CN111635942A

CN111635942A - 评估女性恶性肿瘤风险的突变基因群、文库及试剂盒

Info

Publication number: CN111635942A
Application number: CN202010572421.7A
Authority: CN
Inventors: 徐盈; 杨红; 张建芳; 李佳; 郭芬芬; 宋婷婷; 黎昱; 李春艳; 郑娇
Original assignee: Air Force Medical University of PLA
Current assignee: Air Force Medical University of PLA
Priority date: 2020-06-22
Filing date: 2020-06-22
Publication date: 2020-09-08

Abstract

本发明公开了评估女性恶性肿瘤风险的突变基因群、文库及试剂盒，属于生物医学分子检测技术领域。本发明的一组评估女性恶性肿瘤风险的突变基因群，包括ATM、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CHEK2、EPCAM、MLH1、MSH2、MSH6、NBN、NF1、PALB2、PMS2、PTEN、RAD51C、RAD51D、STK11、TP53、BARD1、MRE11A、MUTYH、RAD50、XRCC2和FANCC5共25个基因中的一种或几种。本发明能对女性恶性肿瘤相关遗传学标识进行广泛的筛查和检验，准确率更高，为女性恶性肿瘤发病风险的预测、预防和诊断提供依据。

Description

评估女性恶性肿瘤风险的突变基因群、文库及试剂盒

技术领域

本发明属于生物医学分子检测技术领域，具体涉及评估女性恶性肿瘤风险的突变基因群、文库及试剂盒。

背景技术

乳腺癌是一种起源于乳腺上皮组织的恶性肿瘤，占女性肿瘤的四分之一，严重危害妇女的健康。近年来，随着早期筛查的增加和治疗方法的改善，乳腺癌的生存和预后得到了明显改善，但总体情况仍不理想。根据统计，2012年全世界大约有170万例乳腺癌新病例和52万例与乳腺癌相关的死亡，到2018年，乳腺癌新病例数增加到210万例，死亡人数是大约630,000。随着生活方式和生育模式的改变，乳腺癌的发病率和死亡率正不断攀升，日益成为全球严重的健康负担。卵巢癌也是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，高居女性生殖恶性肿瘤死亡率首位。据统计，晚期卵巢癌患者的5年生存率仅为20％-30％，而早期卵巢癌5年生存率超过90％。已有的研究发现癌症本质上是一类遗传物质损伤导致的基因病疾病，多种癌症都具有显著的家族聚集性，其中有5％-10％的肿瘤具有明确的遗产性。ACOG发布了遗产性肿瘤筛查指南指出遗产性肿瘤的风险评估是确认患者和家属是否可能发展为某些类型癌症的关键。乳腺癌和卵巢癌的发生与家族遗传史密切相关。研究显示，当女性有一个一级亲属(母亲、女儿或姐妹)患有乳腺癌和卵巢癌时，其乳腺癌和卵巢癌的患病风险会比一般人群高1.75倍；当有两个或两个以上一级亲属患有乳腺癌和卵巢癌时，其乳腺癌和卵巢癌的患病风险会比一般人群高2.5倍以上。因此，乳腺癌、卵巢癌在内的遗产性癌症综合征的快速准确的检测及其风险评估是目前国内外研究的热点。

临床上对乳腺癌/卵巢癌检测方法检测主要包括X线诊断、超声显像检查、细胞学及组织学诊断等，这些方法尽管已经提高了乳腺癌/卵巢癌诊断率，但这些检测方法针对性不强，检出率低，不能早期诊断出癌症最精确的临床肿瘤检查只能发现0.5cm以上的肿块，肿块发现时，往往已经错失最佳治疗时机。另外，一些基因水平的检测手段如荧光原位杂交(FISH)、实时荧光定量PCR(real-time PCR)、基因芯片和Sanger测序等被用于乳腺癌/卵巢癌分子学水平诊断。FISH检测法能直接和准确的判断靶基因是否存在扩增，但是检测过程繁琐、价格昂贵；基因芯片技术可检测人数多，位点多，时间短，但是仅用于已公布的基因位点，价格高；Real-time PCR法检测灵敏，但对实验体系要求较高，结果的重复性较差。随着越来越多与女性恶性肿瘤相关的易感基因被鉴定，现有的检测方法均无法满足女性恶性肿瘤早筛查，早诊断，早治疗的临床需求。

