CN1687455A - 分离和测定血液游离dna的试剂和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了分离提取血液样品中游离DNA的试剂和方法，以及对血液样品中游离DNA含量进行定量测定的试剂盒和方法。本发明能够迅速、高度灵敏地获得血液样品中游离DNA的定量分析结果。

Description

分离和测定血液游离DNA的试剂和方法

技术领域

本申请涉及医学肿瘤学领域。具体地说，本申请涉及一种用于分离提取血液(血清或血浆)中DNA的试剂，以及分离提取并定量检测血液(血清或血浆)中DNA的方法。

背景技术

二十世纪70年代，欧洲学者首次报道恶性肿瘤病人的血液(血清或血浆)中存在游离(Circulating)DNA，其含量约为健康人的10倍。这类游离DNA均为双链DNA分子，其范围为200bp至21kb，其中大部分以核小体(Nucleosome)的形式存在。分子生物学研究证实，血液中的游离DNA与原发肿瘤的基因组DNA具有相同的遗传变异，如癌基因突变、微卫星失衡和抑癌基因启动子甲基化等，因而认为此类游离DNA主要来自肿瘤，其来源大致有：(1)微转移(Micrometastatsis)癌细胞，此类癌细胞从原发肿瘤脱落进入血循环后发生凋亡或坏死，从而将遗传物质释放到血液中。(2)原发肿瘤中癌细胞凋亡或坏死并将遗传物质释放到血液中。(3)活跃增殖的癌细胞在DNA复制时将一部分新合成的DNA片段排放到细胞外，从而进入血循环。

近十年来，血液游离DNA已成为基因组医学(Genomic Medicine)研究的一个热点领域，首先是作为一种非损伤性的诊断手段，可以随时采集病人样本进行分析，有助于系统研究肿瘤发生发展过程中各种遗传变异的变化轨迹，加深对肿瘤发病机理的认识。西班牙学者Garcia-Olmo等认为，血液游离DNA中的癌基因可能会自发地转染多潜能的干细胞，使后者成为一类肿瘤干细胞，因而血液游离DNA作为基因组转移(Genometastasis)值得高度关注。其次是在临床医学中，这些DNA作为一类新颖的肿瘤标志物有独特的优势，一是其遗传变异具有显著的肿瘤特异性，借此可以鉴别良性与恶性疾患。二是基因检测技术具有高度敏感性，特别是采用实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR)等先进技术后，可以对1ng以下的微量DNA进行定量分析，其检测灵敏度较现有免疫学技术(如放射免疫和酶联免疫吸附等)可以提高1-2个数量级。因而血液游离DNA的检测在临床上具有广泛的应用价值，如：

1.肿瘤诊断：由于肿瘤病人血液游离DNA含量显著高于正常人和良性疾病患者，因而检测血液游离DNA含量及其遗传变异对肿瘤诊断很有应用价值。不少报道认为其敏感性和特异性均优于现有的蛋白类及糖脂类肿瘤标志物。

2.复发预警和预后评估：意大利学者Sozzi等指出，血液游离DNA检测可以作为术后肿瘤转移复发的预警信号，因此在术后随访过程中定期检测血液游离DNA含量，有助于早期发现肿瘤复发。此外，不少学者报道，血液游离DNA含量较高者预后较差、生存期短。

3.疗效预测：血液中游离DNA以核小体的形式存在，这类核酸蛋白复合物的含量与化疗疗效呈反比关系。因而检测其含量可以作为疗效的一项预测指标，借此可以对病人进行个体化治疗。

目前血液游离DNA研究中的二个主要技术障碍是DNA抽提与定量检测。血液中的游离DNA主要以核小体的形式存在，其基本结构是以4个珠蛋白为核心、其表面由DNA双螺旋链绕珠蛋白1.75圈(约200bp)而成。经典的DNA抽提方法是用蛋白酶-K水解珠蛋白，然后用异硫氰胍使DNA变性并溶解在水相中，后者通过柱层析方法使DNA吸附在羟基磷灰石基质表面，通过洗涤去除蛋白成份后再将吸附的DNA洗脱下来。此方法的缺点是水解时间长(需要1-2小时)、DNA的洗脱效率低(不超过50％)、成本高(约10元/样本)。此外，由于血液中游离DNA的含量很低，通常需要用1-2ml血清或血浆才能获得足够的DNA进行检测。

