CN104450948A - 癌症检测方法、试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请针对癌症中的突变高发基因，提供了用于癌症样品的多基因、多位点突变检测的试剂盒，其包含分别用于扩增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中任意两个、三个或全部的一个或多个外显子的区域的引物对，例如SEQ ID NO:1-22所示的11对引物。该试剂盒可用于癌症诊断或辅助诊断、癌症预后监测或指导癌症治疗用药等目的。本申请还提供了相应的检测方法。

Description

癌症检测方法、试剂盒及其应用
发明领域
本申请大体上涉及癌症中的突变高发基因的检测。具体而言，本申请提供了基于多重PCR和高通量测序技术的用于癌症样品的多基因、多位点突变检测的试剂盒和检测方法。所提供的检测结果例如可用于癌症诊断或辅助诊断、癌症预后监测或指导癌症治疗用药等目的。
发明背景
癌症是全球最主要的非传染性疾病之一，也是目前致死率最高的慢性疾病。我国每年因癌症死亡的人数高达270万，其中以肺癌、结直肠癌、胃癌等消化道恶性肿瘤最为严重。女性中以乳腺癌为首的妇科恶性肿瘤也是癌症死亡的主要原因。据统计，我国肺癌的发病率为53.57/10万，死亡率高达45.57/10万，两个比例均处于所有恶性肿瘤之首。胃癌次之，发病率为36.21/10万。乳腺癌的发病率处于女性肿瘤之首，为42.55/10万。
抗肿瘤靶向药物是目前治疗癌症较为有效的一种手段，2013年全球销量前十大药物近一半为抗肿瘤靶向药物。抗肿瘤靶向药物和其他化疗药物疗效和毒副作用因人而异，这是因为从本质上讲，癌症是一种多基因突变造成的疾病。关键基因的突变、截短、错位或融合等导致肿瘤发生。由于不受控的增殖，肿瘤细胞会发生更多的基因突变，导致肿瘤恶性化程度加深、转移和抵抗治疗。识别个体肿瘤特异性的驱动基因突变因此成为有效的选择靶向药物应用的关键。目前NCCN(美国国立综合癌症网络)已对多种靶向药物的使用作出规定，建议其在用于肿瘤治疗前进行基因突变检测以确定是否适合用药，例如吉非替尼(gefitinib)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)等。
随着科技发展，抗肿瘤药物的发展也表现出药物使用从单一到联合的趋势。以前靶向药物以单药加化疗为主，但大多数肿瘤是多基因疾病， 针对单个靶点治疗虽然能延长生存，但很少能根治，故目前多个靶向药物的联合治疗研究越来越多，其中最成功的例子就是BRAF和MEK抑制剂联合治疗黑色素瘤。能同时、快捷地检测多个药物靶点基因的方法就变得尤为重要，结合高通量测序的个体化基因治疗也被认为是肿瘤治疗最终努力的方向。
目前常见的检测基因突变的方法有荧光定量PCR法和Sanger测序法(一代测序)。荧光PCR法具有灵敏度高的特点，且技术已经成熟，应用广泛，但是每对引物只能检测一种突变，且每种突变需要单独建立一个PCR反应体系，导致样品用量较大，且无法同时检测太多样品或位点。在Sanger测序法中，单对引物可检测多个突变，具有成本低等特点，但同样所需样品量大，且对低频突变的检测不够令人满意。
因此，本领域目前仍需要能够实现癌症驱动基因的检测工具。
发明概述
第一方面，本申请提供了用于癌症样品或疑似癌症样品的多基因、多位点突变检测的试剂盒，其包含分别用于扩增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中任意两个、三个或全部的一个或多个外显子的区域的引物对。
在一些实施方案中，试剂盒包含分别用于扩增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中每一个的一个或多个外显子的区域的引物对。
本申请的试剂盒可用于癌症诊断或辅助诊断、癌症预后监测或指导癌症治疗用药等目的。
在一些实施方案中，癌症选自肺癌、结直肠癌、乳腺癌和黑色素瘤。
在一些实施方案中，癌症是肺癌。
在一些实施方案中，BRAF基因的外显子选自外显子11和/或15。
在一些实施方案中，EGFR基因的外显子选自外显子18、19、20、21或其任意组合。
在一些实施方案中，KRAS基因的外显子选自外显子2和/或3。
在一些实施方案中，PIK3CA基因的外显子选自外显子9和/或20。
在一些实施方案中，用于扩增BRAF基因的外显子11的区域的引物 对如SEQ ID NO：1和2所示。
在一些实施方案中，用于扩增BRAF基因的外显子15的区域的引物对如SEQ ID NO：3和4所示。
