KR102114746B1

KR102114746B1 - 유전적 위험 점수를 이용한 비만 예후 또는 위험도를 평가하는 방법 및 키트

Info

Publication number: KR102114746B1
Application number: KR1020180150688A
Authority: KR
Inventors: 이종호; 김민주; 유혜진
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2018-11-29
Filing date: 2018-11-29
Publication date: 2020-05-25

Abstract

본 발명은 특정 바이오마커에 기반하여 비만의 위험도를 평가하는 방법에 관한 것으로, (a) 대상체(subject)의 생물학적 시료를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 생물학적 시료에서 rs591120, rs1421085, rs4962426 및 rs10159486으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)을 판단하는 단계;를 포함하는 비만의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법이 제공된다.

Description

유전적 위험 점수를 이용한 비만 예후 또는 위험도를 평가하는 방법 및 키트{A METHOD AND KIT FOR ASSESSING RISK OF OBESITY USING GENETIC RISK SCORE}

본 발명은 특정 바이오마커에 기반하여 비만 관련 위험도를 평가하는 방법에 관한 것이다.

비만은 그 발생률이 세계적으로 해마다 빠르게 증가하고 있다. 비만은 당뇨병, 심혈관 질환, 간 질환 및 신장 질환에 대한 위험 인자로 인식되고 있다.

관련 위험을 줄이기 위해서 체중 증가의 원인(예를 들어 생활방식 및 습관)을 조사하는 것이 필요하다.

체지방이 건강에 유해한 영향을 미칠 정도로 과도하게 축적된 상태를 비만이라고 한다.

체지방 분포 위치는 비만으로 인한 사망률과 이환율의 주요 결정 요인이다. 한국인의 경우 체지방 비대증과 복부비만의 빈도가 평행하게 증가한다. 복부비만은 복부에 과도하게 지방이 축적된 상태를 말하며, 특히, 체내 장기를 둘러싸고 있는 체강 내에 지방이 축적되는 내장비만을 복부비만과 같은 용어로 사용한다.

복부비만은 심혈관 질환 및 대사 증후군의 발병 기전에 필수적인 역할을 하는 인슐린 저항성, 이상지질혈증 및 조직적 염증과 관련이 있으며, 비만도가 높아질수록 당뇨병, 담석증, 복부비만, 심장 질환 및 뇌졸중을 포함하는 심혈관 질환 및 대사 증후군의 유병률이 증가할 수 있다.

복부비만의 원인은 음주, 흡연 및 운동 부족과 같은 문화적 요인과, 과다한 열량 섭취 또는 고지방 식이로 인한 식이 환경적 요인, 및 유전적 요인이 있다.

복부비만을 진단하는 방법은 체질량 지수(BMI), 체지방률, 허리 둘레 및 허리 엉덩이 비율 등 다양한 척도가 있다. 그러나 이러한 진단 방법은 한정된 신체적 특성에만 의존하는 진단 방법이기 때문에 이들 척도만으로는 복부비만을 정확히 진단하는데 어려움이 있다.

따라서 복부비만을 일으키는 생물학적 메커니즘을 기반으로 하여 복부비만의 위험도를 평가하는데 사용될 수 있는 바이오마커를 발굴하고, 이를 이용하여 복부비만의 위험도를 평가하는 방법을 개발할 필요가 있다.

바이오마커는 일반적으로 단백질이나 DNA, RNA, 대사물질 등을 이용해 몸 안의 변화를 알아낼 수 있는 지표를 의미하며, 바이오마커를 활용하면 대상체의 정상 또는 병리적인 상태, 약물에 대한 반응 정도 등을 객관적으로 측정할 수 있다.

바이오마커는 특정 질병의 내적 표현형이라고 불리며, 특정 질병의 원인을 찾거나 발병 위험도를 측정하는데 이용될 수 있다.

한편, 전장유전체연관분석연구(genome-wide association study; GWAS)를 기반으로 구축된 유전자 위험 점수(genetic risk score, GRS)는 유전자 수준에서 질병의 위험도를 측정하는 효율적인 방법이다.

