CN102061333A - 一种用于检测c-kit基因突变的引物及其应用 - Google Patents
一种用于检测c-kit基因突变的引物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及指导肿瘤治疗的分子检测技术领域，具体的，本发明公开了一种用于检测c-kit基因外显子9和11突变情况的引物，及其在鉴定肿瘤患者对伊马替尼(格列卫)类药物的敏感性中的应用。本发明先对患者肿瘤组织或血液样本进行DNA抽提，再利用自己设计的引物进行目标片段的扩增，最后通过对目的片段的测序，检测kit外显子9和11的突变位点，并以此指导对肿瘤患者的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及指导肿瘤治疗的分子检测技术领域，具体是涉及一种用于检测c-kit基因外显子9和11突变情况的引物及其应用。
背景技术
c-kit基因编码的kit蛋白是一种跨膜受体蛋白，属受体酪氨酸激酶家族成员，由胞内的酪氨酸激酶区，跨膜区和带有配体结合位点胞外区构成，在许多恶性肿瘤中有表达，尤其是在胃肠道间质瘤(GIST)的89％-100％中呈阳性表达。1998年报道GIST中存在c-kit的基因突变，使其在无配体结合的情况下，kit蛋白仍然能保持持续的自身酪氨酸蛋白激酶活性，从而激活下游的信号转导通路，kit的这种获得功能性的突变是GIST发生的重要机制。
伊马替尼(格列卫)是一种口服给药的2-苯胺嘧啶衍生物，选择性抑制与kit蛋白、ABL蛋白和血小板源性生长因子(PDGF)受体相关的酪氨酸激酶，用它来治疗转移性GIST患者后发现60％以上的病人可以缓解，其效果好于化疗，因此许多学者研究GIST患者中c-kit基因突变与伊马替尼疗效的相关性。发现c-kit突变的患者用伊马替尼治疗的有效性高于无突变者，且突变的位置可影响GIST对伊马替尼的反应。一些国外的临床研究表明kit基因编码近跨膜结构域的11号外显子中的突变最为常见，占50％～92％，其次为胞外结构域的9号外显子，占8～13％，并且11号外显子有突变者与没有突变者和9号外显子突变者相比，对伊马替尼的部分缓解率明显提高，平均生存期延长，病情进展缓慢。还有发现一例kit外显子11突变的胸腺癌患者用伊马替尼进行了6个月的治疗后，相比治疗前，治疗后肿瘤细胞的增殖减少，肿瘤细胞的凋亡更多。说明kit基因检测对判断伊马替尼应用的预后有重要意义。
目前国际上对于kit外显子9和11的研究报道较多。2006年ASCO会议上报道了一项晚期GIST患者中，kit外显子11突变型，kit外显子9突变型和野生型患者用伊马替尼治疗后缓解率的比较研究(Blanke CD，et al.Proc Am Soc Clin Oncol 2006；24：526s.Abs 9528)。最近也有学者研究分析了不同GIST基因型(kit外显子9和11的突变情况)与伊马替尼治疗结果之间的相关性。
国内也有一些相关的报道，多集中在11号外显子突变，且样本量较小，突变率低，为30.8％(14/52)和41.5％(34/82)，引物也多是采用外文文献所报道过的。因此，检测kit外显子9和11的突变情况，结合两者结果指导肿瘤患者对伊马替尼(格列卫)类药物的治疗，其结果比单突变检测有更高参考意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测kit外显子9突变情况的引物。
本发明的另一目的是提供一种用于检测kit外显子11突变情况的引物。
本发明的最终目的是通过自己设计的引物扩增目标序列，并用测序方法检测kit外显子9和11的突变情况，结合两者突变的情况，指导肿瘤患者对伊马替尼(格列卫)类药物的治疗。
基于上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于检测kit外显子9突变情况的引物，其特征是它由上游引物和下游引物组成，上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
一种鉴定kit外显子9突变情况的方法，它使用上述引物序列鉴定kit外显子9的突变情况，它包括如下步骤：
(1)提取患者肿瘤组织或血液基因组DNA；
(2)进行PCR扩增，20μl PCR反应体系如下：待测肿瘤组织或血液基因组DNA 50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg2+)2μl，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为：95℃变性2min，随后95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，进行45个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存；
(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析；
(4)PGR扩增产物测序。
一种用于检测kit外显子11突变情况的引物，其特征是它由上游引物和下游引物组成，上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
一种鉴定kit外显子11突变情况的方法，它使用上述引物序列鉴定kit外显子11的突变情况，它包括如下步骤：
(1)提取患者肿瘤组织或血液基因组DNA；