在一些实施方案中，用于扩增EGFR基因的外显子18的区域的引物对如SEQ ID NO：5和6所示。
在一些实施方案中，用于扩增EGFR基因的外显子19的区域的引物对如SEQ ID NO：7和8所示。
在一些实施方案中，用于扩增EGFR基因的外显子20的区域的引物对如SEQ ID NO：9和10和/或SEQ ID NO：11和12所示。
在一些实施方案中，用于扩增EGFR基因的外显子21的区域的引物对如SEQ ID NO：13和14所示。
在一些实施方案中，用于扩增KRAS基因的外显子3的区域的引物对如SEQ ID NO：15和16所示。
在一些实施方案中，用于扩增KRAS基因的外显子2的区域的引物对如SEQ ID NO：17和18所示。
在一些实施方案中，用于扩增PIK3CA基因的外显子9的区域的引物对如SEQ ID NO：19和20所示。
在一些实施方案中，用于扩增PIK3CA基因的外显子20的区域的引物对如SEQ ID NO：21和22所示。
在一些实施方案中，试剂盒包含如SEQ ID NO：1-22所示的11对引物。
在一些实施方案中，试剂盒包含用于从所述样品提取基因组DNA的试剂。
在一些实施方案中，试剂盒包含利用所述引物进行多重PCR反应的试剂。
在一些实施方案中，试剂盒包含用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于高通量测序技术中的试剂。
在一些实施方案中，试剂盒包含用于对处理后的扩增产物进行高通量测序的试剂。
在一些实施方案中，高通量测序选自Ion Torrent测序、Ion PGM测 序、HiSeq 2000测序以及MiSeq测序。
在一些实施方案中，高通量测序为Ion Torrent测序。
在一些实施方案中，试剂盒包含非癌对照样品、和/或BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中的一个或多个未发生突变的癌症对照样品。
第二方面，本申请提供了本申请提供了用于扩增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中任意两个、三个或全部的一个或多个外显子的区域的引物对在制备用于癌症诊断或辅助诊断、或用于癌症预后监测、或用于指导癌症治疗用药的试剂或试剂盒中的用途。
第三方面，本申请提供了体外检测癌症样品或疑似癌症样品中BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因突变的方法，包括以下步骤：
(1)获得个体的癌症样品或疑似癌症样品的基因组DNA；
(2)利用分别用于扩增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中任意两个、三个或全部的一个或多个外显子的区域的引物对对获得的基因组DNA进行多重PCR；
(3)对扩增产物进行高通量测序，优选Ion Torrent测序；以及
(4)分析测序结果，确定BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中是否发生突变。
附图简要说明 
图1显示了癌症驱动基因突变所在的主要信号通路。
图2为本申请的检测方法的一个实施方案的示意性流程图。
图3显示了样品L1083的按照本申请的检测方案和按照Sanger测序法的检测方案的验证结果。
图4显示了样品L738的按照本申请的检测方案和按照Sanger测序法的检测方案的验证结果。
图5显示了样品L735的按照本申请的检测方案和按照Sanger测序法的检测方案的验证结果。
图6显示了样品152的按照本申请的检测方案和按照Sanger测序法的检测方案的验证结果。
图7和8显示了样品L1649的按照本申请的检测方案和按照Sanger 测序法的检测方案的验证结果。
图9显示了实施例1的方法与商业平台Ion AmpliSeqTM Cancer Panel Primer Pool(Life Technologies公司)的平均测序深度的比较。左侧的柱形图组(从左侧数第1-11个)为从实施例1方法获得的结果，右侧柱形图组(从左侧数第12-22个)为从Ion AmpliSeqTM Cancer Panel Primer Pool获得的结果。
序列简要说明 
SEQ ID NO：1和2分别为扩增BRAF基因的外显子11的上游和下游引物；
SEQ ID NO：3和4分别为扩增BRAF基因的外显子15的上游和下游引物；
SEQ ID NO：5和6分别为扩增EGFR基因的外显子18的上游和下游引物；
