CN102094078A - 一种用于检测K-ras基因突变的引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及指导肿瘤治疗的分子检测技术领域，具体的，本发明公开了一种用于检测K-ras基因密码子12/13和61突变情况的引物，及其在鉴定肿瘤患者对易瑞沙、埃罗替尼等药物的敏感性中的应用。本发明先对患者肿瘤组织样本进行DNA抽提，再利用自己设计的引物进行目标片段的扩增，最后通过对目的片段的测序，检测K-ras密码子12/13和61的突变位点，并以此指导对肿瘤患者的治疗。

Description

一种用于检测K-ras基因突变的引物及其应用

技术领域

本发明涉及指导肿瘤治疗的分子检测技术领域，具体是涉及一种用于检测K-ras基因密码子12/13和61突变情况的引物及其应用。 

背景技术

目前，靶向治疗已经成为肿瘤临床治疗的重要手段。表皮生长因子受体(EGFR)是靶向治疗的主要作用靶点。EGFR的靶向药物包括EGFR抗单克隆抗体药爱必妥、帕尼单抗，以及EGFR酪氨酸激酶抑制剂易瑞沙和特罗凯。这些药物能通过抑制肿瘤发生发展中必须的表皮生长因子受体酪氨酸激酶阻断肿瘤细胞的信号传导，从而达到抑制肿瘤细胞的增生、侵袭、转移、血管生成并促进肿瘤细胞的调亡。但是，临床试验表明这些靶向药物仅对部分病人有显著疗效。进一步的研究发现肿瘤组织中K-ras基因发生突变(体细胞突变)的病人对此类靶向药物完全耐药。因此，检测病人K-ras基因是否突变成为决定能否使用EGFR靶向药物的必要前提条件。 

ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种：H-ras、K-ras和N-ras，分别定位在11、12和1号染色体上。作为原癌基因的ras基因被激活后就变成有致癌活性的癌基因，ras基因通过突变而激活。其中，K-ras则对人类癌症影响最大，它好像分子开关：当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则不受上游EGFR的信号影响，导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。这也是具有突变型K-ras基因患者对抗EGFR药物治疗无效的理论基础。 

K-ras突变的最常见的方式就是点突变，多发生在N端第12、13和61密码子，占所有突变率的90％以上，其中又以第12密码子突变最常见，而且多为GGT突变成GTT。K-ras基因的突变导致细胞逃逸凋亡，这种异常在胰肠癌、大肠癌、肺癌等肿瘤组织中发生率较高。据国外文献报道，最高为胰外分泌腺癌，达90％，结肠癌为40％～50％，肺癌和膀胱癌为40％，而胃癌较低在10％以下。因此这几种癌症中K-ras基因野生型患者使用易瑞沙的疗效也比较显著，特别是结肠直肠癌，美国癌症综合网络(NCCN)已把K-ras突变的检测列为《结肠癌临床治疗指南》与《直肠癌临床治疗指南》临床用药必检项目。 

据了解，虽然北京、上海、广州等大城市数十家知名医院都引进了这一基因新技术，但在临床上开展并不广泛，且其检测多集中在K-ras密码子12和13上，对于密码子61的检测，并不多见，技术条件也不成熟。 

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测K-ras密码子12/13突变情况的引物。 

本发明的另一目的是提供一种用于检测K-ras密码子61突变情况的引物。 

本发明的最终目的是通过自己设计的引物扩增目标序列，并用测序方法检测K-ras密码子12/13和61的突变情况，结合两者突变的情况，指导肿瘤患者对易瑞沙、特罗凯等药物的治疗。 

基于上述目的，本发明采用以下技术方案： 

一种用于检测K-ras密码子12/13突变情况的引物，其特征是它包括2对引物，其中引物1由上游引物和下游引物组成，上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，其PCR扩增产物为648bp；引物2由上游引物和下游引物组成，上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，其PCR扩增产物为655bp。 

一种鉴定K-ras密码子12/13突变情况的方法，它是使用上述引物序列鉴定K-ras密码子12/13的突变情况，它包括如下步骤：

(1)提取患者肿瘤组织基因组DNA； 

(2)进行PCR扩增，20μl PCR反应体系如下：待测肿瘤组织基因组DNA 50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg2+)2μl，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为：95℃变性2min，随后95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，进行45个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存； 

