修饰的相应引物组，对目标区域进行PCR扩增。为了保证目标区域(待测基因全编码区，以及可变剪切区)可全部被扩增，并避免相邻扩增子的引物之对DNA模板产生竞争结合，优选PCR扩增引物被分离成两个独立的引物组，分别进行目标区域扩增。每个反应体系为5～10μL，总体系为10～20μL。将符合步骤(1)DNA质量标准的DNA进行目标区域扩增，反应体系为：PCR扩增预混液1μL，GO108引物组1μL，DNA 3μL，合计5μL。目标区域扩增反应条件为：99℃保持2min，而后进行16～19个循环的扩增过程，每个循环为99℃保持15s，60℃保持4～8min，最终在10℃保持不超过12h，反应结束。
(3)测序标签连接：将步骤(2)得到的两个独立引物组扩增产物混合，加入如下测序标签连接反应体系：10μL扩增产物+2μL连接反应缓冲液+1μLDNA连接酶+1μL测序标签，总体积14μL。连接反应条件：22℃保持30min,72℃保持5～20min，而后保持在10℃，不超过1h。
(4)文库纯化：将步骤(3)中获得的连接产物按照以下方法进行纯化：在连接产物中加入21μL纯化磁珠,涡旋混匀后，室温吸附2～5min，而后置于磁力架上，待溶液澄清后，弃掉上清，使用100μL70％乙醇清洗磁珠三次，最后一次清洗时需将可见液体全部移除，保持离心管在磁力架上晾干磁珠。
(5)产物洗脱及扩增：将步骤(4)中的纯化产物按照下述方法进行洗脱及扩增：待磁珠晾干后将离心管从磁力架上取下，加入50μLPCR扩增预混液及2μLPCR引物的混合液，涡旋混匀后，室温静止2～5min吸附，而后置于磁力架上，待溶液澄清后将上清吸取至新的PCR管中按照下述反应条件进行PCR扩增；反应条件：98℃保持2min，而后进行5～10个循环的扩增过程，每个循环98℃保持15sec，64℃保持1min，而后保持在10℃，不超过12h。程序结束。
(6)扩增产物纯化：在步骤(5)扩增后的文库中加入25μL磁珠，涡旋混匀后，室温吸附2～5min，而后置于磁力架上，待溶液澄清后，吸取上清至新的离心管中并加入60μL磁珠，将离心管置于磁力架上吸附磁珠，待溶液澄清后，弃掉上清，保持离心管在磁力架上，使用100μL 70％乙醇清洗磁珠三次，最后一次清洗时需将可见液体全部移除，保持离心管在磁力架上晾干磁珠，加入Tris-EDTA，涡旋混匀后室温静置2～5min，而后将离心管置于磁力架上吸附磁珠，此时上清液即为文库。
(7)文库质检：使用Qubit荧光剂对文库进行定量质检。按照现有标准操作流程进行。两个独立引物组的扩增产物均在125-275bp，结合Ion平台测序标签后，平均长度为275bp，18ng/mL为100pM。
(8)测序模板制备：将步骤7中文库根据质检结果稀释至18ng/mL，将稀释后的20个样本文库等体积混合，根据Ion PI Hi-QTMview OT2 Kit试剂盒操作规程利用One Touch 2系统进行测序模板制备。反应体系见9
表9 One Touch 2系统模板制备反应体系：
组分 体积
扩增反应预混液 1920μL
扩增酶 120μL
ISP微珠 100μL
混合后文库 80μL
无核酸酶水 100μL
(9)利用Ion Proton基因测序仪及步骤8所得产物进行测序过程，所得测序结果利用iAnalyses进行下机数据分析并得到单碱基突变(SNP)、小片段插入缺失(InDel)结果。
(10)由遗传咨询师对步骤9所得数据进行解读，数据见下表10。
表10 20例样本的测序结果与Sanger证结果100％一致
样本编号 基因 碱基改变 氨基酸改变 Sanger验证结果
MTBX0809 BRCA2 p.Ile2675Aspfs*6 c.8021dupA 一致
VWET1781 BRCA1 — c.5277+1G>A 一致
1812 TP53 c.875A>T p.K292I 一致
CNAX2657 STK11 c.1062C>G p.Phe354Leu 一致
MDSC3260 BARD1 c.70C>T p.Pro24Ser 一致
1812 EPCAM c.344T>C p.Met115Thr 一致
1813 MLH1 c.1103C>T p.Ser368Leu 一致
1814 PMS2 c.1621A>G p.Lys541Glu 一致
1815 NBN c.1651delA p.Arg551fs 一致
1816 BRCA2 c.5351delA p.Asn1784Thrfs*7 一致
1817 BRCA1 c.4327C>T p.Arg1443Term 一致
1818 TP53 c.215C>G p.Pro72Arg 一致
1819 BRCA2 c.5073delA p.Lys1691Asnfs*15 一致
1820 PALB2 c.676A>T p.Thr226Ser 一致
1821 BRIP1 c.3654A>G p.Ile1218Met 一致
1822 BRCA2 c.8021dupA p.Ile2675Aspfs*6 一致
1823 BARD1 c.1075_1095del p.359_365del 一致
1824 MSH2 IVS12-6T>C — 一致
1825 CHEK2 c.1160C>T p.Thr387Ile 一致
1826 NBN c.1651delA p.Arg551fs 一致
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 北京安智因生物技术有限公司
<120> 一种遗传性妇科肿瘤的基因文库构建方法和试剂盒
<160> 294
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 1
ccagatcctt ggagatttct caatctt 27
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 2
tgaaaggatt ccactgaaag ttttctga 28
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 3
taagcgcctg attcgagatc ct 22
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 4
gacttacaca caaaagtaat atcacaacag aa 32
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 5
catgctcaag ttcttgtgtt tgtgt 25
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 6
agcaatttca attcttcaaa gacaccat 28
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 7
aaatctgttt tactgacgtt gatagctg 28
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 8
tcacagtgac ctaaggaagc ttctaata 28
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 9
ggtaatatat gccttttgag ctgtcttg 28
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 10
acattgaagg tgtcaaccaa taaacttc 28
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 11
tttatttcac aggcttaacc aatacgtg 28
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 12
ccaagagcaa gactttgcaa aatattct 28
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 13
ctgctttcta cacatgttca gggat 25
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 14
gtgcttttag tgggattcca tcttaaat 28
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 15
attctgttta tgaaggagtt atgtgtgtgt 30
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 16
aacatactga aataacctca gcactaca 28
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 17
cagttgggta cagtcatggt aatgc 25
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 18
tcatgctaag taactatctt aagggttgc 29
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 19
aatttcaatg gatcaccccc atcac 25
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 20