SEQ ID NO：7和8分别为扩增EGFR基因的外显子19的上游和下游引物；
SEQ ID NO：9和10分别为扩增EGFR基因的外显子20的第一对上游和下游引物；
SEQ ID NO：11和12分别为扩增EGFR基因的外显子20的第二对上游和下游引物；
SEQ ID NO：13和14分别为扩增EGFR基因的外显子21的上游和下游引物；
SEQ ID NO：15和16分别为扩增KRAS基因的外显子3的上游和下游引物；
SEQ ID NO：17和18分别为扩增KRAS基因的外显子2的上游和下游引物；
SEQ ID NO：19和20分别为扩增PIK3CA基因的外显子9的上游和下游引物；
SEQ ID NO：21和22分别为扩增PIK3CA基因的外显子20的上游和下游引物。
发明的详细描述
除非另外说明，本申请中的各个术语的含义与本领域技术人员通常理解的含义相同。
对于癌症驱动基因突变的研究以及由此衍生的癌症诊断、预后、治疗的方案是目前研究的热点。由于肿瘤细胞的存活和增殖是肿瘤发展的重要因素，因此对于相关细胞信号通路的研究非常重要。
本申请的发明人通过对临床肺癌石蜡样品进行基因突变检测，结果显示，突变主要发生在MAPK信号通路及PI3K信号通路上，主要突变的致癌基因分别为EGFR(42.1％)、PIK3CA(2.6％)、KRAS(5.3％)和BRAF(2.6％)四个基因。
同时，发明人结合自身研究、文献报道与数据库资料发现，这四个驱动基因的突变发生于多种癌症中。例如，KRAS基因在结直肠癌中的突变发生频率将近40％，而BRAF基因和PIK3CA基因在结直肠癌中的也有较高的突变频率；乳腺癌病例中有26％的概率存在PIK3CA基因突变；在黑色素瘤中，BRAF基因突变可高达50％。
另外，通过发明人的研究发现，在一些癌症样品中存在上述四个基因中的两个或更多个同时发生突变的现象。
由此，本申请的发明人将上述四个基因确定为本申请的目标基因。
EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)为表皮生长因子受体，属于受体酪氨酸激酶(RTKs)家族。EGFR中的突变可直接激活细胞下游的多种信号途径，包括与细胞存活相关的PI3K-AKT-mTOR途径，以及与细胞增殖相关的RAS-RAF-MEK-ERK途径。
KRAS基因编码K-Ras蛋白。KRAS突变可导致RAS GTP酶的组成性激活，这种激活状态不受生长因子信号的调控，这一结果导致细胞的持续增殖，并使EGFR TKI类药物效果降低。
BRAF基因编码B-Raf蛋白，其位于K-Ras的下游。
PIK3CA基因编码p110α蛋白，其为组成磷脂酰-3-激酶(PI3K)的催化亚基之一。PI3K可参与激活下游的某些重要的信号蛋白，如AKT等。有研究认为PIK3CA的激活突变可能和癌细胞对EGFR TKI类药物产生 抗性有关。 
上述四个基因在信号通路中的关系例如可参见图1。
随后，本申请的发明人在获得的肿瘤突变的筛选结果基础上，又整理了多个数据库(COSMIC，clinVar，my cancer genome)和Pubmed文献数据库目前所报道的EGFR、BRAF、PIK3CA和KRAS基因的药物作用突变位点，最终确定了115个主要基因突变位点(例如可参见表1)。
在以上工作的基础上，为了开发适用于多基因、多位点突变检测的工具和方法，本申请的发明人结合多重PCR和高通量测序技术进行了研发。
多重PCR和高通量测序技术的联合使用能够高效且等效率地扩增目标基因片段并检测多个样品中多个基因中的多处突变。目前，多重PCR技术在多基因多位点的突变检测方面已有应用，其相比于普通PCR具有高效、可对模板定量或定性等优点，但其体系构建的成功与否取决于多个因素，例如目标序列的同源性和大小、引物动力学、PCR反应条件优化等。例如，目标序列的长度范围太大可能导致扩增效率不均匀，引物浓度配比不当或者引物间形成易形成二聚体均可影响总体扩增效率或者扩增均匀性。因此，在技术上成功地实现多重PCR，以及使产物能够良好地适用于测序技术也是该领域的研究重点之一。
综合以上，本申请的各项发明具有以下一种或多种优势：
第一，检测速度快、通量高；
第二，突变位点覆盖广，灵敏性较高，漏检可能性低；
第三，具有较高的准确性；
第四，配合使用的多重PCR引物对能够扩增出足够量的扩增产物，并且能够保证扩增产物的量的平均分布，从而保证后续高通量测序的实施。
第一方面，本申请提供了用于癌症样品或疑似癌症样品的多基因、多位点突变检测的试剂盒，其包含分别用于扩增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中任意两个、三个或全部的一个或多个外显子的区域的引物对。