DNA定量普遍采用紫外分光光度法(测定260nm波长下的光吸收)，但这种方法在DNA浓度很低(＜1μg/ml)时误差太大，而血液游离DNA在抽提后普遍低于此限度，因而不适宜用于血液游离DNA的定量分析。国外学者曾采用放射免疫法对血液游离DNA进行测定，如瑞士学者Leon等应用此技术测得健康人血清DNA含量平均为13ng/ml，而肿瘤病人高达180ng/ml。

因此，本领域中仍然需要有一种廉价、简便、快速的血液游离DNA分离方法。

发明内容

为实现上述目的，本发明第一方面提供了一种用于分离提取血液样品中游离DNA的试剂，所述试剂基本上由乙酸/乙酸钾缓冲液、十二烷基硫酸钠和水组成，其中十二烷基硫酸钠的浓度为60-120毫克/毫升，所述试剂的pH为3-5。在一个较佳的实施方案中，每100毫升所述试剂由60毫升的5M乙酸钾、11.5毫升冰乙酸、100毫克十二烷基硫酸钠以及余量水组成。

本发明另一方面提供了一种分离提取血液样品中游离DNA的方法，该方法包括：在93-97℃下用上述试剂处理所述血液样品，离心取出上清，在上清内加入异丙醇和乙醇，得到血液中游离DNA的沉淀。在一个较佳的实施方案中，所述血液样品是血清或血浆。较佳的，所述方法还包括将得到的DNA沉淀溶解于水中。

本发明另一方面涉及一种对血液样品中游离DNA含量进行定量测定的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含特异性上游引物、下游引物、DNA标准品以及Taqman探针，其中所述DNA标准品具有人上皮生长因子受体cDNA序列X00588的2358至3729位核苷酸序列，所述特异性上游引物和下游引物在人上皮生长因子受体基因AY588246的188248至188315位核苷酸区间内进行选择，所述Taqman探针具有SEQID NO：5所示的序列，且其5′端与荧光报告基团相连，3′端与荧光淬灭基团相连。在一个较佳的方案中，所述上游引物具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，所述下游引物具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

本发明另一方面涉及一种对血液样品中游离DNA含量进行定量测定的方法，其特征在于，该方法包括：a)用上述试剂盒，以实时定量PCR法测定正常组织中DNA含量与基因拷贝数之间的函数关系；b)从所述血液样品中分离提取DNA；c)用上述试剂盒，以实时定量PCR法测定步骤b)所得DNA中的基因拷贝数，并根据步骤a)的函数关系将所测定的基因拷贝数换算成DNA含量。在一个较佳的方案中，所述血液样品是血清或血浆。在另一较佳方案中，所述步骤b)的从所述血液样品中分离提取DNA是在93-97℃下用前述用于分离提取血液样品中游离DNA的试剂处理所述血液样品，离心取出上清，在上清内加入异丙醇和乙醇，得到血液中游离DNA的沉淀。

利用本发明，可以从300-500μl血清或血浆中分离提取DNA，此方法的主要优点是DNA分离时间短(仅需要1个小时)、DNA得率高(理论上讲＞90％)、成本低(约1元/样本)。所得的DNA通过高灵敏的实时定量PCR技术检测，能够在2小时内获得定量分析数据。

申请人用本发明方法分析了20例健康人和63例肿瘤病人的血液样本，发现健康人血浆DNA含量平均为0.995ng/ml，肿瘤病人为24.81ng/ml；健康人血清DNA含量平均为18.81ng/ml，肿瘤病人为117.55ng/ml。若将血浆游离DNA含量的阳性临界值设定为3ng/ml，则健康人均为检测阴性，而肿瘤病人的阳性率达到95.2％。此外，血液游离DNA含量检测对肺癌的阳性检出率明显高于5项临床常用的肿瘤标志物(CA19-9，CA-125，Cyfra21-1，CEA和NSE)，尤其在5项标志物均为检测阴性的样本中，91.7％的样本DNA含量高于阳性值。最后，本申请提供的资料还显示，血浆DNA含量与化疗疗效之间存在明显的关系，在肺鳞癌中DNA含量低于平均值(24.81ng/ml)者化疗有效率明显增高，而在小细胞肺癌中则相反。上述资料提示本发明在肿瘤诊断及疗效评估等方面具有广泛的临床应用价值。