(2)进行PCR扩增，20μl PCR反应体系如下：待测肿瘤组织或血液基因组DNA 50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg2+)2μl，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为：95℃变性2min，随后95℃变性30sec，64℃退火30sec，72℃延伸1min，进行45个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存；
(3)PCR扩增产物的凝胶电泳分析；
(4)PCR扩增产物测序。
有益效果：本发明相对于现有技术，有以下优点：
本发明将与伊马替尼(格列卫)疗效相关性较高的两个kit突变位点组合检测，其结果比单突变检测有更高参考意义，在国内的研究报道中，属罕见。
本发明中的突变区域扩增物均为本研究组自行设计，具有很好的特异性，特别是kit外显子11的扩增物具有较高的退火温度，更增加了扩增的特异性。
附图说明
图1是kit外显子9和11突变区域的PCR扩增产物的电泳图，图中M为核酸分子量标准marker条带，1为kit外显子9条带，2为kit外显子11条带；
图2是kit外显子9突变区域的PCR扩增产物的直接测序图；
图3是kit外显子11突变区域(密码子557和558)的PCR扩增产物的直接测序图；
图4是kit外显子11突变区域(密码子568、572和579)的PCR扩增产物的直接测序图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1一种鉴定kit外显子9突变情况的方法
1.提取患者肿瘤组织或血液基因组DNA；
2.进行PCR扩增，20μl PCR反应体系如下：待测肿瘤组织或血液基因组DNA 50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg2+)2μl，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为：95℃变性2min，随后95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，进行45个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存；
3.PCR扩增产物的凝胶电泳分析：
a.用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净。放在水平桌面上，并架好梳子。可配制1.5％浓度的琼脂糖用于电泳。
b.将50ml 1×TAE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取0.75g的琼脂糖粉放入后微波炉内加热溶解。冷却至60℃左右，加入5μl混匀，倒入电泳槽中，避免气泡，待凝固。
c.向电泳槽中倒入1×TAE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子。如样品孔内有气泡，应设法除去。
d.在3-5μl PCR产物中加入12μl的加样缓冲液，混匀后，加入样品孔内。并设一孔核酸分子量标准marker(6μl)。
e.接通电源，红色为正极黑色为负极，DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负)，电压为120V。根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。一般200～400bp的PCR产物电泳20min即可。
f.紫外仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小。拍照，电脑存档。
结果如图1所示，条带1代表kit外显子9，其PCR产物为267bp。
4.PCR扩增产物测序：确认电泳跑出目标条带后进行测序。
a.在每个孔中加入2μl PCR产物，1μl混和酶(0.5U虾碱酶和5U外切酶)，PCR仪上，85℃灭活15min。
b.在上述孔中加入1μl BDT溶液，2μl引物(1pmol/μl)(正向和反向引物分别装于 两个孔中)，每加完一次样都在96孔板于离心机中离心，当离心速度达到1500转/min时即停，最后当所有试剂全部加完离心后盖上热垫盖。
c.在PCR仪上进行扩增。反应条件为：95℃预变性4min，随后95℃变性30sec，50℃退火15sec，进行35个循环，最后60℃延伸4min，4℃保存；
d.反应结束后，将96孔板放入离心机离心，当转速达2000转/min即停止离心。
e.打开热垫盖，在各孔内分别加入2μl 125mM EDTA，在离心机中离心，至转速达2000转/min停止离心，再加17μl无水乙醇(AR)，盖上盖子，在漩涡混悬器上振荡后放入低温离心机中离心，在转速3500转/min下离心30min。
f.打开热垫盖，在板口放置足够的吸水纸，在离心机中倒置离心，当转速达1300转/min停止离心。
g.分别向上步得到沉淀中加入50μl 70％乙醇，封上塑料封口膜，在冷冻离心机中离心(3500转/min)6分钟。
h.揭开塑料封口膜，在板口放置足够的吸水纸，在冷冻离心机中倒置离心，当转速达到1300转/min时停止离心。
i.将洗涤好的沉淀在抽屉中避光，室温下放置15-30分钟左右，让残留乙醇全部挥发。
j.每孔加入10ul Hi-Di，在PCR仪上进行变性反应，条件为：95℃4min，4℃保存。
k.3730xl测序仪进行测序。
应用DNAstar程序，将样本测序所得序列与同一区域的野生型序列比较，确定kit外显子9的突变情况及突变位点。突变型为密码子502(Ala)-503(Tyr)的重复，即插入6bp。