在一些实施方案中，试剂盒包含分别用于扩增BRAF、EGFR、KRAS 和PIK3CA基因中每一个的一个或多个外显子的区域的引物对。
应当理解，本申请的试剂盒可用于癌症诊断或辅助诊断、癌症预后监测或指导癌症治疗用药等目的。例如，对于性质未知的样品或疑似癌症的样品而言，检测到上述基因的突变则有助于进行癌症的诊断或提示患癌症的风险度较高。此外，对于癌症样品而言，检测到上述基因的突变有利于判断和预估患者的预后，例如，NCCN(美国国立综合癌症网络)报道，携带BRAF V600E突变的转移性结直肠癌(mCRC)患者的预后要差于BRAF野生型的患者。同样，对于癌症样品而言，检测到上述基因的突变能够指导临床用药方案。例如，为肺癌EGFR靶向药物(例如厄洛替尼、吉非替尼)、BRAF靶向药物(例如维罗非尼、达拉非尼)、EGFR&HER2双靶点药物(例如达沙替尼)和MEK靶点药物的用药选择提供指导和依据。
还应当理解，本申请的多基因、多位点突变检测的意义不仅在于提供提高覆盖度，减少漏检率，还在于对单个个体中双基因/位点或多基因/位点突变的检测，例如，可以为临床用药方案提供更准确的指导。示例性的实施方案可参见实施例3。
在一些实施方案中，癌症选自肺癌、结直肠癌、乳腺癌和黑色素瘤。在一些实施方案中，癌症是肺癌。根据本申请发明人的研究，BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因突变在肺癌中的发生率比较高，本申请提供的多对引物特别适合于肺癌中BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因的外显子的突变的检测。但是，同时应当理解，本申请的工具和方法的适用范围并不局限于肺癌，因为上述四个驱动基因的突变还存在于其他癌症中。示例性的实施方案可参见实施例4。
本申请所用的“癌症样品”是指包含癌细胞的样品，“疑似癌症样品”是指可能包含癌细胞的样品。示例性的样品包括但不限于，癌组织活检、病理切片等。在一些情况下，样品也可以是血液样品。
在一些实施方案中，BRAF基因的外显子选自外显子11和/或15。
在一些实施方案中，EGFR基因的外显子选自外显子18、19、20、21或其任意组合。
在一些实施方案中，KRAS基因的外显子选自外显子2和/或3。
在一些实施方案中，PIK3CA基因的外显子选自外显子9和/或20。
应当理解，所要扩增的目标外显子区域可以是各个外显子的全长部分，也可以是各个外显子中包含了突变位点的片段，所述突变位点例如可以是表1中所示的突变位点。
在一些实施方案中，用于扩增BRAF基因的外显子11的区域的引物对如SEQ ID NO：1和2所示。
在一些实施方案中，用于扩增BRAF基因的外显子15的区域的引物对如SEQ ID NO：3和4所示。
在一些实施方案中，用于扩增EGFR基因的外显子18的区域的引物对如SEQ ID NO：5和6所示。
在一些实施方案中，用于扩增EGFR基因的外显子19的区域的引物对如SEQ ID NO：7和8所示。
在一些实施方案中，用于扩增EGFR基因的外显子20的区域的引物对如SEQ ID NO：9和10和/或SEQ ID NO：11和12所示。
在一些实施方案中，用于扩增EGFR基因的外显子21的区域的引物对如SEQ ID NO：13和14所示。
在一些实施方案中，用于扩增KRAS基因的外显子3的区域的引物对如SEQ ID NO：15和16所示。
在一些实施方案中，用于扩增KRAS基因的外显子2的区域的引物对如SEQ ID NO：17和18所示。
在一些实施方案中，用于扩增PIK3CA基因的外显子9的区域的引物对如SEQ ID NO：19和20所示。
在一些实施方案中，用于扩增PIK3CA基因的外显子20的区域的引物对如SEQ ID NO：21和22所示。
在一些实施方案中，试剂盒包含如SEQ ID NO：1-22所示的11对引物。SEQ ID NO：1-22所示的11对引物所用于扩增的目标外显子以及引物的具体序列如下文的表1和2和序列表所示。
例如，本申请的试剂盒中的多个引物对可用于多重PCR以及随后的高通量测序。本领域技术人员能够理解的是，在多重PCR中，引物对的设计对于扩增产物的质量也有一定的影响，例如，扩增产物的量是否足 够用于高通量测序以及扩增产物的量是否平衡分布等。本申请所提供的SEQ ID NO：1-22所示的11对引物能够良好地满足多重PCR以及随后的高通量测序的要求，这也是本申请的优势之一。