附图简述

图1显示了定量PCR标准品的制备，其中1表示纯化前的PCR产物；2表示纯化后的PCR产物；3，4表示经筛选获得的2个阳性表达质粒电泳结果。

图2显示了实时定量PCR检测的标准曲线(RG3000型定量PCR仪结果)。

图3显示了DNA含量与定量PCR检测结果的相关性。

具体实施方式

本发明一方面涉及一种用于分离提取血液样品中游离DNA的试剂，所述试剂基本上由乙酸/乙酸钾缓冲液、十二烷基硫酸钠和水组成，其中十二烷基硫酸钠的浓度为60-120毫克/毫升，所述试剂的pH为3-5。

术语“基本上由……组成”指该试剂可以含有任何其它组分，这些组分可以具有任何的含量，只要这些组分及含量的存在对于本发明试剂在分离提取血液样品中游离DNA上的效果没有实质性影响即可。

申请人曾作了以下尝试：1)在相同pH(pH为3-5)条件下，用甘氨酸缓冲液和柠檬酸缓冲液代替乙酸缓冲液；2)在乙酸缓冲液中用乙酸钠来替换乙酸钾；3)用其它去垢剂如NP-40或Triton X-100替换十二烷基硫酸钠，但是上述尝试均没有取得满意的效果。因此，本发明的试剂中的组分是非常特定的。在本发明的试剂中，乙酸缓冲液中乙酸钾的最终浓度应达到3M，pH范围为3-5即可。

在一个较佳的实施方案中，每100毫升所述试剂由60毫升的5M乙酸钾、11.5毫升冰乙酸、100毫克十二烷基硫酸钠以及余量水组成。

本发明另一方面还涉及一种分离提取血液样品中游离DNA的方法，其特征在于，该方法包括：在93-97℃下用上述试剂处理所述血液样品，离心取出上清，在上清内加入异丙醇和乙醇，得到血液中游离DNA的沉淀。

加热处理的主要目的有二个，一是促使DNA双螺旋解离，二是引起蛋白变性。因而通过加热后离心，可以很容易使核酸与蛋白分离，其中蛋白位于离心管底部白色沉淀中，而核酸溶解在上部水相(酸性缓冲液)内。通常处理温度超过80℃便可达到上述目的，但将温度设置在93-97℃效果更好。在一个较佳的实施方案中，宜在95℃下用本发明上述试剂处理所述血液样品。在上述实施方案中，所述血液样品可以是血清或血浆。另外，该方法还包括将得到的DNA沉淀溶解于水中，-70℃下保藏。

本发明另一方面提供了一种对血液样品中游离DNA含量进行定量测定的试剂盒，所述试剂盒包含特异性上游引物、下游引物、DNA标准品以及Taqman探针，其中所述DNA标准品具有人上皮生长因子受体cDNA序列X00588的2358至3729位核苷酸序列，所述特异性上游引物和下游引物在人上皮生长因子受体基因AY588246的188248至188315位核苷酸区间内进行选择，所述Taqman探针具有SEQ ID NO：5所示的序列，且其5′端与荧光报告基团相连，3′端与荧光淬灭基团相连。

在一个较佳的实施方案中，所述上游引物具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，所述下游引物具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

本发明另一方面还提供了一种对血液样品中游离DNA含量进行定量测定的方法，其特征在于，该方法包括：

a)用本发明的上述试剂盒，以实时定量PCR法测定正常组织中DNA含量与基因拷贝数之间的函数关系：

b)从所述血液样品中分离提取DNA；

c)用本发明的上述试剂盒，以实时定量PCR法测定步骤b)所得DNA中的基因拷贝数，并根据步骤a)的函数关系将所测定的基因拷贝数换算成DNA含量。

在一个较佳的实施方案中，步骤b)的从所述血液样品中分离提取DNA是在93-97℃下用本发明所述的试剂处理所述血液样品，离心取出上清，在上清内加入异丙醇和乙醇，得到血液中游离DNA的沉淀。