(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析； 

(4)PCR扩增产物测序。 

一种用于检测K-ras密码子61突变情况的引物，其特征是它包括2对引物，其中引物1由上游引物和下游引物组成，上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，其PCR扩增产物为426bp；引物2由上游引物和下游引物组成，上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，其PCR扩增产物为559bp。 

一种鉴定K-ras密码子61突变情况的方法，它是使用上述引物序列鉴定K-ras密码子61的突变情况，它包括如下步骤：

(1)提取患者肿瘤组织基因组DNA； 

(2)进行PCR扩增，20μl PCR反应体系如下：待测肿瘤组织基因组DNA 50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2μl，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为：95℃变性2min，随后95℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸1min，进行45个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存； 

(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析； 

(4)PCR扩增产物测序。 

有益效果：本发明相对于现有技术，有以下优点： 

本发明将与易瑞沙、特罗凯疗效相关性较高的两个K-ras突变位点组合检测，其结果比单突变检测有更高参考意义，在国内的研究报道中，属罕见。 

本发明中的突变区域扩增物均为本研究组自行设计，具有很好的特异性。 

附图说明

图1是K-ras密码子12/13和61突变区域的PCR扩增产物的电泳图，M为核酸分子量标准marker条带，其分子量自上而下依次为2000，1000，750，500，250，100bp；1，2为K-ras密码子61的扩增条带；3，4为K-ras密码子12/13的扩增条带； 

图2是K-ras密码子12/13突变区域的PCR扩增产物的直接测序图； 

图3是K-ras密码子61突变区域的PCR扩增产物的直接测序图。 

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

实施例1一种鉴定K-ras密码子12/13突变情况的方法 

1.提取肿瘤患者组织基因组DNA； 

2.进行PCR扩增，20μl PCR反应体系如下：待测肿瘤组织基因组DNA 50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2μl，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为：95℃变性2min，随后95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，进行45个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存； 

3.PCR扩增产物的凝胶电泳分析： 

a.用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净。放在水平桌面上，并架好梳子。可配制1.5％浓度的琼脂糖用于电泳。 

b.将50ml 1×TAE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取0.75g的琼脂糖粉放入后微波炉内加热溶解。冷却至60℃左右，加入5μl  ，混匀，倒入电泳槽中，避免气泡，待凝固。 

c.向电泳槽中倒入1×TAE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子。如样品孔内有气泡，应设法除去。 

d.在3-5μl PCR产物中加入12μl的加样缓冲液，混匀后，加入样品孔内。并设一孔核酸分子量标准marker(6μl)。 

e.接通电源，红色为正极黑色为负极，DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负)，电压为120V。根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。一般200～400bp的PCR产物电泳20min即可。 

f.紫外仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小。拍照，电脑存档。 

结果如图1所示，条带3代表K-ras密码子12/13引物1的PCR扩增产物，产物为648bp；条带4代表K-ras密码子12/13引物2的PCR扩增产物，产物为655bp。 

4.PCR扩增产物测序：确认电泳跑出目标条带后进行测序。 

a.在每个孔中加入2μl PCR产物，1μl混和酶(0.5U虾碱酶和5U外切酶)，PCR仪上，85℃灭活15min。 

b.在上述孔中加入1μl BDT溶液，2μl引物(1pmol/μl)(正向和反向引物分别装于两个孔中)，每加完一次样都在96孔板于离心机中离心，当离心速度达到1500转/min时即停，最后当所有试剂全部加完离心后盖上热垫盖。 

c.在PCR仪上进行扩增。反应条件为：95℃预变性4min，随后95℃变性30sec，50℃退火15sec，进行35个循环，最后60℃延伸4min，4℃保存； 

d.反应结束后，将96孔板放入离心机离心，当转速达2000转/min即停止离心。 

e.打开热垫盖，在各孔内分别加入2.μl 125mM EDTA，在离心机中离心，至转速达2000转/min停止离心，再加17μl无水乙醇(AR)，盖上盖子，在漩涡混悬器上振荡后放入于低温离心机中离心，在转速3500转/min下离心30分钟。 