agccttgaac cgattttaga tggc 24
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 21
gccctttgct attctcagat gactc 25
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 22
acccaaccaa atggcatctt ttatatgt 28
<210> 23
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 23
tgactggctt atttgtatga tactggtt 28
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 24
atctgaaaaa ctgacaacag gacctt 26
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 25
cactcgcctg taacttgaac tactt 25
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 26
cgtggccatc acaatagact ttc 23
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 27
attttaatca gtcacctgta gctgttga 28
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 28
tgagagagat atagtgctca cttgatactt 30
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 29
ctcatgtggt tttatgcagc agatg 25
<210> 30
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 30
tattctgagc tgtgtgctag aggtaa 26
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 31
tcagcaaacc taagaatgtg ggatac 26
<210> 32
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 32
aaagtaaatc cagtcctgcc aatgag 26
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 33
caaaacccct aatctaagca tagcattc 28
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 34
acctgaaaga gaaatgggaa atgagaac 28
<210> 35
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 35
ctgcttatag gttcagcttt cgttttg 27
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 36
gcgtaaaagg agacctacat cagg 24
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 37
aaaggacccc atatagcaca ggt 23
<210> 38
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 38
tcctactttg acactttgaa tgctctt 27
<210> 39
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 39
aggaatccca aattaataca ctcttgtg 28
<210> 40
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 40
tgttaaagtt cattggaaca gaaagaaatg g 31
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 41
gggactacta ctatatgtgc attgagagtt 30
<210> 42
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 42
aaaacctgta gttcaactaa acagagga 28
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 43
aaaaataccg aaagaccaaa aatcagaact 30
<210> 44
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 44
tgagtgacct gattctaaac actggta 27
<210> 45
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 45
tcaatccaga ctctgaagaa cttttctc 28
<210> 46
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 46
cactattttt gttctcctct gcaagaac 28
<210> 47
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 47
agggaaacac tcagattaaa gaagatttgt 30
<210> 48
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 48
tgcaattctt ctggtttctg atcaaaga 28
<210> 49
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 49
cagcaaactg aaaaacctct tcttacaa 28
<210> 50
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 50
ccattttagt tttcactgtg cgaaga 26
<210> 51
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 51
acaagacaaa caacagttgg tattagga 28
<210> 52
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 52
ggcagtttag aatctgtcag ttcatcat 28
<210> 53
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 53
tttgatagat ttaattacaa gtcttcagaa tgc 33
<210> 54
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 54
actctgtcat aaaagccatc agtattgt 28
<210> 55
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 55
aactagtagt gcagataccc aaaaagtg 28
<210> 56
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 56
tcaatgactg atttttacca agagtgc 27
<210> 57
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 57
actcagtatc aacaactacc ggtaca 26
<210> 58
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 58
ctattaggtc cacctcagaa caagatg 27
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 59
ggcaccaaat acgaaacacc cata 24
<210> 60
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 60
gtcgtttcag tctgagataa tcttctga 28
<210> 61
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 61
atagttatta ccttgttgcc tctaccct 28
<210> 62
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 62
tccagaatac tgaaacattt gagttcca 28
<210> 63
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 63
