KR101914183B1 - Tmem182 유전자 다형성을 이용한 복부비만의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법 및 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특정 바이오마커에 기반하여 복부비만 관련 위험도를 평가하는 진단 방법에 관한 것으로, (a) 대상체(subject)에서 생물학적 시료를 채취하는 단계; 및 (b) 상기 생물학적 시료에서 TMEM182(transmembrane protein 182)의 유전적 다형성(polymorphism)을 판단하는 단계;를 포함하는 복부비만의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법이 제공된다.

Description

TMEM182 유전자 다형성을 이용한 복부비만의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법 및 키트{A METHOD AND KIT FOR ASSESSING RISK OF CENTRAL OBESITY USING TMEM182 GENETIC POLYMORPHISM}

본 발명은 신규 바이오마커에 기반하여 복부비만 관련 위험도를 평가하는 진단 방법 및 키트에 관한 것이다.

체지방이 건강에 유해한 영향을 미칠 정도로 과도하게 축적된 상태를 비만이라고 한다. 체지방의 위치는 비만으로 인한 사망률과 이환율의 주요 결정 요인이다. 한국인의 경우 체지방 비대증과 복부비만의 빈도가 평행하게 증가한다. 복부비만은 복부에 과도하게 지방이 축적된 상태를 말하며, 특히, 체내 장기를 둘러싸고 있는 체강 내에 지방이 축적되는 내장비만을 복부비만과 같은 용어로 사용한다.

복부비만은 심혈관 질환 및 대사 증후군의 발병 기전에 필수적인 역할을 하는 인슐린 저항성, 이상지질혈증 및 조직적 염증과 관련이 있으며, 비만도가 높아질수록 당뇨병, 담석증, 복부비만, 심장 질환 및 뇌졸중을 포함하는 심혈관 질환 및 대사 증후군의 유병률이 증가한다.

복부비만의 원인은 음주, 흡연 및 운동 부족과 같은 문화적 요인과, 과다한 열량 섭취 또는 고지방 식이로 인한 식이 환경적 요인, 및 유전적 요인이 있다.

복부비만을 진단하는 방법은 체질량 지수(BMI), 체지방률, 허리 둘레 및 허리 엉덩이 비율 등 다양한 척도가 있다. 그러나 이러한 진단 방법은 한정된 신체적 특성에만 의존하는 진단 방법이기 때문에 이들 척도만으로는 복부비만을 정확히 진단하는데 어려움이 있다.

따라서 복부비만을 일으키는 생물학적 메커니즘을 기반으로 하여 복부비만의 위험도를 평가하는데 사용될 수 있는 바이오마커를 발굴하고, 이를 이용하여 복부비만의 위험도를 평가하는 방법을 개발할 필요가 있다.

바이오마커는 일반적으로 단백질이나 DNA, RNA, 대사물질 등을 이용해 몸 안의 변화를 알아낼 수 있는 지표를 의미하며, 바이오마커를 활용하면 대상체의 정상 또는 병리적인 상태, 약물에 대한 반응 정도 등을 객관적으로 측정할 수 있다. 바이오마커는 특정 질병의 내적 표현형이라고 불리며, 특정 질병의 원인을 찾거나 발병 위험도를 측정하는데 이용될 수 있다.

상기 복부비만과 동일한 의미인 내장비만은 내장주변에 지방이 과도하게 축적된 상태를 말하며, 내장주변에 체내 지방세포는 대부분 백색 지방 조직이다. 백색 지방 조직의 필수적인 표현형 중 하나로 막관통단백질의 하나인 TMEM182(transmembrane protein 182)의 발현이 있다. TMEM182 전사체량의 증가는 비만조직의 분화 및 염증유발 사이토카인과 관련이 있으며, 막관통단백질인 TMEM182를 암호화 하는 TMEM182 유전자는 복부비만의 새로운 바이오마커일 수 있다.

따라서 본 발명자들은 TMEM182가 복부비만 진단을 위한 새로운 후보 유전자인지 여부 및 TMEM182 단일염기다형성(SNP)이 한국인의 복부비만에 미치는 영향을 규명하고자 하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 TMEM182 유전자상의 특정 SNP를 검출하고 이를 통해 복부비만의 위험성 또는 예후를 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, (a) 대상체(subject)에서 생물학적 시료를 채취하는 단계; 및 (b) 상기 생물학적 시료에서 TMEM182(transmembrane protein 182)의 유전적 다형성(polymorphism)을 판단하는 단계;를 포함하는 복부비만의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법이 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 (b) 단계에서 상기 TMEM182 rs141764639 부위의 유전적 다형성이 검출된 경우 상기 대상체의 복부비만 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 (b) 단계에서 상기 TMEM182 rs141764639 부위에서 C 대립 유전자의 존부를 판단할 수 있다.