因此，提供一组基因群，有助于女性恶性肿瘤的筛查、诊断，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的之一在于，提供一组评估女性恶性肿瘤风险的突变基因群，有助于有助于女性恶性肿瘤的筛查、诊断及治疗。

本发明的目的之二在于，提供一种基于高能量测序检测女性恶性肿瘤的DNA文库。

本发明的目的之三在于，提供该DNA文库的构建方法。

本发明的目的之四在于，提供该DNA文库的应用。

本发明的目的之五在于，提供一种评估女性恶性肿瘤风险的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明所述的一组评估女性恶性肿瘤风险的突变基因群，包括ATM、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CHEK2、EPCAM、MLH1、MSH2、MSH6、NBN、NF1、PALB2、PMS2、PTEN、RAD51C、RAD51D、STK11、TP53、BARD1、MRE11A、MUTYH、RAD50、XRCC2和FANCC5共25个基因中的任意一种或几种。

本发明的技术方案中，所述25个基因总共携带1024个突变位点。

具体地，所述1024个突变位点如下所示：

chr1:45794962-45795096、chr1:45795026-45795159、chr1:45796146-45796229、

chr1:45796187-45796284、chr1:45796842-45796984、chr1:45796892-45797025、

chr1:45797078-45797202、chr1:45797100-45797269、chr1:45797307-45797444、

chr1:45797395-45797538、chr1:45797642-45797796、chr1:45797816-45797980、

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chr1:45798406-45798519、chr1:45798567-45798653、chr1:45798728-45798822、

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chr1:45799098-45799280、chr1:45799187-45799363、chr1:45800005-45800175、

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chr10:89624163-89624343、chr10:89653754-89653853、chr10:89653813-89653932、

chr10:89685246-89685336、chr10:89690737-89690904、chr10:89692697-89692868、

chr10:89692814-89692991、chr10:89692862-89693037、chr10:89711816-89711984、

chr10:89711888-89712025、chr10:89717595-89717748、chr10:89717693-89717867、

chr10:89720575-89720759、chr10:89720755-89720875、chr10:89720784-89720927、

chr10:89725023-89725156、chr10:89725174-89725268、chr11:94153277-94153359、

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chr11:94189379-94189530、chr11:94192538-94192694、chr11:94192583-94192756、

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chr11:94219209-94219386、chr11:94223983-94224079、chr11:94224001-94224129、

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chr9:97873467-97873636、chr9:97873656-97873840、chr9:97873750-97873888、