f.打开热垫盖盖，在板口放置足够的吸水纸，在离心机中倒置离心，当转速达1300转 /min停止离心。 

g.分别向上步得到沉淀中加入50μl 70％乙醇，封上塑料封口膜，在冷冻离心机中离心(3500转/min)6分钟。 

h.揭开塑料封口膜，在板口放置足够的吸水纸，在冷冻离心机中倒置离心，当转速达到1300转/min时停止离心。 

i.将洗涤好的沉淀在抽屉中避光，室温下放置15-30分钟左右，让残留乙醇全部挥发。 

j.每孔加入10ul Hi-Di，在PCR仪上进行变性反应，条件为：95℃4min→4℃forever。 

k.3730xl测序仪进行测序。 

应用DNAstar程序，将样本测序所得序列与同一区域的野生型序列比较，确定K-ras密码子12/13的突变情况及突变位点，野生型密码子12和13序列分别为GGT和GGC，突变型密码子12序列为(G→(A，T，C))(G→A)T，突变型密码子13序列为G(G→(A，T，C))C。本次样本测序结果为野生型，见图2。 

实施例2一种鉴定K-ras密码子61突变情况的方法 

1.提取肿瘤患者组织基因组DNA； 

2.进行PCR扩增，20μl PCR反应体系如下：待测肿瘤组织基因组DNA 50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2μl，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为：95℃变性2min，随后95℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸1min，进行45个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存； 

3.PCR扩增产物的凝胶电泳分析：具体步骤同实施例1。 

结果如图1所示，条带1代表K-ras密码子61引物1的PCR产物，产物为426bp；条带2代表K-ras密码子61引物2的PCR产物，产物为559bp。 

4.PCR扩增产物测序：具体步骤同实施例1。 

应用DNAstar程序，将样本测序所得序列与同一区域的野生型序列比较，确定K-ras密码子61的突变情况及突变位点。野生型序列为GGTCAAGAGGAGT，突变型序列为GGTC(A→T)AGAGGAGT。本次样本测序结果为野生型，见图3。 

序列表 

<110>上海宝藤生物医药科技有限公司 

<120>一种用于检测K-ras基因突变的引物及其应用 

<130>20091102 

<160>8 

<170>PatentIn version 3.5 

<210>1 

<211>18 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>1 

tttgagagcc tttagccg                                                     18 

<210>2 

<211>18 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>2 

gaccctgaca tactccca                                                     18 

<210>3 

<211>19 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>3 

agagccttta gccgccgca                                                  19 

<210>4 

<211>25 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>4 

tgaacatcat ggaccctgac atact                                           25 

<210>5 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>5 

tgcatggcat tagcaaagac                                                 20 

<210>6 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>6 

ggtgcttagt ggccatttgt                                                20 

<210>7 

<211>17 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>7 

gccatttgtc cgtcatc                                                   17 

<210>8 

<211>18 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>8 

taggtttcaa tcccagca                                                  18 

Claims (9)

1.一种用于检测K-ras基因突变的引物序列，其特征在于所述引物序列包括扩增K-ras密码子12/13的两对引物和扩增K-ras密码子61的两对引物，其中K-ras密码子12/13引物1的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；K-ras密码子12/13引物2的上游引物序列如SEQ ID No.3所示，下游引物序列如SEQ ID No.4所示；K-ras密码子61引物1的上游引物序列如SEQ ID No.5所示，下游引物序列如SEQ ID No.6所示；K-ras密码子61引物2的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所示。

2.如权利要求1所述的引物序列在检测K-ras密码子突变中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：以待测肿瘤组织基因组DNA为模板，针对K-ras密码子12/13和K-ras密码子61进行PCR扩增，再对扩增产物进行测序，从测序图上搜索K-ras密码子12/13和K-ras密码子61的特定突变位点，并判定其是否发生突变。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于检测方法如下：

(1)提取患者肿瘤组织基因组DNA；

(2)以待测肿瘤组织基因组DNA为模板，用K-ras密码子12/13和K-ras密码子61的扩增引物进行PCR扩增；

(3)PCR扩增产物凝胶电泳分析；

(4)PCR扩增产物测序。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于步骤(1)中所述肿瘤主要包括：胰腺癌、大肠癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌、胃癌等。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(2)中PCR反应体系每20μl组成如下：待测肿瘤组织基因组DNA 50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)2μl，余下为无菌蒸馏水。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(2)中用于检测K-ras密码子12/13的PCR扩增反应条件是：95℃变性2min，随后95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，进行45个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。

8.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(2)中用于检测K-ras密码子61的PCR扩增反应条件是：95℃变性2min，随后95℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸1min，进行45个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。

9.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(4)中测序PCR扩增的反应条件为：95℃预变4min，随后95℃变性30sec，50℃退火15sec，进行35个循环，最后60℃延伸4min，4℃保存。

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