实时定量PCR法是根据Taqman技术发展起来的一项新颖的基因检测方法，其原理是将靶基因特异性的一组引物和荧光标记的Taqman探针与模板cDNA进行杂交，然后在多聚酶链反应过程中利用Taq酶的3’-核酸外切酶活性水解探针3’-端的荧光淬灭基团，获得荧光激发信号，后者与模板量呈正相关。Taqman探针的制备以及荧光淬灭基团和荧光报告基团的选择对于本领域技术人员而言是众所周知的。

本发明的方法能对EGFR基因拷贝数进行绝对定量的实时定量PCR检测方法。具体而言，本发明者采用第一对引物(如表1中的SEQ ID NO：1和2)进行PCR扩增得到双链DNA片段，经纯化后作为定量PCR分析的标准品。然后，以第二对引物(如表1中的SEQ ID NO：3、4)及探针(例如表1中的SEQ ID NO：5)组合对待测DNA样品进行定量PCR检测，从标准品曲线可以确定所测定的DNA样品中的基因拷贝数。另外，用同样方法测定不同DNA含量的DNA样品中的基因拷贝数，经对数转换和回归分析得到了DNA含量和基因拷贝数之间的函数关系。依据该函数关系即可将待测样品所测得的基因拷贝数换算成DNA含量。

然而，本领域技术人员应当能够理解，列举上述具体的两组引物和探针仅仅是为了描述本发明，它们并不起任何限制性的作用。本领域技术人员在阅读了本说明书后，能够采用常规的手段在EGFR基因序列区间内适当选择其他引物来合成DNA标准品，也能够在上述EGFR标准品的序列区间内选择其它合适的引物和探针来达到本发明的目的。

以下借助非限制性实施例详细描述本发明。

实施例1：实时定量PCR检测方法的建立

1.1材料与方法

A.材料：人A431上皮样癌细胞株购自中科院上海生化和细胞生物学研究所。胎牛血清及F12培养基购自GIBCO公司。Tri Reagent RNA抽提试剂盒购自美国Molecular Research Center公司。RevertAid^TM第一链cDNA合成试剂盒购自立陶宛MBI Fermantas公司。PCR引物及荧光探针由上海赛百盛基因技术有限公司合成。PCR产物测序由宝生物工程(大连)公司完成。Ex TaqDNA聚合酶和pMD 18-T PCR产物克隆载体和实时定量PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。

B.引物、探针设计：根据Genbank数据库公开发表人上皮生长因子受体(EGFR)cDNA(X00588)序列和EGFR基因(AY588246)第28外显子序列(其中，后者是EGFR基因的序列，包括内含子和外显子。而前者是EGFR的cDNA序列，相当于EGFR基因的外显子按顺序首尾相连，不含内含子)。采用美国应用生物系统(ABI)公司的Prism Express软件，分别设计了2组引物及探针。其中引物1根据X00588序列设计，用于cDNA的PCR扩增；引物2及探针根据AY588246序列设计，用于实时定量PCR检测(表1)。

                         表1 PCR引物及探针序列

引物	核苷酸位置	碱基序列(5’-3’)	Tm(℃)	产物(bp)
					上游1	2358	cac ggt gta taa ggg act ctg(SEQ ID NO：1)	57	1372
下游1	3729	ggc ttc ctt ggg aaa gaa gt(SEQ ID NO：2)	56
				上游2	188248	cca gcc cac ctg tgt caa c(SEQ ID NO：3)	59	68
下游2	188315	ttt ggt ggc tgc ctt tct g(SEQ ID NO：4)	58
				探针	188269	FAM-cac att cga cag ccc tgc cca ct-TEMRA(SEQ ID NO：5)	68

C.定量PCR标准品的制备：

(1)RNA抽提及cDNA合成：选择活跃增殖期细胞，按试剂盒要求抽提总RNA，采用紫外分光光度法测定A260及A280，要求A260/A280＞1.80。然后取2μgRNA按试剂盒要求合成cDNA，反应体积为20μl。