일 실시예에 있어서, (c) 상기 대상체의 TNF-α의 수준을 더 측정하는 단계;를 더 포함할 수 있고, 상기 (c) 단계에서 상기 TNF-α의 수준이 높은 경우 복부비만 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 TMEM182 rs141764639 부위의 유전적 다형성이 산화-LDL(ox-LDL)의 수준을 증가시키고, LDL 입자 크기를 감소시킬 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, TMEM182 rs141764639 부위의 C 대립 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 복부비만 발병 위험도 진단용 키트가 제공된다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 특정 유전자의 다형성(polymorphism)에 기반하여 복부비만의 발병 가능성을 효과적으로 예측할 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정한 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 정상 대조군과 복부비만 대상자에서 TMEM182 rs141764639 유전자형의 분포를 나타낸 것이다.
도 2는 총 대상자, 정상 대조군 및 복부비만 대상자에서 TMEM182 rs141764639 유전자형에 따른 LDL 입자 크기, TNF-α 수준 및 IL-6 수준의 차이를 나타낸 것이다.

이하에서는 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다.

어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고서에 기술되어 있다.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.

본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 또한, 달리 지시된 바가 없으면, 핵산은 각각 왼쪽에서 오른쪽, 5'에서 3' 방향으로 씌여지고, 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽, 아미노에서 카르복실 방향으로 씌여진다. 이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, (a) 대상체(subject)에서 생물학적 시료를 채취하는 단계; 및 (b) 상기 생물학적 시료에서 TMEM182(transmembrane protein 182)의 유전적 다형성(polymorphism)을 판단하는 단계;를 포함하는 복부비만의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법이 제공된다.

상기 대상체(subject)는 진단 대상으로서 인간일 수 있고, 상기 생물학적 시료는 복부비만 관련 질환의 위험성을 평가하고자 하는 상기 대상체에서 분리된 시료로써, 조직, 세포, 혈액, 혈장, 복막액, 활막액, 타액, 소변, 대변 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게 상기 생물학적 시료는 혈액일 수 있으며, 구체적으로 혈액에서 분리된 혈장일 수 있다.

상기 복부비만은 배에 과도한 지방이 축적된 상태로, 한국인 허리 둘레 기준으로 남자 90 cm(35.4 인치), 여자 85 cm(33.5 인치) 이상인 경우에 해당된다. 복부비만의 증상은 명확하게 인지되지 않는 경우가 많으며, 일반적으로 체중이 증가하면서 허리 둘레가 늘어나 자각하게 되지만, 정상 체중의 복부비만도 존재한다. 복부비만은 내장지방 축적으로 인해 횡격막이 과다 신장되어 호흡운동 시 폐의 움직임을 방해하면, 수면 중 코를 골다가 호흡을 멈추는 수면 무호흡증이 유발될 수 있다.

일반적으로 복부비만을 진단하는 방법은 간편한 허리 둘레 측정법이 널리 사용된다. 보통 늑골(갈비뼈) 하단부(가장 아래 부분)의 장골능(골반 뼈의 엉덩이 위 끝) 상부의 중간 점에서 측정하는 방법이 많이 사용되고 있으며, 이 부위는 통상적으로 배꼽 부위를 지나게 된다. 허리둘레는 내장지방량과 높은 관련이 있으며 체질량 지수보다 심혈관 질환과 더욱 밀접한 관련성이 있는 것으로 알려져 있다.

복부비만을 검사하는 방법은 컴퓨터 단층촬영을 이용하여 내장지방을 측정하는 것이다. 복강 내 지방축적의 지표로는 내장지방면적과 내장지방면적 및 피하지방면적의 비율이 사용되며 내장지방면적이 더 좋은 지표로 알려져 있다. 비만 관련 질환의 위험에 대한 내장지방 면적의 기준점은 현재 통일된 것은 없지만 일본인을 대상으로 한 연구에서는 내장지방이 100cm² 이상일 때 심혈관 질환의 위험이 증가한다고 보고된 바 있다. 그러나 컴퓨터 단층촬영은 방사선 노출의 위험성과 고비용으로 인해 접근성이 미흡한 문제점이 있다.

상기 TMEM182(transmembrane protein 182) 유전자는 생체막의 지질 2중층을 관통하여 생체막의 주요 구성 요소가 되는 막관통단백질(transmembrane protein) 중 하나인 TMEM182(transmembrane protein 182)를 암호화한다. 다른 TMEM182 막관통단백질의 기능은 알려져 있지 않으나 지방세포에서 발현된다는 점과 녹내장의 잠재적인 역할을 한다는 연구가 있다. 한국인의 질병 및 복합 형질에 관한 유전 연구에 최적화된 Korean Chip(K-CHIP)을 사용하여 복부비만과 연관된 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)은 대부분 허리 둘레와 관련이 있으며, 그 중 하나의 SNP로서 TMEM182가 확인되었다.

상기 “단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)”은 게놈에서 단일염기(A, T, C 또는 G)가 종의 멤버들 간 또는 한 개체(individual)의 쌍 염색체 간 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다.

예컨대, 서로 다른 개체의 세 개의 DNA 단편들(예: AAGT[A/A]AG, AAGT[A/G]AG, AAGT[G/G]AG)과 같이 단일염기에서 차이가 있을 때, 이를 두 개의 대립 유전자(C 또는 T)라고 부르며 대다수의 SNP는 두 개의 대립 유전자를 포함한다.