实施例2一种鉴定kit外显子11突变情况的方法
1.提取患者肿瘤组织或血液基因组DNA；
2.进行PCR扩增，20μl PCR反应体系如下：待测肿瘤组织或血液基因组DNA 50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg2+)2μl，余下为无菌蒸馏水；PCR反应条件为：95℃变性2min，随后95℃变性30sec，64℃退火30sec，72℃延伸1min，进行45个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存；
3.PCR扩增产物的凝胶电泳分析，具体步骤同实施例一。
结果如图1所示，条带2代表kit外显子11，其PCR产物为438bp。
4.PCR扩增产物测序，具体步骤同实施例一。
应用DNAstar程序，将样本测序所得序列与同一区域的野生型序列比较，确定kit外显子11的突变情况及突变位点。变异型发生在密码子550-592的区域内，多表现为密码子557和558插入/缺失突变，其次为密码子550-556和密码子559-562的突变，另外偶见密码子568，572和579的突变。
序列表
<110>上海宝藤生物医药科技有限公司
<120>一种用于检测c-kit基因突变的引物及其应用
<130>20091101
<160>4
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
agccagggct tttgttttct 20
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
cagagcctaa acatcccctt a 21
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ccacaccctg ttcactcctt 20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
ggcgcaattt cacagaaaac 20
Claims (10)
1.一种用于检测c-kit基因突变的引物序列，其特征在于所述引物序列包括扩增kit外显子9和kit外显子11的两组引物，其中kit外显子9的上游引物序列如SEQID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；kit外显子11的上游引物序列如SEQ ID No.3所示，下游引物序列如SEQ ID No.4所示。
2.如权利要求1所述的引物序列在检测kit外显子突变中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：以待测肿瘤组织或血液基因组DNA为模板，针对kit外显子9和kit外显子11进行PCR扩增，再对扩增产物进行测序，从测序图上搜索kit外显子9和外显子11的特定突变位点，并判定其是否发生突变。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于检测方法如下：
(1)提取患者肿瘤组织或血液基因组DNA；
(2)以待测肿瘤组织或血液基因组DNA为模板，用kit外显子9和kit外显子11的扩增引物进行PCR扩增；
(3)PCR扩增产物凝胶电泳分析；
(4)PCR扩增产物测序。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于步骤(1)中所述肿瘤主要指胃肠道肿瘤，包括：胃癌、肝癌、食管癌、大肠癌、口腔癌、胆囊癌和胰腺癌等。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述胃肠道肿瘤主要是指胃肠道间质瘤(GIST)。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(2)中PCR反应体系每20μl组成如下：待测肿瘤组织或血液基因组DNA 50～100ng，Taq酶0.125μl，上下游引物(10μM)各1μl，dNTP(2.5mM)2μl，10×PCR缓冲液(含Mg2+)2μl，余下为无菌蒸馏水。
8.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(2)中用于检测kit外显子9的PCR扩增反应条件是：95℃变性2min，随后95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，进行45个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。
9.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(2)中用于检测kit外显子11的PCR扩增反应条件是：95℃变性2min，随后95℃变性30sec，64℃退火30sec，72℃延伸1min，进行45个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。
10.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述步骤(4)中测序PCR扩增的反应条件为：95℃预变性4min，随后95℃变性30sec，50℃退火15sec，进行35个循环，最后60℃延伸4min，4℃保存。
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-
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