tttacatctc catgagtagg aagaaggt 28
<210> 64
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 64
ggaagaaact aaaggcctgt ccat 24
<210> 65
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 65
cttgacaagt tgatgaagtg ccatt 25
<210> 66
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 66
ctgggctgta gagaatgatt gatgttta 28
<210> 67
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 67
tgtactttaa agaggtcact tcaagtgt 28
<210> 68
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 68
ccaaattttc cctgggttta ccttttt 27
<210> 69
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 69
agcacatggt taaatattct ggttccat 28
<210> 70
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 70
aagacctttc tttggaaacc ctctaag 27
<210> 71
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 71
ccagaacctc gaactatatt cttctgt 27
<210> 72
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 72
gcaaagttgc caaaataaaa ctcaggta 28
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 73
gagtcacccg gttccatcta c 21
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 74
aatttctcgg cccctttcca a 21
<210> 75
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 75
atttctttcg tgttcaaacc acgga 25
<210> 76
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 76
tattgaggaa ctttgataat cttaaagaag cca 33
<210> 77
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 77
aaagacccac agctaacatc atacttag 28
<210> 78
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 78
agagacagag tctggccatg tta 23
<210> 79
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 79
aatcacctcc taccagtctg tgc 23
<210> 80
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 80
gcagactatg ttaatctttt tattttatgg caa 33
<210> 81
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 81
ccttgagttg gaaagagttt tattggc 27
<210> 82
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 82
cataaagccc atcattgttc tggag 25
<210> 83
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 83
gggaaggaac cttgtgtttt taaattctg 29
<210> 84
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 84
catggtccca taaaattccc tgtg 24
<210> 85
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 85
ttggatgctc cgttaaagct tg 22
<210> 86
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 86
acccggctgg aaattttatt tgaag 25
<210> 87
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 87
ttttctcttt tccccttggg attagtatc 29
<210> 88
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 88
ggacctccat taactagtgc aaattca 27
<210> 89
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 89
gtaccttttg gatcaaatga tgcttgtt 28
<210> 90
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 90
agtggccttt gctttttaaa aataactact 30
<210> 91
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 91
gggtaatatg ggcagtaact ctgtc 25
<210> 92
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 92
ccatgagtac tatcacccca gtttg 25
<210> 93
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 93
cacagtgcgc cttttcgac 19
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 94
ctctctgagg cgggaaagga 20
<210> 95
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 95
gcgaggcgcc tgttgat 17
<210> 96
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 96
gccgccttcg cgtgagg 17
<210> 97
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 97
ctttctgctc tggaaggatt caaagta 27
<210> 98
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 98
agcttggtca taatcagagt caaagc 26
<210> 99
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 99
tctttaaaag aaacctcact ccccatg 27
<210> 100
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 100
tctttaacaa ctgcatttgc tattgcc 27
<210> 101
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 101
acccggccct tattgtttat aaatacat 28
<210> 102
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 102
ccccatcacc ctaacataaa taacaact 28
<210> 103
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 103
tctgaatttt tgttccattt tggagacttt 30
<210> 104
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 104
caggatgctt aggtaataaa ggagttgc 28
<210> 105
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 105
aacacagcaa ctattacatc ctgaaaca 28