在一些实施方案中，试剂盒包含用于从所述样品提取基因组DNA的试剂。从组织样品中提取基因组DNA是本领域的常规技术，并且目前市场上有很多成熟完善的商品化试剂可供选择。例如，基因组DNA的提取可包括组织包埋、提取DNA、质量控制以及定量等步骤。本申请的实施例也提供了示例性的方法。
在一些实施方案中，试剂盒包含利用所述引物进行多重PCR反应的试剂。多重PCR，又称多重引物PCR或复合PCR，是指在一个PCR反应体系中加入两对或更多对的引物，从而同时扩增多个不同核酸片段的反应，其基本原理与常规的PCR相同。多重PCR是本领域中已知的技术，主要的反应组分包括模板(上文所述的基因组DNA)、引物(SEQ ID NO：1-22)、DNA聚合酶、dNTP、缓冲液等。多重PCR反应所使用的设备以及反应参数也是本领域技术人员所知晓的或能够容易地确定的。本申请的实施例也提供了示例性的多重PCR方法。
在一些实施方案中，试剂盒包含用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于高通量测序技术中的试剂。根据上文所得到的多重PCR产物一般无法直接用于高通量测序，还需要进行处理，例如，末端修复，连接接头和标签、纯化、修复缺口等。对于掌握高通量测序的普通技术人员而言，上述处理步骤和所需要的试剂是容易理解的。本申请的实施例也提供了示例性的处理方法。
在一些实施方案中，试剂盒包含用于对处理后的扩增产物进行高通量测序的试剂。高通量测序通常是在微孔芯片上进行的。目前，商业化的芯片和反应试剂容易购得，例如可购自Life Technologies Inc.。
可使用的高通量测序包括但不限于Ion Torrent测序、Ion PGM测序、HiSeq 2000测序以及MiSeq测序。在一些实施方案中，高通量测序为Ion Torrent测序。
Ion Torrent测序技术也被本领域技术人员称为二代测序技术，其是基于DNA合成过程所产生的化学变化。DNA聚合酶以单链DNA为模板， 按碱基互补原理，合成互补的DNA链。DNA链每延伸一个碱基时，就会释放一个质子，导致局部pH变化。Ion Torrent半导体测序芯片的每个微孔里的微球表面含有约100万个DNA分子拷贝。测序时核苷酸分子连续流过芯片微孔。如果一个核苷酸与某个微孔中的DNA分子互补，则该核苷酸被合成到DNA分子中，并且释放质子，该微孔中溶液的pH发生变化。离子传感器检测到pH变化后，将该化学信息转变为数字电子信息。如果DNA链含有两个相同的碱基，则记录电压信号是双倍的。如果碱基不匹配，则无质子释放，也就没有电压信号的变化。Ion Torrent测序技术属于直接检测DNA的合成，即，边合成边检测，这特别适合于多重PCR中多种不同扩增产物的测序。另外，Ion Torrent测序技术不需要CCD扫描、荧光激发等环节，几秒钟就可检测合成插入的碱基，大大缩短了运行时间，从而提高了检测效率。
本领域技术人员能够理解，高通量测序领域已经开发出了多个适合于对多重PCR产物进行测序的系统和平台，并且各个系统和平台对于扩增产物的处理方式也不尽相同。本领域技术人员可以按照本申请的方法进行多重PCR扩增，然后按照生产商的指导对扩增产物进行处理和测序。
出于对测序进行质量控制的目的，在一些实施方案中，试剂盒包含非癌对照样品、和/或BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中的一个或多个未发生突变的癌症对照样品。
第二方面，本申请提供了本申请提供了用于扩增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中任意两个、三个或全部的一个或多个外显子的区域的引物对在制备用于癌症诊断或辅助诊断、或用于癌症预后监测、或用于指导癌症治疗用药的试剂或试剂盒中的用途。
第三方面，本申请提供了体外检测个体的癌症样品或疑似癌症样品中BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因突变的方法，包括以下步骤：
(1)获得个体的癌症样品或疑似癌症样品的基因组DNA；
(2)利用分别用于扩增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中任意两个、三个或全部的一个或多个外显子的区域的引物对对获得的基因组DNA进行多重PCR；
(3)对扩增产物进行高通量测序，优选Ion Torrent测序；以及