chr9:97873850-97873937、chr9:97876886-97877020、chr9:97879580-97879687、

chr9:97887347-97887486、chr9:97888773-97888898、chr9:97897617-97897771、

chr9:97897638-97897812、chr9:97905761-97905844、chr9:97912172-97912318、

chr9:97912214-97912388、chr9:97933350-97933434、chr9:97934290-97934394、

chr9:97934380-97934539、chr9:98002918-98003017、chr9:98002936-98003107、

chr9:98009701-98009815、chr9:98011374-98011555、chr9:98011516-98011627、

chrX:11315015-11315084。

本发明所述的一种基于高通量测序评估女性恶性肿瘤风险的DNA文库，包括上述的突变基因群。

本发明所述的DNA文库的构建方法，包括以下步骤：

针对所述突变基因群的1024个突变位点，将DNA样品进行多重PCR扩增，获得PCR扩增产物；

纯化回收所述PCR扩增产物，所述PCR扩增产物构成所述DNA文库。

本发明的技术方案中，所述的DNA文库的构建方法还包括将所述DNA文库依次进行末端修复、3’末端添加碱基A、连接测序接头以及纯化回收连接产物的步骤。

本发明的DNA文库在制备诊断试剂盒中的应用，所述试剂盒用于检测女性恶性肿瘤的突变基因。

本发明的评估女性恶性肿瘤风险的试剂盒，包括扩增上述的突变基因群中突变位点的引物。

所述引物是针对上述1024个突变位点、采用常规方法设计的，用于扩增该1024个位点。试剂盒中所述引物最少为1对，最多为1024对。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的突变基因群，包含与女性恶性肿瘤，如卵巢癌、乳腺癌相关的25个基因，1024个突变位点，可以对女性恶性肿瘤相关遗传学标识进行广泛的筛查和检验，准确率更高，为女性恶性肿瘤发病风险的预测、预防和诊断提供依据。

本发明可以快速有效提供肿瘤风险提示，最大程度实现肿瘤早发现、早干预，降低受检者患癌几率，并能明确导致家族性肿瘤发生的原因，预测家族成员及后代的患病风险，辅助肿瘤的早期诊断，及时给予受检者遗传咨询。

本发明依托于高通量测序平台，采用多重PCR靶向捕获技术，高效率扩增目标基因的目标区域，构建高通量测序文库，进行高通量深度测序，全面检测目标基因的点突变、插入和缺失；具有超高的多重PCR扩增能力，包含近1100个复制子，对目标区域实现100％覆盖。

本发明所需的样本种类多样：包括血液、唾液、组织等，适于多种应用；且样本需求量低：受检者基因组DNA样本仅需10～100ng。

附图说明

附图1为样本1的采用本发明与Sanger测序的结果对比图，其中1-A为本发明的突变基因群测定结果，1-B为Sanger测序结果。

附图2为样本2的采用本发明与Sanger测序的结果对比图，其中2-A为本发明的突变基因群测定结果，2-B为Sanger测序结果。

附图3为样本3的采用本发明与Sanger测序的结果对比图，其中3-A为本发明的突变基因群测定结果，3-B为Sanger测序结果。

附图4为样本1的采用本发明与Sanger测序的结果对比图，其中4-A为本发明的突变基因群测定结果，4-B为Sanger测序结果。

附图5为样本5的采用本发明与Sanger测序的结果对比图，其中5-A为本发明的突变基因群测定结果，5-B为Sanger测序结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例公开了本发明的DNA文库的构建方法，具体为：

1、DNA提取与稀释：提取后的DNA使用Nanodrop检测浓度，将所有样本DNA均稀释至30ng/μl，每个稀释后的样本的终体积为12μl。

2、在冰上操作进行PCR扩增，实验体系的配制如下：

按照检测样本数量配制体系，25个基因共设计3套引物池，每个样本第一轮进行3管不同引物池的扩增。分装时，先将上述配制完成的MIX分装成3管，每管再加入11×样本数μl的引物，混匀后，取16μl分装到对应样本数量的PCR管中，每个样本稀释的DNA取4μl加入，同时标记好引物池及样本编号。

反应程序

其中，3套引物共计1024对引物，是针对所述1024个突变位点、采用常规方法设计的，用于扩增该1024个位点。1024对引物随机分为3套。

3、纯化：

1)将每个样本的3个不同引物池扩增产物混合成1管；

2)全部吸出(约60μl)，转移至一个新的EP管中；

3)每管加入84μl的磁珠，吹打混匀5次，室温静置5分钟；

4)放入磁力架，5分钟后，吸上清加入新的EP管里，弃磁珠；(去大片段)

5)在上清管里加入96μl的磁珠，室温静置5分钟；

6)放入磁力架，放置5分钟，弃上清，留磁珠；(去小片段)