<210> 106
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 106
agacaatatg tgcactcatt tgtgga 26
<210> 107
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 107
caccataatg gaccaaagtg caatttaa 28
<210> 108
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 108
gcacttatgc atgatttacc atctttgc 28
<210> 109
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 109
aataagtctg tctggacata aacaagca 28
<210> 110
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 110
cttacttctc ggtcagtgta ctgc 24
<210> 111
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 111
tgatatttgt gtgaggtgac ttcttcct 28
<210> 112
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 112
ttctctcatt aactaaagtc agctctcc 28
<210> 113
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 113
atcaagtgtg atagatgtct tttctcca 28
<210> 114
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 114
gcctgaatga aatgtcactg attctttc 28
<210> 115
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 115
tctttcagat tctttcaaga ctcaagcc 28
<210> 116
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 116
ctggattaaa caaaaatgaa acaaccaagc 30
<210> 117
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 117
tttttatggc agtcaaacct tctctct 27
<210> 118
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 118
agagaaagta tctacctaaa tccacagatt at 32
<210> 119
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 119
atcggccatg cagaaactga c 21
<210> 120
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 120
ccagccaaac ataaacaaaa gtatataagt aat 33
<210> 121
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 121
gcagtaaagg tcatgcatga caaatt 26
<210> 122
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 122
accacctcaa taagtcccac aca 23
<210> 123
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 123
ttgtgatctt ccaaatctac agagttcc 28
<210> 124
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 124
tcagaatatt tcttcggaag tcctgtac 28
<210> 125
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 125
aaaaataagg aaacacatta gctaaaagct ttaga 35
<210> 126
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 126
gccttagaat gcgttgatat caatgttac 29
<210> 127
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 127
aagttgagat gttgagatag aaaactgaaa a 31
<210> 128
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 128
tcatgtatat tttgttgtta tagcacttga ga 32
<210> 129
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 129
atcaacctga gaggctgaca tg 22
<210> 130
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 130
aggaacatgt ggactctcag ga 22
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 131
gtttgattgc tgcatatttc agatatttct ttc 33
<210> 132
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 132
catcacaaag tatctttttc tgtggcttag 30
<210> 133
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 133
cccttccgct ttacgtctga 20
<210> 134
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 134
ccatcaggag tcgttacctt tgc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 135
atgttgcatt tttatgtttc tccactcc 28
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 136
gtatgctcct gctcaagaag ttcc 24
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 137
ggcagtaaac agcaggcgtt a 21
<210> 138
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 138
actctttaga ggctgaaacc ttgc 24
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 139
acccattagt acgctgaagc tc 22
<210> 140
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 140
accagtgctt gaaagaaatg tcttact 27
<210> 141
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 141
gcagcatttc aggctggata c 21
<210> 142
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 142
gttcatacac acggccttgg g 21
<210> 143
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 143
caccggtggc accctcaa 18
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 144
accagatgtc caccttgaag c 21
<210> 145
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 145
cccaattgca ggtaaaacag tcaag 25
<210> 146
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 146
agcactaagc gaggtaagca ag 22
<210> 147
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 147