(4)分析测序结果，确定BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中是否发生突变。
关于步骤(1)-(3)，可参照上文第一方面的相关描述。步骤(4)涉及对于测序结果的分析，目前市场上已经提供有商业化测序数据分析软件，例如Torrent Suite Software v4.2的自带插件“variantCaller”。本领域技术人员可根据实际需要来设计分析参数，例如，突变质控参数等。本申请的实施例也提供了示例性的测序结果分析方法。示例性的方法可参见图2的流程图。
在不发生冲突的情况下，第一方面所阐述的实施方案和技术特征也适用于第二和第三方面。
应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。
实施例
提供以下实施例进一步描述本申请，而并非加以任何限制。
实施例1.对肺癌样品的多重PCR+高通量测序技术的突变检测
本申请的发明人选取了136位肺癌患者的肿瘤组织样品。
a)基因组DNA提取
按照标准FFEP(福尔马林固定、石蜡包埋)肿瘤组织基因组DNA提取方法，用E.Z.N.A.FFEP DNA试剂盒(Omega Bio-Tek)，根据生产商提供的使用说明，从FFEP处理的组织中提取基因组DNA。将提取的DNA进行凝胶电泳和OD值测量进行质量控制，并用Qubit 2.0荧光计(Life Technologies)进行定量。
b)扩增产物文库的建立
利用Ion Ampliseq Cancer Panel 2.0(Life Technologies)和SEQ ID NO：1-22所示的11对引物对，根据生产商提供的使用说明，对10ng基因组DNA进行多重PCR，从而扩增出KRAS、BRAF、EGFR和PIK3CA基因的外显子。将得到的扩增产物进行末端修复、接头连接、标签连接(区分不同样品)、纯化、修复缺口和PCR扩增，从而得到所需要的DNA文库。将建好的DNA文库用Agilent 2100(Agilent Technologies)生物分析仪进行定量及质量控制。
c)通过乳液PCR制备模板
将已添加不同标签的样品根据浓度换算出不同的稀释因子进行稀释，并混合在一起，在One Touch系统(Life Technologies)上，根据生产商提供的使用说明，自动运行乳液PCR、乳液打破、富集珠子等过程。将富集好的珠子用Qubit 2.0荧光计进行定量，需要满足10％-30％的浓度。然后，用ES系统(Life Technologies)对珠子上的模板的双链变成单链，然后进一步富集珠子，由此富集好的珠子浓度能够达到50％以上。
d)PGM(Life Technologies)上机测序
将制备好的模板和参照珠子一起，按照PGM设备标准流程、加入测序引物、DNA聚合酶后，加入316”芯片中(Life Technologies)，上PGM 设备进行测序。
e)突变结果分析 
用Torrent Suite Software v4.2的自带插件“variantCaller”执行Variant calling分析。Torrent Suite Software为Ion Torrent PGMTM的开源数据分析软件。分析共包括三个筛查步骤。
第一步筛选：对total coverage、variant coverage、variant frequency、p-value这四项设定切除点，以实现对突变质量的控制。例如，可设定为total coverage＞100，variant coverage＞20，variant frequency＞5和P-value＜0.01，如果得到的数据如果不能满足这些要求，则将被过滤掉。
第二步筛选：筛除homopolymer和terminus的情况。Homopolymer定义为在扩增子中有连续5个或5个以上的相同碱基，而突变主要发生在左边缘或右边缘的第一个碱基。Terminus定义为在扩增子边缘左或右1～3个碱基发生突变。
第三步筛选：通过直观的Integrative Genomics Viewer(IGV)软件进行Strand bias和terminus的筛查，筛除这些突变情况。如果某个基因只在一条链上发生突变则认定它为Strand bias。另一种terminus是碱基突变只发生在短片段的边缘左或右1～3个碱基，而在长片段中没有发生。
通过以上三步筛选所剩下的数据为合格的数据，可用于突变位点的分析，结果总结于表3。如表3所示，在测试的136例癌症样品中，共检测到66处突变。特别值得注意的是，经过对样品测序的原始数据分析，证实所设计的目标序列在每个DNA样品中均得到有效的扩增，从突变结果中也可看出，在所设计的KRAS、BRAF、EGFR和PIK3CA基因的各个外显子中均检测到了突变，从而反映出所提供的检测方案具有较好的特异性和适用性。