(2)cDNA的PCR扩增：应用引物1对cDNA进行PCR扩增。PCR反应液内含cDNA 1μl，10x Ex Taq缓冲液5μl，2.5mM dNTP 5μl，上游及下游引物1(20μM)各1μl，Ex Taq(5U/μl)0.25μl，用DEPC-H₂O补充至50μl。PCR反应条件为95℃ 5min变性，然后95℃ 45sec.，56℃ 2min，40个循环；72℃延伸10min。扩增产物经1.6％琼脂糖凝胶电泳100V 30min后EB染色摄片。

(3)基因克隆和标准品筛选 PCR产物经电泳分离后切割阳性条带，采用试剂盒纯化后克隆到pMD 18-T载体中。然后按照操作说明筛选获得阳性表达质粒，经基因测序复核无误后用作定量PCR检测的标准品。

D.实时定量PCR检测方法的建立：标准品基因拷贝数＝质粒的摩尔浓度×6.023×10²³。质粒标准品稀释至5×10⁸拷贝/μl后分装成10μl/支，-70℃冰箱保存。检测时将标准品按1∶10稀释至5×10⁷，5×10⁶，5×10⁵，5×10⁴拷贝/μl，实时定量PCR反应液内含标准品2μl，5x实时PCR缓冲液5μl，10mM dNTP 0.75μl，250mMMg溶液0.5μl，热启动Taq酶(5U/ml)0.25μl，上游及下游引物2(100μM)各0.1μl，荧光探针(50μM)0.1μl，用DEPC-H₂O补充至25μl。PCR反应条件为60℃ 3min，95℃ 3min，然后95℃ 30sec.，60℃ 1min，45个循环；60℃时检测荧光。上述试剂适用于ABI PRISM^TM 7000型，Rotor-Gene RG3000型和LightCycler型定量PCR仪进行检测。

1.2结果

A431细胞为目前国际公认的EGFR高表达细胞株。取该细胞制备cDNA，经PCR扩增获得了单一条带，此产物经凝胶分离纯化后(图1A)，通过克隆和抗菌素筛选获得阳性表达质粒(图1B)，后者经基因测序证实序列无误后作为定量PCR检测的标准品。

以此标准品进行实时定量PCR分析，证明在基因拷贝数为10⁴-10⁸范围内能够给出线性结果，其标准曲线的相关系数R＞0.999(图2)。试剂盒在-70℃储存6个月性能稳定，其标准曲线的相关系数R均＞0.98。此外，试剂盒在37℃条件下连续放置48小时并间隔12小时进行检测，显示本试剂盒在此条件下性能稳定，其标准曲线的相关系数均＞0.99(资料未列)。

实施例2：基因组DNA检测的线性关系

2.1材料与方法

正常肺组织2例，系肺癌手术切除标本，选取离癌组织5cm以上肺组织，液氮保存。DNAezsol基因组DNA抽提试剂盒购自上海申能博采生物技术公司。

取50mg肺组织按照操作说明抽提DNA。所得的基因组DNA采用紫外分光光度法测定A260及A280，要求A260/A280＞1.80。然后取样本DNA进行系列稀释，其浓度分别为50，25，5，2.5，0.5和0.25ng/μl，各取2μl进行定量PCR检测。

2.2结果

图3结果显示，以正常肺组织基因组DNA为样本进行实时定量检测，其检测限度至少为0.5ng/反应，并且基因拷贝数与DNA含量的对数值之间呈线性关系。3次试验证明，该方法具有良好的重复性，各浓度的标准差均小于均数的10％(资料未列)。经对数转换及回归分析，求出剂量曲线的回归方程为Y＝1.23X+5.31(式中Y为基因拷贝数的对数，X为DNA含量的对数)。此方程可用于DNA浓度换算。

实施例3：血清游离DNA的定量分析

3.1材料与方法

健康人血清样本10例，肺癌病人血清样本42例，所有病人均经过细胞学或组织学诊断确认。血清制备方法为：静脉抽取3ml血液后，置洁净离心管内4℃放置过夜，然后1500转/分离心5分钟，留置上层血清-70℃冰箱保存。