7)每个EP管里，加入200μl的80％的乙醇，将EP管迅速转动180度，连续转动2次，弃上清；

8)重复步骤7)；

9)室温干燥(不能干燥到磁珠裂开)；

10)加入28μl DNase-free Water，吹打混匀，放置磁力架；

11)吸取25μl上清液，至新的EP管中，做好标记。

4、末端修复：实验体系的配制如下

反应条件：第一步25℃20min，第二步70℃10min，第三步4℃hold。

5、连接反应

体系配制(80μl体系)：

每个不同的样本加入不同的adapter各0.5μl，并做好记录。反应条件：第一步25℃10min，第二步72℃5min(无热盖模式)

6、二次纯化：将上述PCR产物转至不同的1.5ml的EP管里，每管加112μl磁珠，室温放置5分钟，转到磁力架放置5分钟，弃上清，加200μl 80％的乙醇，转动2次弃上清，重复加一遍乙醇，弃上清后，室温晾干后加19μl DNase-free Water，取17μl加入PCR管中。

7、PCR扩增，体系配制(50μl体系)如下

8、纯化：将上述PCR产物转至不同的1.5ml的EP管里，每管加112μl磁珠，室温放置5分钟，转到磁力架放置5分钟，弃上清，加200μl 80％的乙醇，转动2次弃上清，重复加一遍乙醇，弃上清后，室温晾干后加19μl DNase-free Water，取17μl加入PCR管中。

9、文库定量：采用TaqMan qPCR方法定量(Ion library TaqMan QuantitationKit Life Technologies,Cat.No.4468802)。

稀释标准品，梯度稀释标准品至6.8PM，0.68PM，0.068PM

体系配制20μl体系

荧光定量反应程序：第一步50℃2min hold，第二步95℃2min(hold)，第三步循环40个(95℃15sec,60℃1min)。

实施例2

模板制备(Ion PGM^TMHi-Q^TMView OT2 Kit,Thermo Fisher,Cat.No.A29900)

1)打开IonOne Touch2背面的电源开关:运行一次Clean程序(持续15min)，按触模屏上Open LID，特离心机打开后，在2个Ion One TouchTM Breaking Solution，然后和1个Ion One TouchTM Recovery Router放入离心机中，之后盖上离心机盖。

2)移除用过的cleaning adapter，装入板子(孔对准仪器左边插孔)，推动扳手盖上热盖。将软管从扳手下穿过，固定于夹管阀卡扣。

3)插入一次性注射器，确保注射器枕头下压时可接触到Router，松开后又可弹回。4)每次开始：使用新的Ion PGMTM Hi-Q OT2 Kit，丢弃掉前一个试剂盒使用的IonOneTouchTM Sipper和Ion OneTouchTM Tubes，戴上新的乳胶手套，装上新的IonOneTouchTM Sipper，将Ion OneTouchTM Oil瓶上下颠倒3次，倒入任意一个新的IonOneTouchTM Tube中，约1/2满，按照仪器标示进行安装；Ion One TouchTM RecoveryRouter上下颠倒3次，倒入另一个新的Ion OneTouchTM Tube中，约1/3满，按照仪器标示进行安装；使用同一个Ion PGMTM Hi-Q OT2 Kit的后续使用准备时，将Ion OneTouchTM Oil瓶上下颠倒3次，取下有Ion OneTouchTM Oil的Ion OneTouchTM Tube，加入IonOneTouchTM Oil，约1/2满，按照仪器标示进行安装，将Ion One TouchTM BreakingSolution上下颠倒3次，倒入另一个的含有Ion One TouchTM Recovery Router的IonOneTouchTM Tube中，约1/3满，按照仪器标示进行安装，清空废液缸。