tgatacgaga tcgtgctgtt cca 23
<210> 148
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 148
gggacactgt aatcactaga ttctcttt 28
<210> 149
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 149
tatccaggat atgccacctt taactc 26
<210> 150
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 150
attctcctac cttggctttc tggaata 27
<210> 151
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 151
acccggccta tgtttatata ctttttaaag taa 33
<210> 152
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 152
actttataag cttaacagaa cacatcagtt 30
<210> 153
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 153
aggaggtttc tgaaatgtgt atagcttg 28
<210> 154
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 154
tgtttttcgc agatagggct aca 23
<210> 155
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 155
tttggaagtt cactggtcta tgaacaa 27
<210> 156
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 156
agaaggaatg ttctattatt aaactcatca tgt 33
<210> 157
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 157
tgcaattata aacaaaagtg ttgtcttcat g 31
<210> 158
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 158
tgtcctatat gtgatccgca gttg 24
<210> 159
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 159
actcattttt actcaaacta ttgggtgga 29
<210> 160
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 160
tttgcgagaa gtgtcgaaga ca 22
<210> 161
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 161
tctggttttc tgttgatatc tttgattact t 31
<210> 162
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 162
ttgttgttta gaatgaggag agaggca 27
<210> 163
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 163
attgttctct gtgtacttca ggctcta 27
<210> 164
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 164
gtctaaaaca tggtcttgca agatcaaa 28
<210> 165
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 165
tctctctcta attcctcata ggcctct 27
<210> 166
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 166
tgtttgcatt tgctaaggcc agtata 26
<210> 167
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 167
taggcagcag gctggaaaat tatatt 26
<210> 168
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 168
ccattcaaga acaccacttc gc 22
<210> 169
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 169
ttaagcatag gctcagcata ctacac 26
<210> 170
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 170
ccctatgtta aaatgaagca gtgctc 26
<210> 171
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 171
ctcagaatgc tggttctaca tctcttag 28
<210> 172
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 172
tgagcaaata gagtctccag acactaa 27
<210> 173
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 173
gaaacggaag atttgaaaag attctgc 27
<210> 174
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 174
cgaggagcct ttcatccga 19
<210> 175
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 175
ggtggaagtg tttgctacca agttta 26
<210> 176
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 176
tgttgctgaa accatacagc ttcataa 27
<210> 177
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 177
agaattttgc ttaagatatc agtgtttggc 30
<210> 178
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 178
caaagtattt cattttcttg gtgccattt 29
<210> 179
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 179
aatgttatta cggctaattg tgctcact 28
<210> 180
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 180
caaatgtagt atcaaaggag gctctagg 28
<210> 181
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 181
ttcagtacaa ttaggtgggc ttagattt 28
<210> 182
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 182
tcctaaccca atagaatcac tcgaaaaa 28
<210> 183
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 183
aggaaaatac cagcttcata gacaaagg 28
<210> 184
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 184
ccatgccttt aaccacttct ctgtatta 28
<210> 185
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 185
acattttgta cttcttcaac gcgaag 26
<210> 186
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 186
ggacgttgtc attagttctt tggttt 26
<210> 187
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 187
cttttggtaa ctcagactca gcatca 26
<210> 188
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 188