血清游离DNA的抽提采用上述实施例3制得的血液游离DNA抽提试剂a)，其操作步骤如下：

1.1.5ml Eppendorf管内加入500微升血液游离DNA抽提试剂a)，95℃预热5min；

2.加入100-500微升血浆，95℃加热5min，剧烈振荡20sec；

3.13,000rpm离心5min；

4.转移300-700微升上清至新Eppendorf管内，加入等量异丙醇，室温5min；

5.13,000rpm离心5min；

6.弃上清，加入700微升70％乙醇；

7.13,000rpm离心5min；

8.弃上清，加入700微升70％乙醇；

9.13,000rpm离心5min；

10.弃上清，倒置Eppendorf管，室温干燥DNA沉淀；

11.溶解DNA于20微升H₂O中-70℃保存。

上述操作在1小时以内完成。

然后，取2微升DNA进行定量PCR检测，DNA含量(单位：拷贝数/ml血清)按下述公式计算：C＝Q×(V_DNA/V_PCR)×(1/V_EXT)    (1)

公式中Q为实测的拷贝数，V_DNA为经抽提后的DNA体积(单位：微升)，V_PCR为定量PCR检测时加入的DNA体积(单位：微升)，V_EXT为用于抽提的血清体积(单位：ml)。

上述各项参数中，V_DNA/V_PCR为常数10，因而公式(1)可以简化为：

                   C＝10×Q/V_EXT  (2)

当血清体积为0.5ml时，公式(1)可以进一步简化为；

                   C＝20×Q  (3)

上述肿瘤血清样本同时进行5项肿瘤标志物检测，其中CA19-9，CA-125和Cyfra21-1采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测，其阳性参考值分别为＞37U/ml(CA19-9)，＞35U/ml(CA-125)和＞3.3ng/ml(Cyfra21-1)。CEA和NSE采用放射免疫法检测，其阳性参考值分别为＞5ng/ml(CEA)和＞20ng/ml(NSE)。肿瘤标志物由上海市胸科医院检测。

3.2结果

10例健康人血清的DNA基因拷贝数范围为0.2-28.0×10⁶/ml，平均为8.8×10⁶/ml。按照回归方程Y＝1.23X+5.31，将基因拷贝数换算成DNA含量，健康人血清DNA含量平均为18.81ng/ml(范围：0.17-54.64ng/ml)。此数值与Leon等的报道基本吻合。若以19ng/ml作为血清DNA含量的阳性临界值，则90％的健康人(9例)低于此水平。

42例肺癌病人的血清DNA其基因拷贝数平均为57.24×10⁶/ml(范围：2-1806×10⁶/ml)，血清DNA含量平均为117.55ng/ml(范围：6.39-1626.98ng/ml)，其中10例(23.8％)DNA含量低于阳性值，即76.2％的肺癌病人血清DNA含量高于正常对照。

肿瘤血清标本的各项肿瘤标志物的阳性检测率均不超过50％，其中Cyfra21-1阳性率47.6％(20例)，CA-125阳性率42.9％(18例)，CEA阳性率26.2％(11例)，NSE阳性率16.7％(7例)和CA19-9阳性率11.9％(5例)。此外，42例血清样本中有12例上述标志物均检测阴性，其比例为占28.6％。

表2比较了血清游离DNA含量与肿瘤标志物阳性检出率的关系，发现CA19-9和NSE的检测阳性率与DNA含量呈正相关，CEA和CA-125的检测阳性率与DNA含量之间无明显相关性，而Cyfra21-1的检测阳性率在NDA含量＜19ng/ml和≥38ng/ml二组中显著增高。此外，在血清DNA含量高于阳性值的样本中，仍有30％-40％的样本5项肿瘤标志物均为检测阴性，并且在5项肿瘤标志物均为检测阴性的12例样本中，11例(91.7％)的DNA含量高于阳性值，提示血清游离DNA含量作为一项新颖肿瘤标志物具有潜在的诊断价值。

         表2血清游离DNA含量与肿瘤标志物阳性检测率的关系

血清DNA	例数	阳性病例(％)					全阴性病例
								CA19-9	NSE	CEA	CA-125	Cyfra21-1
		＜19ng/ml19-＜38ng/ml≥38ng/ml合计	10141842	0(0％)1(7.1％)4(22.2％)5(11.9％)	0(0％)1(7.1％)6(33.3％)7(16.7％)	2(20.0％)4(28.6％)5(27.8％)11(26.2％)							4(40.0％)5(35.7％)7(38.9％)18(42.9％)	7(70.0％)3(21.4％)10(71.4％)20(47.6％)	1(10.0％)6(42.8％)5(27.8％)12(28.6％)