5)按如下方式准备试剂

6)按下表稀释文库。使用48h内稀释的文库。

多个样本一一稀释至50pM/1000pM的文库各取5μl，混匀离心，按下表进行操作。

涡旋混匀稀释的文库5s，瞬时离心2s，置于冰上。

7)准备Ion PGM^TMHI-Q^TMIon Sphere Particles：高速涡旋ISPs 1min，瞬时离心2s，上下吹吸混匀，立即进行下步操作。

8)室温下，向含有800μl Ion PGM^TMHI-Q^TM Reagent Mix(紫盖子)离心管中按照下表顺序加入试剂。

9)高速涡旋混匀，瞬时离心2s。高速涡旋5s，瞬时离心2s，上下吹吸混匀。配制好后，务必于15min内进行扩增反应。

10)将Ion PGM Onetouch M Plus Reaction Filter置于15mL离心管上，再将上述反应液从sample port注入。

11)再从sample port注入850μl Ion OneTouch^TM Reaction Oil，更换新的枪头，再注入850μl Ion OneTouch^TM Reaction Oil。

12)将加样孔置于左侧，顺时针缓缓倒转reaction filter，避免管内导管接触应液相。

13)将reaction filter插入Ion OneTouch^TM相应位置，边缘凸起位置朝向自己。

15)确保Ion OnetTouch^TM2离心机盖子处于关闭状态。在主界面上点击“Run”。

16)根据文库长度从下拉菜单选择“PGM：Ion PGM ^TMHi-Q^TMOT2Kit-200，或者PGM:Ion PGM^TM Hi-Q^TMOT2Kit-400。

17)选择“Next”，切记要在每个Recovery Tube加入150μl Ion OneTouch^TMbreaking Solution。

18)选择“Expert”，确定每个Recovery Tube已加入μl Ion OneTouch^TM breakingSolution，在提示界面行。点击“Yes”，再点击“Next”开始运行。

19)模板制备程序运行结束后，取出Recovery Tubes，运行结束后，立即取出：在显示屏上点击“Open lid”，取出并丢弃RecoveryRouter，取出Recovery Tubes，置于管架上。运行结束后，未能立即取出：在显示屏上点击两次“Next”进入Finial Spin程序，离心结束后立即点击“Open lid”，待盖子打开后，取出并丢弃RecoveryRouter，取出RecoveryTubes，置于管架上。

20)小心吸弃上清，每管剩余100μl反应液。每管加入500μl Ion OneTouch^TM WashSolution，吹吸混匀沉淀，全部转移至标记好的1.5mL离心管中，15500g离心3min。

21)吸弃上清，剩余100μl于管中。上下吹吸混匀ISPs 10次，避免产生气泡。方头放在面朝自己的左面，从左到有依次编号为1到8。

22)配制1.5ml 1M NaOH(一周内使用)，500μl 100mM NaOH备用(现配现用)。

23)按下表配制Melt-off试剂：

24)涡旋震荡Dynabeads MyOne^TMStreptavidin CIbeads 30s。

25)吹打混匀，吸取13μl至一新的1.5ml离心管中。

26)置于磁力架上2min，移除上清。

27)加入130μl MyOne^TMBeads Wash Solution。

28)从磁力架上取下，涡旋混匀30s，瞬时离心2s。

29)在一个0.2ml PCR管中加入10μl Neutralization Solution。

30)按下表内容填充8-well strip反应孔(ISP样本加入前，吹吸混匀10次；MyOne^TMBeads吹吸混匀3次)：

37.将8-well strip放入ES槽中，确保方头在左边，然后将其推至最右边。

38.在Tip Arm上装上一个新枪头。

39.将装有Neutralization Solution的0.2ml PCR管开盖放入Tip Arm下方的洞中。

40.在开始运行前吹吸well 2中的beads，不可产生气泡。

41.开机后等机器初始化完成，仪器显示“rdy”。在此过程中，Tip Arm会运行一系列的初始化动作，然后回位。

42.按下“Start/stop”。显示屏上显示“run”。整个过程持续约35min。

43.运行结束后，显示屏显示“End”