aactgaggct ctttagcttc ttagg 25
<210> 189
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 189
gaattctttg ccacgtattt ctagcc 26
<210> 190
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 190
gataccctga aatgaagaag ccactg 26
<210> 191
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 191
cccatggaaa agaatcaaga tgtatgtg 28
<210> 192
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 192
cctttcatta gctacttgga agacaaaatt 30
<210> 193
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 193
tgaacctgca gaagaatctg aacataaa 28
<210> 194
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 194
tctccccagt ctaccatatt gcatta 26
<210> 195
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 195
aattcagcct tagcttttta cacaagtt 28
<210> 196
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 196
ggaatagctg ttagacatgc tactgtt 27
<210> 197
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 197
tcttcactat tcacctacgt ctagacaa 28
<210> 198
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 198
cccaaaacat gaatgttctc aacaagt 27
<210> 199
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 199
atgtgaggta gattgtaaag tcaaaggc 28
<210> 200
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 200
ttgaccaggt gcggtaaaat ttg 23
<210> 201
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 201
aaacagtgga attctagagt cacacttc 28
<210> 202
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 202
acagcatacc acccatctgt aagt 24
<210> 203
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 203
aacatttaaa tgataatcac ttcttccatt gc 32
<210> 204
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 204
cataaactaa caagcactta tcaaaactga aa 32
<210> 205
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 205
tgacatactt tgcaatgaag cagaaaac 28
<210> 206
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 206
ggagccacat aacaaccaca ttttc 25
<210> 207
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 207
taaatttcac tccacttacc taccaagg 28
<210> 208
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 208
cagtactgaa aaacaaaata aaatctctac cc 32
<210> 209
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 209
tagtcacgac taaatcactt ctaattcact 30
<210> 210
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 210
ctgctgaaat agtgtgtgta aggatga 27
<210> 211
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 211
aactttactc acgtttttcc catctagc 28
<210> 212
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 212
gcagattgct cagattacta gagagc 26
<210> 213
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 213
ggaaagtaaa tcttcacccc accaa 25
<210> 214
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 214
tgtaaggcgt gtctcaatat ttgacat 27
<210> 215
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 215
ttgaggatcc aatggagatt ttgatcac 28
<210> 216
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 216
ttagttacac aacctttggg cttgg 25
<210> 217
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 217
ccggcctatt gttggttttc aaaataa 27
<210> 218
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 218
ccagtgtccg gattaatctc cag 23
<210> 219
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 219
tgcttctggc cttctttatc tttgg 25
<210> 220
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 220
acctcttact aatcattgct tcttccg 27
<210> 221
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 221
acagagcctc tggatagaga acg 23
<210> 222
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 222
caggtcaaga ggtgtcaagt taagc 25
<210> 223
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 223
ccacagctta gtcttcagat atcaga 26
<210> 224
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 224
cccggccagt ttgcagtc 18
<210> 225
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 225
ctgagacttc tgcccagact tc 22
<210> 226
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 226
acaagcctaa ggcattgtgc 20
<210> 227
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 227
tacaatataa cttagctggg acatgagagt 30
<210> 228
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 228
aaactctttc caactcaagg cacat 25
<210> 229
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 229