实施例4：血浆游离DNA的定量分析

4.1材料与方法

健康人血浆样本10例，肺癌病人血浆样本21例，所有病人均为细胞学或组织学诊断确认的初治者。病人在采血后接受化疗，化疗方案见表3。化疗结束后按《临床诊疗常规》进行疗效评估。

血浆制备方法为：静脉抽取3ml血液，10U/ml肝素抗凝。血液样本经1500转/分离心5分钟后，留置上层血浆-70℃冰箱保存。

血浆DNA抽提方法与血清DNA相同，方法见实施例3。

4.2结果

10例健康人血浆中游离DNA在检测范围以下的有4例，6例检测到DNA，此6例的DNA平均含量为0.995ng/ml(范围0.49-2.24ng/ml)。21例肺癌病人的血浆标本均检测到游离DNA，平均含量为24.81ng/ml(范围5.20-146.27ng/ml)。若将血浆游离DNA含量的阳性临界值设定为3ng/ml，则正常人均为检测阴性，而肿瘤病例的阳性率为95.2％(11/12例)。因此，血浆DNA检测对肺癌的诊断阳性率明显高于血清DNA检测(95.2％vs.76.2％)。其原因是在血清制备时有一个血液凝集过程，此过程中可能有部分正常白细胞凋亡并将DNA释放到血清中，导致其含量增高而影响检测结果。而采用抗凝血制备血浆，血细胞凋亡的机会明显减少，因而其检测特异性大大提高。

对21例病人中的17例进行了疗效评估(剩余4例尚未作评估)，其中病灶吸收超过50％的(部分有效，PR)有4例，有效率为23.5％。此外，尚有5例病情不同程度缓解(MR)，包括病灶吸收25％-36％(3例)和癌性胸水得到控制(2例)。

表3分析了疗效与血浆游离DNA含量之间的相关性，发现在肺鳞癌中DNA含量低于平均值(24.81ng/ml)者(3例)均有不同程度的疗效，而高于平均值的1例未见疗效。小细胞肺癌的情况与此相反，DNA含量在平均值以上者(2例)均为化疗有效，而含量在平均值以下者(2例)均无效。

在肺腺癌中，DNA含量在10ng/ml以下者病情缓解的比例(3/4例)明显高于DNA含量在10ng/ml以上者(1/5例)。

以上资料显示，结合肺癌的组织类型进行分析，化疗前血浆DNA含量与疗效之间存在着相关性，其中在肺鳞癌和小细胞肺癌中这种关系较为清晰。这一初步研究结果与Holdenrieder等和Gautschi等的报道基本一致。

              表3肺癌病人血浆DNA含量与化疗疗效的关系

组织类型	病例编号	性别	年龄	临床分期	化疗方案*	病灶变化	疗效评估**	DNA含量#
									鳞癌腺癌小细胞癌	19241187659116101813141715	男男男男男男女女男女女男女男男男男	5059595836766248415429653759786754	T2N2M1T4N2M0T4N3M0T2N1M1T4N1M0T2N1M0T4N3M1T4N3M0T4N2M0T2N2M1T4N3M0术后复发T4N3M1T4N3M0T2N3M0T2N2M1T2N3M1	TPNPINPNPTPNPNPINPNPGPGPNPGPIEPCPEPINP	缩小33％缩小＞50％缩小＞50％稳定胸水减少稳定缩小25％缩小36％胸水控制稳定稳定稳定稳定缩小＞50％缩小＞50％稳定稳定	MRPRPRNRMRNRMRMRMRNRNRNRNRPRPRNRNR	6.2013.3915.5534.631.965.208.438.7910.6410.7112.7813.8982.1026.7527.2710.248.83