44.立即盖紧管盖，取下富集的ISPs，上下颠倒混匀5次或垫手指涡旋振数秒。提示：如果该步骤运行正常的话，管中液体体积应＞200μl。

45.丢弃用过的8-well strip，保留枪头，直接进行测序或可于4℃保存3天。

Maintain

1.取下并丢弃用过的Ion PGM^TMPlusReaction Filter。

2.保持Ion OneTouch^TM2 Amplification Plate不动。

3.放一个50mL离心管于仪器右边。

4.将Cleaning Adapter凸出部分面向自己插入相应位置。

5.将注射针拔出，放入上述空的50mL离心管中。

6.按下“Clean”，按提示完成每一步，然后点击“Next”，开始清洗程序。

7.确保最后屏幕上以粗体字显示“Remove plate.in Jector.conlcaltube.Andwaste”提示：保留用过的Cleaning Adapter、Ton Onetokcn2 AmplificationPlate、50mL离心管不动。

8.用无尘纸擦拭离心机盖内侧，然后盖上离心机。

9.点击“Next”返回仪器主界面。

实施例3

上机测序，采用的试剂盒为Ion PGM^TMHi-Q^TMView Sequencing Kit,ThermoFisher,Cat.No.A30044。

准备工作

1、新的Wash2 Bottles处理：

1)Wash2瓶子转入2L新鲜18MΩ超纯水至刻度处；

2)加入Wash2 Bottle Conditioning Solution，上下颠倒混匀5次；

3)置于室温处理至少8h。

2.用专用纯水桶，接取新鲜18MΩ超纯水。

3.清洗

1)清洗3个测序瓶(Wash1、Wash2及Wash3)各3遍。

2)清洗3个水洗瓶(Wash1、Wash2及Wash3)各3遍。

3)清洗3个氯洗瓶(Wash1、Wash2及Wash3)各3遍。

4)清洗1L血清瓶3遍。

3.存水

1)测序瓶Wash2接满2L新鲜18MΩ超纯水至瓶身标记处。

2)水洗瓶Wash1接250m1新鲜18MΩ超纯水。

3)血清瓶接1L新鲜18MΩ超纯水。

4)专用纯水桶接满新鲜18MΩ超纯水。

仪器每次初始化时需要用18MΩ水水洗或氯片氯洗。

水洗

1.点击“Clean”，选择“18-MΩwater cleaning”；

2.清洗仪器上W1位的吸管，然后将装有250m1纯水的瓶子装入W1处；

3.按照仪器提示，将2L空的干净瓶子装入W2位置，空的250ml瓶子装入W3处，在装载dNTP的吸管下面放置2个度液缸。点击“Next”返回主界面。

4.当清洗结束后，移除W1、W2、W3处的所有瓶子及吸管。点击“Next”返回主界面。

氯洗

1.于盛有L新鲜超纯水的血清瓶中放入一片PGM^TMcleaning Tablet，至药片完全溶解。

2.加入1mL 1M NaOH，上下颠倒混匀10次。用0.22μM-0.45μM过滤器过滤250mL于氯洗瓶W1中。2-3h内使用

3.点击“Clean”，选择“Chlorite cleaning”

4.清洗W1位置处的吸管，将氯洗瓶Wash 1装入W1位置。

5.按照仪器提示，于W2位置放一空的干净2L氯洗瓶，W3位置放一干净空的250mL氯洗瓶。在装载dNTP的吸管下面放置2个度液缸。点击“Next”开始清洗。

6.按系统提示，移除阻位置的氯洗液，換为装有250mL18 MΩ水的水洗瓶Wash1。

7.当清洗结束后，移除W1、W2、W3处的所有子及吸管点击“Next”返回主界面。

初始化注意：初始化完成后应在1h内开始第一次测序，27h内开始最后一次测序。

进行核酸操作时，注意避免交叉污染。在更换吸管及拿取dNTP母液时要注意勤更换手套。Wash1，2，3清洗瓶只能使用4次，每次用完后，在瓶壁打“√”标记，并于瓶身标明使用日期。每次初始化后，更换所有试剂瓶及吸管，取出dNTP冰上解冻。检查氮气压力，若小于500psi，则需要更换。