상기 SNP는 한 집단(population)내에서 소수 대립형질 빈도(minor allele frequency, MAF; 특정 집단에서 발견되는 유전자위치(locus)에서 가장 낮은 대립형질 빈도)로 할당될 수 있다. 인간 집단 내에서 일부 변이성(variations)이 존재하며, 지질학적 또는 민족적 군에서 공통적인 하나의 SNP 대립 유전자는 매우 희귀하다. 상기 단일염기는 폴리뉴클레오타이드 서열에 변화(대체), 제거(결실) 또는 첨가(삽입)될 수 있으므로, 번역 프레임의 변화를 유발할 수 있다.

상기 단일염기다형성은 유전자의 코딩 서열, 유전자의 비-코딩 부위 또는 유전자 사이의 내부 지역(intergenic regions)에 포함될 수 있다. 유전자의 코딩 서열 내의 SNP는 유전암호의 중복성(degeneracy)으로 인해 반드시 타겟 단백질의 아미노산 서열의 변화를 수반하는 것은 아니다. 동일한 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP는 동의적(synonymous)이라 하고, 다른 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP는 비-동의적(non-synonymous)이라고 한다. 상기 비-동의적 SNP는 미스센스 또는 넌센스일 수 있으며, 상기 미스센스 변화는 다른 아미노산을 발생시킬 수 있고 상기 넌센스 변화는 비성숙 종결코돈을 형성할 수 있다. 단백질-코딩 부위가 아닌 곳에 존재하는 SNP는 유전자 사일런싱, 전사인자 결합 또는 비-코딩 RNA 서열을 유발시킬 수 있다.

인간의 DNA 서열 상의 변이는 질병의 발병 또는 병원체, 화학물질, 약물, 백신 및 다른 시약에 대한 인체의 반응에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 상기 SNP는 맞춤형 의약의 중요한 도구(key enabler)로 활용될 수 있다. 특히, 상기 SNP는 질병군 또는 비질병군 간의 게놈 부위를 비교하는 방식으로 질병을 진단하는 생의학적 연구에서 고려될 수 있다. 상기 SNP는 인간 게놈의 가장 많은 변이이며, 1.9 kb 당 하나의 SNP 비율로 존재하는 것으로 추측되고 있다(Sachidanandam et al., 2001). 상기 SNP는 매우 안정된 유전적 마커이고, 표현형에 직접적인 영향을 미칠 수 있으며, 자동화된 유전자형 규명 시스템에 매우 적합하다(Landegren et al., 1998; Isaksson et al., 2000).

한편, 상기 (b) 단계에서 상기 TMEM182 rs141764639 부위의 유전적 다형성이 검출된 경우 상기 대상체의 복부비만 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다.

상기 TMEM182 rs141764639 부위는 TT 및 TC 형태가 존재한다. 정상인과 복부비만 환자에서 TMEM182 rs141764639 부위의 유전자형을 분석한 결과 복부비만 환자의 경우 TMEM182 rs141764639 부위에서 C 대립 형질의 유전자형이 정상인에 비해 상대적으로 많이 확인되었다.

따라서, 상기 (b) 단계에서 상기 TMEM182 rs141764639 부위에서 C 대립 유전자의 존부를 판단할 수 있고, 상기 TMEM182 rs141764639 부위에서 C 대립형질로 판단될 때 복부비만 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 대상체의 TNF-α의 수준을 더 측정할 수 있고, 상기 TNF-α의 수준이 높은 경우 복부비만 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다.

상기 TNF-α는 지방 조직에서 병리 생리학의 중심적인 역할을 하는 전염증성 사이토카인이며, 많은 지방세포의 유전자 발현을 억제하는 역할을 한다. 상기 TNF-α의 증가는 비만과 관련이 있다. 지방세포에 TNF-α를 처리하면, 지방 분해와 탈분화를 촉진시키며, 탈분화는 주요 지방세포 전사 인자인 PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma)와 C/EBPα(CCAAT-enhancer-binding protein alpha)로 인한 TNF-α가 매개하는 전사 조절에 의한 것이다. 최근 연구에는 TNF-α가 백색 지방 조직에서 TMEM182의 발현을 조절하고, TNF-α를 처리하면, TMEM182의 전사 수준이 약 90% 감소한다고 보고된 바 있다(Wu et al., BMC Res Notes. 1:85(2008)).

따라서, TMEM182의 유전자형은 상기 TNF-α의 수준과 관련이 있고, TNF-α가 증가되면 비만일 가능성이 높기 때문에, 상기 (c) 단계에서 상기 TNF-α의 수준이 높은 경우 복부비만 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, TMEM182 rs141764639 위의 C 대립 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 복부비만 발병 위험도 진단용 키트가 제공된다.

상기 프라이머(primer)는 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 포함하는 짧은 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능할 수 있다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있으며, 표적 미생물에 존재하는 핵산과 혼성화되어 상기 특정 유전자를 증폭하는데 사용될 수 있다.

상기 프라이머는 증폭의 효율을 고려하여 바람직하게는 단쇄일 수 있으며, 디옥시리보뉴클레오타이드(Deoxyribonucleotide)일 수 있다. 상기 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 상기 프라이머는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산(PNA)(M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조 릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

상기 프라이머는 타겟 핵산에 어닐링 되어 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 타겟 핵산에 상보적인 서열을 형성하는 연장 프라이머(extension primer)일 수 있으며, 고정화 프로브가 어닐링 되어 있는 위치까지 연장되어 프로브가 어닐링 되어 있는 부위를 차지할 수 있다.