^*药物缩写P：顺铂；T：泰素；N：诺维本；I：异环磷酰胺；G：健择；E：VP-16；C：CTX

^**NR：无效；PR；部分有效；MR：病情缓解

#单位：ng/ml

尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。

                            主要参考文献

1.Taback B和Hoon DS.Curr Opinn Mol Ther，2004，6：273-278

2.Johnson PJ和Dennis Lo YM.Clin Chem，2002，48：1186-1193

3.Stroun M，Lyautey J，Lederrey G等.Clin Chim Acta，2001，313：139-142

4.Sonobe M，Tanaka F，Wada H.Ann Thorac Cardiovasc Surg，2004，10：213-217

5.Garcia-Olmo DC，Ruiz-Piqueras R，Garcia-Olmo D.Histol Histopathol，2004，19：575-583

6.Sozzi G，Conte D，Leon M，等J Clin oncol，2003，21：3902-3908

7.Xie GS，Hou AR，Li LY，等Chin Med J(Engl)，2004，117：1485-1488

8.Gal S，Fidler C，Lo YM，等Br J Cancer，2004，90：1211-1215

9.Silva JM，Silva J，Sanchez A，等Clin Cancer Res，2002，8：3761-3766

10.Sozzi G，Conte D，Mariani L，等Cancer Res，2001，61：4675-4678

11.Soozi G，Conte D，mariani L，等Cancer Res，2001，61；4675-4678

12.Trejo-Becerril C，Perez-Cardenas E，Trevino-Cuevas H，等Int J Cancer，2003，104：663-668

13.Holdenrieder S，Stieber P，von pawel J，等Clin Cancer Res，2004，10(18 Pt 1)：5981-5987

14.Gautschi O，Bigosch C，Huegli B，等J Clin oncol，2004，22：4157-4164

                                序列表

<110>上海奇诺肿瘤生物高新技术有限公司

<120>分离和测定血液游离DNA的试剂和方法

<130>051653

<160>5

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>1

cacggtgtat aagggactct g                                            21

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>2

ggcttccttg ggaaagaagt                                                20

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

ccagcccacc tgtgtcaac                                                19

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

tttggtggct gcctttctg                                                19

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>探针

<400>5

cacattcgac agccctgccc act                                            23

Claims (10)

1.一种用于分离提取血液样品中游离DNA的试剂，其特征在于，所述试剂基本上由乙酸/乙酸钾缓冲液、十二烷基硫酸钠和水组成，其中十二烷基硫酸钠的浓度为60-120毫克/毫升，所述试剂的pH为3-5。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，每100毫升所述试剂由60毫升的5M乙酸钾、11.5毫升冰乙酸、100毫克十二烷基硫酸钠以及余量水组成。

3.一种分离提取血液样品中游离DNA的方法，其特征在于，该方法包括：在93-97℃下用权利要求1所述的试剂处理所述血液样品，离心取出上清，在上清内加入异丙醇和乙醇，得到血液中游离DNA的沉淀。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述血液样品是血清或血浆。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将得到的DNA沉淀溶解于水中。

6.一种对血液样品中游离DNA含量进行定量测定的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含特异性上游引物、下游引物、DNA标准品以及Taqman探针，其中所述DNA标准品具有人上皮生长因子受体cDNA序列X00588的2358至3729位核苷酸序列，所述特异性上游引物和下游引物在人上皮生长因子受体基因AY588246的188248至188315位核苷酸区间内进行选择，所述Taqman探针具有SEQ ID NO：5所示的序列，且其5′端与荧光报告基团相连，3′端与荧光淬灭基团相连。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述上游引物具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，所述下游引物具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

8.一种对血液样品中游离DNA含量进行定量测定的方法，其特征在于，该方法包括：

a)用权利要求6所述的试剂盒，以实时定量PCR法测定正常组织中DNA含量与基因拷贝数之间的函数关系；

b)从所述血液样品中分离提取DNA；

c)用权利要求6所述的试剂盒，以实时定量PCR法测定步骤b)所得DNA中的基因拷贝数，并根据步骤a)的函数关系将所测定的基因拷贝数换算成DNA含量。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述血液样品是血清或血浆。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤b)的从所述血液样品中分离提取DNA是在93-97℃下用权利要求1所述的试剂处理所述血液样品，离心取出上清，在上清内加入异丙醇和乙醇，得到血液中游离DNA的沉淀。

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