1.测序瓶Wash1：加入350μl 100mM新鲜配制的NaOH于Wash1瓶中，盖盖。2.测序瓶Wash2：于盛有2L新鲜18MΩ超纯水的测序瓶Wash2中倒入一瓶Ion PGM^TMHi-Q^TM SequencingW2 Solution，加7μl 1M NaOH，盖盖，上下颠倒混匀5次。

3.测序瓶Wash3:加Ion PGM^TMHi-Q^TM Sequencing W3 Solution50mL于Wash3清洗瓶，立即进行后续初始化实验操作。

4.于主界面上，点击“Initialize”。

5.点击主界面的“Next”，从下拉菜单选择“Ion PGMTMHi-QTM Sequencing Kit”6.点击“Next”并确认清洗用芯片置于仪器中，吸管及废液收集槽已准备好。再次点击“Next”。

7.系统首先会检查氮气压カ，如果气压正常，点击“Next”。如果气压过低，点击“Yes再次检查，如果气压依然低，请联系技术支持。

8.在W2位置插入一根新的吸管(灰头长管)。吸管不可接触任何物品。

9.立即装入准备好的Wash 2瓶，旋紧管盖。点击“Next”。

10.在W1、W3位置更换新的吸管(灰头短管)

11.立即装入准备好的Wash1、Wash3瓶，旋紧管盖。点击“Next”开始初始化(大约30min)。

准备dNTP

注意：以下步骤全程需冰上小心操作，防止dNTP交又污染。

1.dNTP解冻后，涡旋混匀，瞬时离心。

2.每个新的管盖及管身标注dGTP，dCTP，dATP，和dTTP。

3.用带滤芯枪头小心吸取20μl各试剂加至相对应管的管底。

4.初始化结束后，移除dNTP处使用过的吸管及废液槽。

5.更换新的手套，于dNTP处插入新的吸管(蓝色)。

6.按照标记对应孔装入50ml离心管，并旋紧。

7.根据屏显提示完成初始化。

8.点击“Next”完成初始化程序并返回主界面。

测序

准备工作：准备模板阳性ISPs；解冻测序引物。

1.涡旋混匀Control Ion Sphere^TM，瞬时离心2s。

2.加5μl至阳性模板ISPs的0.2mL离心管中。

3.吹吸彻底混匀。15500×g离心2min。

4.小心去除部分上清。留15μl于管底。

5.加入12μl测序引物。

6.吹吸混匀，彻底吹散沉淀。

7.运行程序：

测序引物与ISPs结合：

1.退火后，取出ISPs，加入3μl Ion PGM^TM Hi-Q^TMSequencing Polymerase。

2、吹吸混匀，室温孵育5min。

注意：孵育结束后务必与15min内开始测序。

芯片检测

1.取一张新芯片，做好标记。袋子留着以备后面扫描条形码。

2.芯片置于PGM“接地板”处或放于离心机的适配器上。

3.点击“Run”，并按提示完成操作。

4.根据系统提示，摘掉手套，并“触地”，取出旧芯片，装入新芯片。

5.根据提示，扫描芯片袋上的条形码或手动输入条形码

6.点击“Chip Check”检查芯片是否渗漏

7.芯片检测结束后：

a)如果通过，点击“Next”；

b)如果未通过，打开芯片固定架，重新装载芯片，点击“Calibrate”重新进行检测；

c)如果通过，点击“Next”；如果仍然未通过，点击“Main Menu”，换一张芯片重新进行。

8.芯片检测通过后，取出该芯片，放入一张旧芯片。

9、按照屏显指示，彻底清空废液盒。

Loading芯片

1. 45度倾斜芯片，使进样孔处于底下

2.插入枪头，吸弃芯片内所有液体。

3.翻转芯片置于离心机内，芯片的突出部分都向内，平衡的旧芯片同样倒置于另一个adapter上，离心5s，取出芯片，用无尘纸擦干Adapter。

4、将芯片置于离心机适配器上，置于水平桌面。

5、室温孵育结束后，吸取所有液体，1oading芯片。

314Chip v2：10μl；316Chip v2及318Chip v2：30μl