상기 연장 프라이머는 타겟 핵산의 특정 위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 상기 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 “실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함할 수 있다.

상기 프라이머는 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길수 있다. 상기 프라이머의 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정될 수 있고 일반적으로 15 내지 30개의 뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 상대적으로 낮은 온도가 요구될 수 있다. 상기 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성할 수 있다.

상기 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 상기 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함할 수 있다(Scheit, NucleotideAnalogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, ChemicalReviews, 90:543-584(1990)).

상기 특정 서열을 규명하는 것은 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예컨대, 형광 핵산 혼성화(FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석(Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동(DGGE, Wartell et al., Nucl.AcidsRes., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질(예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법(Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 및 대립형-특이 PCR이 사용될 수 있다.

서열변화가 단일-가닥 분자내 염기 결합의 차이를 초래하여 이동성이 다른 밴드가 형성될 수 있으며, 상기 SSCA는 상기 밴드를 검출할 수 있다. 상기 DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 상이한 이동성을 나타내는 서열을 검출할 수 있다.

다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 SNP들을 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용할 수 있다.

상기 RNase 보호 분석에서, 상기 SNP들을 포함하는 서열에 상보적인 리보프로브가 이용될 수 있다. 상기 분석에서 상기 리보프로브와 인간으로부터 분리한 DNA 또는 mRNA를 혼성화시키고, 미스매치를 검출할 수 있는 RNase A 효소로 절단할 수 있다. 만일, 미스매치가 있어 RNase A가 인식을 한 경우 상대적으로 작은 밴드가 관찰될 수 있다.

상기 혼성화 시그널을 이용하는 분석에서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용될 수 있다. 상기 분석에서 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 복부비만의 위험도를 판단할 수 있다.

상기 “프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미할 수 있다. 상기 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥일 수 있고, 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드일 수 있다.

상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 상기 프로브로서 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다.

상기 프로브는 상기 SNP를 포함하는 10 내지 30개의 연속 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열 일치에 의해 결정될 수 있으므로, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 상기 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다.

혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., MolecularCloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic AcidHybridization, A PracticalApproach, IRL Press, Washington, D.C.(1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 상기 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 상기 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 상이하게 결정될 수 있다.

상기 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 대상체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것(예컨대, 대사 이상 또는 당뇨병의 동정), 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)를 포함할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 유전적 다형성(polymorphism)은 마이크로어레이 또는 유전자 증폭에 의해 식별될 수 있다.

상기 “증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미할 수 있다. 다양한 증폭 반응이 당업계에 알려져 있으며, 예컨대 상기 증폭 반응은 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, MolecularCloning. A LaboratoryManual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self-sustained sequence replication)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오타이드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 방법은 마이크로어레이 방식으로 수행될 수도 있다. 상기 마이크로어레이는 고상표면에 고정화된 프로브를 이용할 수 있다. 상기 프로브는 상기 SNP를 포함하는 각 유전자상의 10 내지 100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다.

상기 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용될 수 있고 기체(substrate) 상에 고정화될 수 있다. 상기 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화될 수 있다.

상기 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시될 수 있다. 예컨대, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수도 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

상기 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화될 수 있다. 혼성화 조건은 다양하게 변경할 수 있고, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수도 있다.

상기 프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다.

상기 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methodsin Enzymology, 65:499(1986))에 의해 라벨링될 수 있다. 상기 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공할 수 있다.

상기 분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 상기 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

상기 프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킬 수 있다. 상기 적절한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 상기 절차는 연구실에서의 사용을 위한 프로토콜을 수립하고자 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시될 수 있다. 예컨대, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 상기 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., MolecularCloning, A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, NucleicAcid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)을 참조할 수 있다.

예컨대, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미할 수 있다. 또는 상기 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미할 수 있고, 저 엄격조건은 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미할 수 있다.

상기 혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출할 수 있다. 예컨대, 상기 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 상기 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다.

상기 효소 및 기질은 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl 및 pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코오스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)가 사용될 수 있다.

상기 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수도 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 기술한다.

실험방법

실험대상

국민 건강 보험 일산 병원(National Health Insurance Corporation Ilsan Hospital)에서 2010년 1월 내지 2015년 3월의 기간 동안 정기적으로 검진을 받고 있는 검진자 중에서 혈액 및 소변 샘플의 제공을 동의한 지원자를 대상으로 하였다.

총 2,167 명의 대상자를 선발하였고, 현재 한국의 복부비만 진단 기준으로 남성인 경우 허리 둘레가 90 cm 미만, 여성인 경우 허리 둘레가 85 cm 미만이면 정상 대조군으로, 남성인 경우 허리 둘레가 90 cm 이상, 여성인 경우 허리 둘레가 85 cm 이상이면 복부비만으로 분류하였다.

현재 심혈관 질환, 간 질환, 신장 질환, 췌장염 또는 암 진단을 받았거나 기록이 있거나, 어떤 약물이든 정기적으로 복용하는 대상자는 제외하였다.

실험에 착수하기 전에 모든 참가자들에게 실험의 목적을 상세히 설명한 후 동의서를 받았다. 수행된 실험의 프로토콜은 일산병원 및 연세대학교의 승인을 받았으며 헬싱키 선언(Helsinki Declaration)에 따라 수행되었다.