gctcctaaaa acgaaccaat aggaaga 27
<210> 230
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 230
aaacgtctag atgctcaacg gaa 23
<210> 231
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 231
ctgttaacca gattccacag cca 23
<210> 232
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 232
agtggagagc tactattttc agaaacg 27
<210> 233
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 233
aaatggaagc agcagttcag ataac 25
<210> 234
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 234
aagataacac tggtgttgag acagg 25
<210> 235
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 235
ctgtttttca tggcgtagta aggtttt 27
<210> 236
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 236
aagtggtata atcatgtggg taactgc 27
<210> 237
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 237
tgcagcaaat tgacttcttt aaatgaagag 30
<210> 238
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 238
gccaggtgac attcagaaca ttattagt 28
<210> 239
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 239
tgaattggga agaggaactt ctacct 26
<210> 240
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 240
ggtagtaagt ttcccattac caagttct 28
<210> 241
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 241
gagtttggat ttttcctttt tgcttataaa att 33
<210> 242
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 242
tatggaatcc acatacccaa ctccaa 26
<210> 243
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 243
aggtgcttaa aggtatgact tcagagt 27
<210> 244
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 244
taatgtcact gcatctagca ccattc 26
<210> 245
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 245
ccaaacgatg aagcctcact tttac 25
<210> 246
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 246
cagtaacaag cacacaatag gctttg 26
<210> 247
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 247
gcttgtccta aaagctatgg ctttaatg 28
<210> 248
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 248
gccaggcaaa cttcccttaa aattaaa 27
<210> 249
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 249
ggctgaaagt agtttctgat ggagt 25
<210> 250
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 250
tctacaggga tttgagtgaa aggc 24
<210> 251
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 251
ccgtcctgac agatcaacat ttttac 26
<210> 252
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 252
gccaccatat ttctagaaaa cgcgatta 28
<210> 253
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 253
atattttgtg atttcaaccc ccttactg 28
<210> 254
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 254
cgtgtacatg tgtatgtgtc tatcaact 28
<210> 255
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 255
agaaacacgt caaaccattc ttaaacg 27
<210> 256
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 256
aaaatcagct ctgtagaaac acatgc 26
<210> 257
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 257
gccttcctag acaagtcatt atcttcag 28
<210> 258
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 258
catgtccaat tgccagagga aagta 25
<210> 259
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 259
caatctgagt gaatcagtgc caaaga 26
<210> 260
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 260
acaagttaca catcaaaacc catcttg 27
<210> 261
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 261
tacccaactt tctctgaaac ctgtgata 28
<210> 262
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 262
cctcacatca ccccattttt ccttata 27
<210> 263
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 263
tttttaagga acactgtcca ttggca 26
<210> 264
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 264
cataagagag aaggtttgac tgccataa 28
<210> 265
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 265
ctacctgaaa ctcatggtgg ttttgt 26
<210> 266
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 266
ggccaaacct ctggctaact g 21
<210> 267
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 267
ttcagaatgt taccttatgg ttgtctgt 28
<210> 268
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 268
gttctaactc agaggaatac acaaacac 28
<210> 269
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 269
atgccagtgt gtgaatttga tatggtta 28
<210> 270
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 270