实施例2.利用Sanger测序法对实施例1中的阳性样品的结果验证
在突变阳性结果中，随机取四个结果进行Sanger测序验证。样品信息及突变检测结果如下：
Sanger测序技术也称为一代测序技术，是本领域公认的测序金标准。验证结果分析：
a)L1083
如图3所示，左边为按照实施例1的方法获得的检测结果图，右边为Sanger验证的正向和反向信号峰图。从Sanger图可见箭头标记区域有重叠峰，经分析显示存在序列为GGAATTAAGAGAAGC的长达15个碱基的删除，突变频率约为25％，验证成功。
b)L738
如图4所示，左边为按照实施例1的方法获得的检测结果图，右边为Sanger验证的正向和反向信号峰图。从Sanger图可见箭头标记位置有重叠峰，经分析显示该位置存在A-＞T的突变，根据峰面积估计频率在10-20％之间，验证成功。
c)L735
结果如图5所示，左边为按照实施例1的方法获得的检测结果图，右边为Sanger验证的正向和反向信号峰图，从Sanger图可见箭头标记位置有重叠峰，经分析显示该位置存在C-＞T的突变，根据峰面积估计频率在25％左右，验证成功。
d)152
结果如图6所示，左边为按照实施例1的方法获得的检测结果图，右边为Sanger验证的正向和反向信号峰图，从Sanger图可见箭头标记位置有 重叠峰，经分析显示该位置存在T-＞G的突变，根据峰面积估计频率在20％左右，验证成功；
该实施例反映出本申请所提供的检测方案具有很好的准确性。
实施例3.多基因多位点突变检测
本申请的发明人选取了另外一批76个肺癌临床石蜡样品、按照实施例1的方法进行基因突变检测，结果发现有多达5例样品存在多基因或多位点突变，占总样品数的6.6％。部分结果如下：
因此，同时进行多基因、多位点的突变检测，可以对患者的用药作出更加准确的指导。以患者1为例，由于存在KRAS G12C突变，不建议其使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR TKIs)类药物，但可以推荐例用针对BRAF V600E的维罗菲尼或达拉菲尼等Off-label药物。
实施例4.本申请的方法在结直肠癌中的应用。
本申请的发明人将实施例1的方法在结直肠癌样品中进行了测试，其中一位患者的结果如下表所示：
同样地，发明人利用对Sanger测序技术对上述结果进行了验证(如实施例2)。如图7和8所示，左边为按照实施例1的方法获得的检测结果 图，右边为Sanger验证信号峰图。从Sanger图可见箭头标记位置有重叠峰，经分析后表明箭头位置分别存在T-＞C及C-＞A的突变，根据峰面积估计频率均在20％左右，验证成功。
该实施例证实本申请的工具和方法也能良好地适用于其他类型的癌症，例如结直肠癌。
实施例5.与商业产品比较
为了进一步表明本申请的方法和工具的优势，本申请的发明人将已有的商业化系统平台Ion AmpliSeqTM Cancer Panel Primer Pool(Life Technologies公司)和实施例1的方法对癌症样品进行了比较测试，并比较了实施例1的方法与该商业化平台的平均测序深度。
如图9所示，左侧的柱形图组(从左侧数第1-11个)显示了利用SEQ ID NO：1-22所示的11对引物得到的扩增产物的测序深度(平均值和标准差)，右侧柱形图组(从左侧数第12-22个)为利用Ion AmpliSeqTM Cancer Panel Primer Pool获得的扩增产物的测序深度(平均值和标准差)。通过比较可以发现，本申请的扩增产物的测序深度的分布更为平均，并且整体高于Ion AmpliSeqTM Cancer Panel Primer Pool平台，从而反映出利用实施例1的方法对目标区域的扩增具有更高的效率和覆盖度。
此外，在前述每一个实施例中，按照本申请的方法可以得到分布平均的每一个目标扩增产物，并且平均测序深度均不低于200。
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Claims (10)