유전자형 분석 및 SNP 선별

총 2,167개의 샘플을 Axiom®2.0 Reagent Kit(Affymetrix Axiom®2.0 Assay User Guide) 제조업체의 프로토콜에 따라 유전자형을 결정하였다. 약 200 ng의 gDNA가 증폭되었고 25~125 bp의 단편으로 무작위로 절편화 하였다. gDNA 초기 증폭은 10 ng/μL 농도의 gDNA 20 μL 와 변성 마스터 믹스 20 μL 를 포함하는 총 40 μL 반응 부피에서 실시하였다. 초기 증폭 반응은 초기 증폭을 위한 상온에서 10분 배양을 포함하고, 배양 생성물은 Axiom 2.0 Neutral Soln 130 μL, Axiom 2.0 Amp Soln 225 μL 및 Axiom 2.0 Amp Enzyme 5 μL로 증폭되었다. 증폭 반응은 23±1시간 동안 37℃에서 수행 하였다. 200 내지 1,100 bp 길이의 절편을 증폭하기 위해 최적화된 반응으로 증폭 산물을 분석하였다. 절편화 단계는 증폭 산물을 약 25-50 bp 길이의 단편으로 감소시키고, 바이오티닐화 뉴클레오타이드를 사용하여 말단 표지 하였다.

혼성화 후, 비특이적 백그라운드를 제거하고, 랜덤 결찰에 의한 배경 잡음을 최소화하기 위해 엄격한 조건 하에서 타겟 밴드를 세척하였다. 다형성 뉴클레오타이드는 어레이 표면상에서 수행된 다색 라이게이션을 통해 조사하였다. 어레이는 GeneTitan MC Instrument(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 염색하고 이미지화 하였다. 이미지는 Genotyping Console™ 소프트웨어(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 분석하였다.

유전자형 데이터는 K-CHIP을 통해 얻었다. K-CHIP은 국립보건연구원 유전체과학센터에서 설계되었다.

인체측정

모든 실험 대상자는 체중, 신장 및 체질량 지수(BMI, kg/m²)를 측정하였다.

허리둘레는 대상자가 직립상대로 평균적으로 숨을 내쉰 상태에서 배꼽 선 위로 측정하였다.

수축기 혈압과 이완기 혈압은 자동 혈압계(FT-200S; Jawon Medical, Gyeongsan, Korea)를 사용하여 대상자가 착석 위치에서 적어도 20분의 휴식 기간 후에 적절한 크기의 커프가 있는 것으로 측정하였다. 혈압은 2회 측정한 후 그 평균값을 사용하였다.

임상 검사

최고 12시간 이상 하루 밤 동안 단식한 후 대상자로부터 혈액 샘플을 채취하여 분석할 때까지 -70°C에서 보관하였다.

공복 혈당, 트리글리세라이드(TG), 총 콜레스테롤(TC), 저밀도 지질단백질-콜레스테롤(LDL-cholesterol) 및 고밀도 지질단백질-콜레스테롤(HDL-cholesterol)의 수준은 자동 분석기(HITACHI 7600 Autoanalyzer, Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였다.

인슐린은 DIAsource ImmunoAssays S.A.(Louvain, Belgium)의 면역 방사선 측정 분석 키트를 사용하여 측정하였다.

인슐린 저항성(IR: Insulin resistance)은 하기 방정식을 이용하여 항상성 모델 평가(HOMA: homeostasis-model assessment)에 의하여 계산하였다: HOMA-IR = [공복 인슐린(μIU/mL) × 공복 혈당(mmol/L)] / 22.5.

hs-CRP(Serum high-sensitivity C-reactive protein)는 hs-CRP-Latex(II) X2 kit (Denka-Seiken Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 이용하여 ADVIA 2400 Clinical Chemistry System (Siemens Ltd., Tarrytown, NY, USA) 방법에 따라 분석하였다.

LDL 입자는 순차 부양 초원심분리기로 분리하고, 입자 크기 분포(1.019-1.063 g/mL)를 직쇄상 2-16% 아크릴아마이드 구배(CBS Scientific Company)를 함유하는 상업적으로 이용 가능한 비-변성 겔(non-denaturing gels) 상에서 공극-구배 리포프로틴 시스템(CBS Scientific Company)을 이용하여 측정하였다. 티로글로불린(thyroglobulin)(17 nm), 페리틴(ferritin)(12.2 nm), 및 카탈라아제(catalase)(10.4 nm) 표준과 컨쥬게이션된 라텍스-비드(30 nm)를 상대적인 밴드 이동률(migrationrates)을 측정하는데 이용하였다. 겔은 GS-800 Calibrated Imaging Densitometer(Bio-Rad Laboratories)를 이용하여 스캔하였다.

TNF(tumor necrosis factor)-α 및 IL(interleukin)-6는 Bio-Plex Reagent Kit 및 Bio-Plex(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 측정하였다.

통계적 분석

대립형질 빈도는 HWE 검사가 수행되는 동안 유전자 계산에 의해 결정되었다. HWE는 PLINK 버전 1.07(http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/)을 사용하여 평가하였다. 통계적 분석은 SPSS v. 23.0(IBM, Chicago, IL, USA)을 이용하여 수행하였다. 결과값은 평균±표준오차(SE)로 표현하였으며, 양측 P-검정값(two-tailed P-value)<0.05를 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

독립 t-검정을 이용하여 정상 대조군과 복부비만 대상자의 TT 및 TC 유전자형의 파라미터를 비교하였다.