gacacaggta gaagactgca ctatagta 28
<210> 271
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 271
aacaaaagct tttcctcttg tagcaaaat 29
<210> 272
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 272
cacttgcctg taatcctagc tacttc 26
<210> 273
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 273
cgactgcaag cttgagca 18
<210> 274
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 274
caagtgaaac gtgtttgtca agtca 25
<210> 275
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 275
aaactttacc ttatctcttt tcttagttca tct 33
<210> 276
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 276
tctttccagt tctgacattt gtcaaaagtt a 31
<210> 277
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 277
tcacttaaat ggtatttgag attaggaaaa aga 33
<210> 278
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 278
tctttaactc tacctcactc taacaagc 28
<210> 279
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 279
actagtgata gtggatggta ttgctttt 28
<210> 280
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 280
ggcaaacgct attttgacat ttctagac 28
<210> 281
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 281
ctgaggaact cctagaggtg aaac 24
<210> 282
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 282
ggaagcagaa tctaacggag actg 24
<210> 283
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 283
gcttgggatg gactttttaa aaagacac 28
<210> 284
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 284
gacagatgag gaaaaaccaa gtgtg 25
<210> 285
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 285
ttaaacagta acatgctcat tggtggt 27
<210> 286
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 286
aagccgattg gccttgg 17
<210> 287
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 287
gaggccagtc acaatggaca g 21
<210> 288
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 288
ctagcgcggg ctatgctc 18
<210> 289
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 289
gattgccaac ggcctgga 18
<210> 290
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 290
caccccctag cggctgtg 18
<210> 291
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 291
gctaggctaa gctatgatgt tcctt 25
<210> 292
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 292
agctaactaa cttcagaaca ccaactt 27
<210> 293
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 293
tatctgagca gcgctcatgg t 21
<210> 294
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artifial Sequence)
<400> 294
tttatctgtt cacttgtgcc ctgac 25

Claims (10)

1.一种遗传性妇科肿瘤的基因文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)DNA质量标准：受试者样本的基因组DNA，经过核酸提取、质量检测后，要求基因组DNA符合相应的控制标准；
(2)目标区域扩增：利用上述(1)DNA及合成的5’端磷酸化修饰的相应引物组，对目标区域进行PCR扩增；
(3)测序标签连接：在DNA连接酶作用下利用上述步骤(2)的PCR产物连接高通量测序平台专用测序标签，测序标签含有区分样本的特异性标签序列；
(4)文库纯化：步骤(3)的产物中加入纯化磁珠后混匀纯化；
(5)产物洗脱及扩增：在上述步骤(4)中加入PCR扩增预混液，进行PCR扩增反应；
(6)扩增产物纯化：在上述步骤(5)的PCR产物中加入磁珠纯化即得文库；
(7)文库质检：使用Qubit荧光计对步骤(6)中文库进行定量质检。
2.如权利要求1所述的一种遗传性妇科肿瘤的基因文库构建方法，其特征在于，上述步骤(1)中所述的DNA质控标准为，采用Qubit荧光计测量DNA浓度≥1ng/μL；DNA纯度：OD260/280＝1.8-2.0，OD260/230>2；DNA总起始量:2ng。
3.如权利要求1所述的一种遗传性妇科肿瘤的基因文库构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述的目标区域包含以下基因的编码氨基酸的外显子区域及外显子上下游各20碱基区域：ATM,BARD1,BRCA1，BRCA2，BRIP1，CDH1，CHEK2，NBN，PIK3CA，PALB2，PTEN，RAD51C，RAD51D，STK11，TP53，MSH2，MLH1，MSH6，PMS2，EPCAM。
4.如权利要求1所述的一种遗传性妇科肿瘤的基因文库构建方法，其特征在于，步骤(2)中进行目标区域PCR扩增的引物组为两个独立的引物组，分别进行目标区域扩增，每个引物的扩增产物长度均在125-275bp。
5.如权利要求4所述的一种遗传性妇科肿瘤的基因文库构建方法，其特征在于，每个独立的引物组反应体系为5-10μL，2个引物组总反应体积为10-20μL；目标区域扩增反应体系按照下述体积比组成扩增体系PCR扩增预混液：引物组：DNA＝1:1:3；反应条件：99℃保持2min；然后进行16～19个循环，每个循环为99℃15s，60℃4～8min；最后保持在10℃不超过12h。
6.如权利要求1所述的一种遗传性妇科肿瘤的基因文库构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中将步骤(2)得到的两个独立引物组扩增产物混合，加入连接酶、连接预混液、测序标签，其体积比为1:2:1；反应条件：22℃保持30min；72℃保持5～10min；最后保持在10℃不超过1h。
7.如权利要求1所述的一种遗传性妇科肿瘤的基因文库构建方法，其特征在于，步骤(4)中所述连接反应产物与纯化磁珠的体积比为1:1.5；步骤(6)中PCR产物与纯化磁珠的体积比为1:0.5:1.2。
8.如权利要求1所述的一种遗传性妇科肿瘤的基因文库构建方法，其特征在于，步骤(5)中所述再扩增反应条件：98℃保持2min；然后进行5-10个循环，每个循环为98℃15s，64℃1min；最后保持在10℃不超过12h。
9.如权利要求1所述的一种遗传性妇科肿瘤的基因文库构建方法，其特征在于，步骤(7)使用Qubit荧光剂进行文库定量质检：两个独立引物组的扩增产物均在125-275bp，结合Ion平台测序标签后，平均长度为275bp，18ng/mL为100pM。
10.一种遗传性妇科肿瘤的基因文库构建方法，其特征在于，包括权利要求1-9任意一项中所述的基因检测文库的建库试剂及引物组序列，所述引物序列SEQ ID NO 1至SEQ IDNO 294。
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