1.用于癌症样品或疑似癌症样品的多基因、多位点突变检测的试剂盒，其包含分别用于扩增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中任意两个、三个或全部的一个或多个外显子的区域的引物对。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述癌症选自肺癌、结直肠癌、乳腺癌和黑色素瘤，优选地，所述癌症为肺癌。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中BRAF基因的外显子选自外显子11和/或15；EGFR基因的外显子选自外显子18、19、20、21或其任意组合；KRAS基因的外显子选自外显子2和/或3；PIK3CA基因的外显子选自外显子9和/或20。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其中
用于扩增BRAF基因的外显子11的区域的引物对如SEQ ID NO:1和2所示；
用于扩增BRAF基因的外显子15的区域的引物对如SEQ ID NO:3和4所示；
用于扩增EGFR基因的外显子18的区域的引物对如SEQ ID NO:5和6所示；
用于扩增EGFR基因的外显子19的区域的引物对如SEQ ID NO:7和8所示；
用于扩增EGFR基因的外显子20的区域的引物对如SEQ ID NO:9和10和/或SEQ ID NO:11和12所示；
用于扩增EGFR基因的外显子21的区域的引物对如SEQ ID NO:13和14所示；
用于扩增KRAS基因的外显子3的区域的引物对如SEQ ID NO:15和16所示；
用于扩增KRAS基因的外显子2的区域的引物对如SEQ ID NO:17和18所示；
用于扩增PIK3CA基因的外显子9的区域的引物对如SEQ ID NO:19和20所示；或
用于扩增PIK3CA基因的外显子20的区域的引物对如SEQ ID NO:21和22所示。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其包含如SEQ ID NO:1-22所示的11对引物。
6.如权利要求1-5中任一项所述的试剂盒，还包含以下一种或多种试剂：
用于从所述样品提取基因组DNA的试剂；
利用所述引物进行多重PCR反应的试剂；
用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于高通量测序技术中的试剂；以及
用于对处理后的扩增产物进行高通量测序的试剂。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其中所述高通量测序选自Ion Torrent测序、Ion PGM测序、HiSeq 2000测序以及MiSeq测序，优选为Ion Torrent测序。
8.如权利要求1-7中任一项所述的试剂盒，还包含非癌对照样品、和/或BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中的一个或多个未发生突变的癌症对照样品。
9.用于扩增BRAF、EGFR、KRAS和PIK3CA基因中任意两个、三个或全部的一个或多个外显子的区域的引物对在制备用于癌症诊断或辅助诊断、或用于癌症预后监测、或用于指导癌症治疗用药的试剂或试剂盒中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其中BRAF基因的外显子选自外显子11和/或15；EGFR基因的外显子选自外显子18、19、20、21或其任意组合；KRAS基因的外显子选自外显子2和/或3；PIK3CA基因的外显子选自外显子9和/或20，
优选地，
用于扩增BRAF基因的外显子11的区域的引物对如SEQ ID NO:1和2所示；
用于扩增BRAF基因的外显子15的区域的引物对如SEQ ID NO:3和4所示；
用于扩增EGFR基因的外显子18的区域的引物对如SEQ ID NO:5和6所示；
用于扩增EGFR基因的外显子19的区域的引物对如SEQ ID NO:7和8所示；
用于扩增EGFR基因的外显子20的区域的引物对如SEQ ID NO:9和10和/或SEQ ID NO:11和12所示；
用于扩增EGFR基因的外显子21的区域的引物对如SEQ ID NO:13和14所示；
用于扩增KRAS基因的外显子3的区域的引物对如SEQ ID NO:15和16所示；
用于扩增KRAS基因的外显子2的区域的引物对如SEQ ID NO:17和18所示；
用于扩增PIK3CA基因的外显子9的区域的引物对如SEQ ID NO:19和20所示；或
用于扩增PIK3CA基因的外显子20的区域的引物对如SEQ ID NO:21和22所示。
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