유전자형과 허리 둘레 사이의 연관성은 이원 변량 분석(two-way ANOVA)을 사용하여 분석하였다.

단계적 회귀분석(stepwise regression analysis)을 수행하여 TMEM182 rs141764639 다형성에 대한 변수의 독립 효과를 측정하였다.

유전자형과 복부비만 간의 연관성을 연령과 성별을 보정한 후 선형회귀분석을 통해 평가하였다. 빈도는 카이 제곱(χ²) 테스트로 평가하였다.

복부비만과 유전자형의 연관성은 교란 요인을 보정하여 95% 신뢰구간(confidence intervals; CIs)의 오즈비(ORs)로 로지스틱 회귀분석을 통해 계산하였다.

실험결과

실험예 1 : 복부비만 유무에 따른 임상 및 생화학적 특징

2,141명의 대상자에 관한 임상적 및 생화학적 특성은 하기 표 1과 같다.

체중, BMI, 허리 둘레, 허리 엉덩이 비율, 수축기 혈압 및 이완기 혈압과 같은 기본 인체 파라미터는 정상 대조군(n=1,314)과 복부비만 대상자(n=827)간의 전후 연령과 성별을 보정하였다(모두 p<0.001).

정상 대조군과 비교하여 복부비만의 임상학적 특징 중 트리글리세라이드, 총 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, 포도당, 인슐린, HOMA-IR의 수치가 높았고, HDL-콜레스테롤의 수치는 낮았다.

또한, 연령과 성별을 보정하기 전후에 정상 대조군과 비교하여 복부비만 대상자는 hs-CRP, TNF-α 및 IL-6 수준이 높았고, LDL 입자 크기가 더 작았다.

구분	대조군(n=1,314)	복부비만(n=827)	P	P'
연령(년)	48.5±0.30	51.4±0.42	<0.001	-
남성(%)	561 (42.7)	299 (36.2)	0.003	-
체중(kg)	60.6±0.24	70.2±0.39	<0.001	<0.001
BMI(kg/m2)	22.7±0.06	26.4±0.09	<0.001	<0.001
허리 둘레(cm)	79.8±0.15	92.3±0.19	<0.001	<0.001
허리 엉덩이 비율	0.86±0.00	0.93±0.00	<0.001	<0.001
수축기혈압(mmHg)	119.6±0.42	125.8±0.57	<0.001	<0.001
이완기혈압(mmHg)	74.9±0.30	78.9±0.39	<0.001	<0.001
트리글리세라이드(mg/dL)∮	113.4±1.92	147.3±2.96	<0.001	<0.001
총 콜레스테롤(mg/dL)∮	194.9±0.96	202.8±1.29	<0.001	<0.001
HDL-콜레스테롤(mg/dL)∮	54.9±0.37	50.1±0.45	<0.001	<0.001
LDL-콜레스테롤(mg/dL)∮	117.9±0.88	124.5±1.18	<0.001	0.002
포도당(mg/dL)∮	95.6±0.58	100.8±0.82	<0.001	<0.001
인슐린(μIU/dL))∮	8.47±0.12	10.6±0.19	<0.001	<0.001
HOMA-IR∮	2.01±0.04	2.63±0.06	<0.001	<0.001
hs-CRP(mg/dL)∮	1.18±0.09	1.45±0.08	<0.001	<0.001
LDL 입자 크기(nm)∮	24.0±0.04	23.9±0.04	0.012	0.003
TNF-α(pg/mL)∮	10.4±0.56	10.7±0.43	0.032	0.013
IL-6(pg/mL)∮	3.65±0.12	3.84±0.17	0.021	0.007

각 값들은 평균±표준오차로 나타내었다; ^∮은 로그 변환으로 검사한 값이다. 대조군 및 복부비만 대상자 사이의 독립적인 t-test로 파생된 P-값. 연령과 성별을 보정한 후 대조군 및 복부비만 대상자 사이의 독립적인 t-test로 파생된 P'-값.

실험예 2 : 대립형질 분석

TMEM182 rs141764639 유전자형에 대해 정상 대조군 1,314명(남성 561명, 여성 753명)과 복부비만 대상자 827명(남성 299명, 여성 528명)의 유전자형을 분석하였다.

총 대상자의 유전자형 분포는 하디-바인베르크 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)에서 현저히 벗어나지 않았다(p>0.05).

TMEM182 rs141764639 유전자형에서 소수의 대립 유전자 동형접합체는 존재하지 않았다.

TMEM182 rs141764639의 C 대립형질 빈도는 복부비만 대상자에서 4.7%, 정상 대조군에서 2.4%로 나타났다(도 1).

TMEM182 rs141764639 유전자형의 대립형질 빈도와 유전자형 분포의 유의한 차이(각각 p=2.4E-5 및 p=1.7E-5)는 복부비만 대상자 및 정상 대조군에서 나타났다.