6.松开移液器量程调节锁，缓慢调小量程，保持每秒1μl的速度，直至0.5μl量程处，拔掉移液头。

7.芯片置于离心机上，芯片的突出部分向内，离心1min

8.将芯片连底座一起取下，45度手持，移液器量程调至5μl(或20μl)，垂直插入上样孔，反复级慢吸打混匀芯片中液体3次，避免产生气泡。

9.放回离心机，芯片突出部都向外，离心1min。

10.将芯片连底座一起取下，45度手持，调至5μl(或20μl)，垂直插入上样孔，反复缓慢吸打混匀芯片中液体3次，避免产生气泡。

11.芯片置于离心机上，芯片的突出部都向内，离心1min

12. 45度手持芯片，用Rainin移液器尽量吸掉芯片中的液体，放回离心机上，片突出部向外，离心5-10s，再用移液器把残余液体从芯片中吸掉。

13.在PGM的接地金属板上碰触两下手，取下旧芯片，将上好样的芯片放置到芯片座上，合上模块。

14.选择“Planned Run”，后点击“Browse”选择已设计好的测序文件，然后点击“Next”。

15.待PLAN程序载入成功后，确认所有设置数据：按Next后按OK，进入芯片检测。

16.当芯片检测结束后(大约1min)，显示屏上会显示检测是否通过。如果未通过，点击“Abort”重新装载芯片，然后点击“Calibrate”重新进行检测。如果依然未通过，继续进行测序反应并在测序完成后联系技术支持。

17. 90s之后，系统会自动进入测序程序。在运行过程中切勿碰触任何操作界面或仪器任何部件以防测序质量下降。

18、测序结束后，系统会自动返回主操作见面。接下来可以直接进行另一个测序反应，或运行“清洗/归一化”操作。

实施例4

采用实施例1-3的方法对不同人群进行检测，评估其患病风险。首先构建文库，再制备模板，而后上机测序，进行结果数据分析；同时采用现有技术中公认的成熟的方法：Sanger测序对同一样本进行患病风险评估，结果表明，两种方法所得结果一致。表明本发明的突变基因群包含的1024个突变位点，可以为卵巢癌/乳腺癌发病风险的预测、预防和诊断提供依据。采用本发明的的方法所得结果如下表所示，本发明所得结果与采用现有方法所得结果的对比图如附图1-5所示。

上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一组评估女性恶性肿瘤风险的突变基因群，其特征在于，包括ATM、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CHEK2、EPCAM、MLH1、MSH2、MSH6、NBN、NF1、PALB2、PMS2、PTEN、RAD51C、RAD51D、STK11、TP53、BARD1、MRE11A、MUTYH、RAD50、XRCC2和FANCC5共25个基因中的任意一种或几种。

2.如权利要求1所述的突变基因群，其特征在于，所述25个基因总共携带1024个突变位点。

3.如权利要求2所述的突变基因群，其特征在于，所述1024个突变位点如所示：

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4.一种基于高通量测序评估女性恶性肿瘤风险的DNA文库，其特征在于，包括如权利要求1所述的突变基因群中的一种或几种。

5.如权利要求4所述的DNA文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的DNA文库的构建方法，其特征在于，还包括将所述DNA文库依次进行末端修复、3’末端添加碱基A、连接测序接头以及纯化回收连接产物的步骤。

7.如权利要求4所述的DNA文库在制备诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒用于检测女性恶性肿瘤的突变基因。

8.一种评估女性恶性肿瘤风险的试剂盒，其特征在于，包括扩增权利要求1所述的突变基因群中突变位点的引物。