실험예 3 : TMEM182 rs141764639 유전자형 차이에 따른 임상 및 생화학적 특성

TMEM182 rs141764639 유전자형에 따른 총 대상자에 관한 임상 및 생화학적 특성은 하기 표 2와 같다.

유전자형과 체중, BMI, 허리 둘레, 허리 엉덩이 비율, 수축기 혈압, 트리글리세라이드, HDL-콜레스테롤, 포도당, HOMA-IR, hs-CRP(표 2), LDL 입자 크기, TNF-α 및 IL-6(도 2)는 유의한 연관성이 있었다.

즉, TC 유전자형은 더욱 복부비만인 대상자와 연관이 있었으며, 이들은 주 대립 유전자 동형접합체인 TT 유전자형 대상자에 비해 혈압, 혈당 관련 파라미터, 염증 마커 및 사이토카인이 더 높고, LDL 입자 크기가 더 작았다.

정상 대조군에서 TC 유전자형은 TT 유전자형에 비해 체중, BMI, 혈당이 현저히 높았고(각각 p=0.028, p=0.046, 및 p=0.007), 허리 둘레(p=0.072)가 큰 경향을 보였다.

TC 유전자형인 복부비만 대상자는 TT 유전자형에 비해 허리 엉덩이 비율(p=0.035)과 허리 둘레(p=0.087)가 큰 경향을 보였다.

총 대상자(p=0.007) 및 복부비만 대상자(p=0.011)에서 TMEM182 rs141764639 유전자형과 LDL 입자 크기의 유의한 차이가 있었다(도 2).

전염증성 사이토카인인 TNF-α의 경우, 모든 집단에서 TC 유전자형 개개인이 TT 유전자형 개개인과 비교하여 TNF-α의 수치가 현저히 높았다(도 2).

정상 대조군뿐 아니라 복부비만 대상자에서도 IL-6 수준의 차이는 보여지지 않았으나, 총 대상자의 TC 유전자형은 IL-6의 수치가 높았다(p=0.045).

또한, 정상 대조군에 비해 복부비만 대상자에서 TMEM182 rs141764639 유전자형과 허리 둘레 사이에 유의한 연관성은 LDL 입자 크기(연관성 p=0.002), TNF-α(연관성 p<0.001) 및 IL-6(연관성 p=0.035)와 관련이 있었다.

TNF-α 농도는 TMEM182 rs141764639 유전자형(표준화 β=0.182, p<0.001) 뿐 아니라 복부비만의 유무(표준화 β=0.073, p=0.003)와 관련이 있으며, 이는 TNF-α 농도가 TMEM182 rs141764639 유전자형과 복부비만의 독립적인 예측 인자임을 시사한다.

구분	총(n=2,141)		대조군(n=1,314)		복부비만(n=827)
	TT (n=2,001)	TC (n=140)	TT (n=1,252)	TC (n=62)	TT (n=749)	TC (n=78)
연령(년)	49.5±0.26	50.6±0.94	48.5±0.31	49.3±1.19	51.3±0.44	51.6±1.40
체중(kg)	64.1±0.24	67.2±0.90 a	60.4±0.25	63.0±1.01 c	70.2±0.41	70.6±1.28
BMI(kg/m2)	24.1±0.07	25.0±0.25 a	22.7±0.07	23.3±0.28 c	26.4±0.10	26.4±0.31
허리 둘레(cm)	84.4±0.18	87.9±0.66 a	79.7±0.16	81.0±0.62	92.2±0.20	93.3±0.55
허리 엉덩이 비율	0.89±0.00	0.91±0.00 a	0.86±0.00	0.87±0.01	0.93±0.00	0.94±0.00 c
수축기혈압(mmHg)	121.8±0.36	124.7±1.26 c	119.4±0.43	122.0±1.68	125.7±0.60	126.8±1.79
이완기혈압(mmHg)	76.3±0.25	77.9±0.89	74.8±0.31	76.1±1.30	78.8±0.41	79.2±1.21
트리글리세라이드(mg/dL)∮	125.4±1.73	142.5±7.13 c	113.0±1.94	122.1±11.3	146.1±3.14	158.8±8.71
총 콜레스테롤(mg/dL)∮	197.9±0.80	198.2±3.11	194.8±0.99	196.2±3.92	203.1±1.34	199.8±4.64
HDL-콜레스테롤(mg/dL)∮	53.2±0.30	50.3±1.10 c	55.0±0.38	53.0±1.75	50.3±0.47	48.2±1.37
LDL-콜레스테롤(mg/dL)∮	120.4±0.73	120.9±2.92	117.8±0.90	120.7±3.82	124.9±1.23	121.0±4.28
포도당(mg/dL)∮	97.4±0.50	101.5±1.92 c	95.3±0.59	101.8±2.90 b	100.8±0.86	101.3±2.58
인슐린(μIU/dL))∮	9.23±0.11	9.80±0.39	8.46±0.13	8.65±0.47	10.6±0.20	10.7±0.59
HOMA-IR∮	2.23±0.03	2.44±0.11 c	2.00±0.04	2.16±0.12	2.62±0.06	2.67±0.17
hs-CRP(mg/dL)∮	1.26±0.06	1.57±0.27 c	1.18±0.09	1.25±0.35	1.41±0.08	1.82±0.40

각 값들은 평균±표준오차로 나타내었다; ^∮은 로그 변환으로 검사한 값이다.

독립적 t-test로 P-값은 따라 대조군과 비교했을 때 ^a p<0.001, ^b p<0.01, ^c p<0.05로 계산되었다.

실험예 4 : TMEM182 rs141764639 유전자형에 따른 복부비만 연관성

복부비만 대상자에 대한 연령, 성별, 및 음주 상태의 미보정 및 보정된 오즈비(odds ratios; OR)는 하기 표 3과 같다.

TMEM182 rs141764639 C 대립형질 내의 복부비만에 대한 오즈비는 대조군과 비교하여 2배 높았다[OR: 2.048 (95% CI : 1.459-2.876), p=3.4E-5].

TC 유전자형을 가진 개개인의 복부비만에 대한 오즈비는 TT 유전자형과 비교하여 현저히 높았다[OR : 2.103 (95% CI : 1.489-2.971), p=2.5E-5].

이러한 연관성은 나이, 성별 및 음주 상태를 조정한 후에 유지되었다(표 3).

TMEM182 rs141764639	복부비만 (n=87) vs. 대조군 (n=1,314)		P -값
	OR	95% CI
모델1
Ta 대비 C	2.048	1.459-2.876	3.4E-5
TTa 대비 TC	2.103	1.489-2.971	2.5E-5
모델2
Ta 대비 C	2.068	1.468-2.914	3.3E-5
TTa 대비 TC	2.125	1.499-3.015	2.3E-5

^a 비교군. CI; 신뢰구간(Confidence interval). 모델 1: 미보정값; 모델 2: 연령, 성별, 및 음주 상태 보정값.

상기 결과는 TMEM182 rs141764639 유전자형과 복부비만 사이의 연관성이 있음을 시사한다. TMEM182 rs141764639 C 대립형질은 교란 인자 보정 전후 복부비만의 위험성 증가와 연관성이 있으며, 상기 연관성은 전염증성 사이토카인인 TNF-α 조절과 관련이 있다.

상기 결과는 TMEM182 유전자 2q12.1 유전자간부위에 위치한 SNP rs141764639가 복부비만과 연관이 있음을 시사한다. 상기 결과에서 TMEM182 rs141764639 C 대립형질 대상자는 과량의 백색 지방 조직이 존재하는 복부 지방이 더 많았으며, 이로 인해 체중, BMI, 허리 둘레 및 허리 엉덩이 비율이 높았다. 이러한 경향은 정상 대조군과 복부비만 대상자에서 나타났다.

또한, TNF-α는 모든 그룹에서 C 대립형질이 상당히 높았다. 이는 TNF-α 농도가 TMEM182 rs141764639 유전자형 및 복부비만의 유무와 관련이 있음을 시사한다. 즉, TNF-α 농도가 TMEM182 rs141764639 유전자형과 복부비만의 독립적인 예측 인자임을 시사하며, TMEM182 rs141764639 유전자형과 TMEM182 발현은 TNF-α 경로에 의해 매개되는 지방 세포의 필수적인 표현형임을 시사한다.

복부비만은 혈중 지질단백질-지질 프로파일과 관련이 있으며, 증가된 트리글리세라이드 수치, 감소된 HDL-콜레스테롤 수치, 작은 크기의 LDL-입자 및 높은 밀도 특성이 있다.

상기 결과에서 TMEM182 rs141764639 C 대립형질은 LDL 입자크기와 트리글리세라이드 수치에 영향을 주었다. 정상 대조군과 복부비만 대상자를 포함한 총 TMEM182 rs141764639 C 대립형질인 대상자들은 LDL 입자 크기가 작고, 트리글리세라이드 수치가 높으며, HDL-콜레스테롤 수준이 낮았다. LDL 입자 크기가 작고 TMEM182 rs141764639 C 대립형질인 복부비만의 경우 당뇨병과 관상 동맥 심장 질환이 야기될 수 있다.

결론적으로, 상기 결과는 TMEM182 rs141764639 유전자형은 TNF-α와 상호 작용하여 한국인의 복부비만 발생률에 영향을 줄 수 있음을 시사한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (7)

1. (a) 대상체(subject)에서 분리된 생물학적 시료를 제공하는 단계; 및
   (b) 상기 생물학적 시료에서 TMEM182(transmembrane protein 182) rs141764639의 유전적 다형성(polymorphism)을 판단하는 단계;를 포함하는 복부비만의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 (b) 단계에서 상기 TMEM182 rs141764639 부위의 유전자형이 TC인 경우 상기 대상체의 복부비만 위험도가 높은 것으로 판단하는 복부비만의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법.
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   (c) 상기 대상체의 TNF-α의 수준을 더 측정하는 단계;를 더 포함하는 방법
5. 제4항에 있어서,
   상기 (c) 단계에서 상기 TNF-α의 수준이 높은 경우 복부비만 위험도가 높은 것으로 판단하는 방법.
6. 제1항에 있어서,
   상기 TMEM182 rs141764639 부위의 TC 유전자형이 산화-LDL(ox-LDL)의 수준을 증가시키고, LDL 입자 크기를 감소시키는 복부비만의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법.
7. TMEM182 rs141764639 위의 C 대립 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 복부비만 발병 위험도 진단용 키트.
   

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