GWAS로부터 유래한 유전적 점수(genetic scores)의 예측값은 유전자형 빈도, 표현형 효과 크기(phenotypic effect size) 및 질병 발생의 민족 특이적 결정 요인들에 의해 영향을 받는다.

특히, 추가적인 다중 SNP 유전적 위험 점수(multi-SNP genetic risk score)의 개발이 독립적인 민족 집단 간 복잡한 질병 예측 및 예방에 대한 이해를 더욱 촉진할 것이다.

본 발명자들은 기존의 비만 진단방법을 보완하고자, 인슐린 저항성과 관련된 4 개의 SNP를 선별하고 유전적 위험 점수(GRS)를 계산하여 비만 위험도 진단 방법을 구축하였다. 또한, 구축된 방법을 통해 비만 예후 진단 가능성을 시험하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 비만과 연관된 단일염기다형성을 검출하고 이를 통해 비만의 위험성 또는 예후를 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, (a) 대상체(subject)의 생물학적 시료를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 생물학적 시료에서 rs591120, rs1421085, rs4962426 및 rs10159486으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)을 판단하는 단계;를 포함하는 비만의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법이 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 rs591120의 유전자형이 “”인 경우, 상기 rs1421085의 유전자형이 “”인 경우, 상기 rs4962426의 유전자형이 “”인 경우, 상기 rs10159486의 유전자형이 “”인 경우 비만 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다.

일 실시예에 있어서, rs591120, rs1421085, rs4962426 및 rs10159486으로 이루어진 군의 유전자 위험 점수(Genetic Risk Score, GRS)를 산출할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 생물학적 시료는 혈액 또는 소변일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, rs591120, rs1421085, rs4962426 및 rs10159486으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단일염기다형성(SNP) 마커 좌위에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 비만 발병 위험도 진단용 키트가 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 정량장치는 크로마토그래피 및 질량분석기일 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 특정 유전자의 다형성(polymorphism)에 기반하여 비만의 발병 가능성을 효과적으로 예측할 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정한 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

이하에서는 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고서에 기술되어 있다.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.

본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 또한, 달리 지시된 바가 없으면, 핵산은 각각 왼쪽에서 오른쪽, 5'에서 3' 방향으로 씌여지고, 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽, 아미노에서 카르복실 방향으로 씌여진다. 이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

상기 대상체(subject)는 진단 대상으로서 인간일 수 있고, 상기 생물학적 시료는 비만의 위험성을 평가하고자 하는 상기 대상체에서 분리된 시료로서, 조직, 세포, 혈액, 혈장, 복막액, 활막액, 타액, 소변, 대변 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게 상기 생물학적 시료는 혈액 또는 소변일 수 있다.

이 때, 상기 대상체는 인슐린 저항성(HOMA-IR)이 높은 환자일 수 있다.

상기 인슐린 저항성은 일반적으로 체내 세포가 포도당 섭취, 대사 또는 저장에 대한 내성을 포함하여 인슐린에 대한 감수성을 상실함을 의미한다.

또한, 비만에서의 인슐린 저항성은 지방세포 및 골격근에서 인슐린-자극 포도당 수송과 대사가 감소하고, 간의 포도당 생산 억제 활성이 제 기능을 못하는 것으로 나타난다.

비만은 여러 만성 질환 및 대사성 합병증의 발병 기전과 연관된 만성 경도 염증과 관련될 수 있다.

지방세포는 염증성 사이토카인을 분비하고 염증은 insulin receptor substrate-1 및 PPAR(peroxisome proliferator-activated receptor) γ 기능 억제를 비롯한 여러 메커니즘을 통해 지방세포 및 간세포에서 인슐린 신호 활성을 억제한다.

본 발명에서는 비만 GRS가 증가할수록 HOMA-IR이 증가하는 경향이 확인되었다. 또한 교란 요인을 보정 한 후에도 GRS 및 HOMA-IR간에 유의한 관계가 나타났다.

상기 결과는 인슐린 저항성이 한국인 비만 관련 감수성 SNP 유전자좌(Gene locus)로 구성된 비만 GRS에 영향을 줄 수 있음을 시사한다.

또한, 허리둘레와 같은 복부지방의 측정이 비만 관련 유전자형과 HOMA-IR 지수 사이의 관계를 변화시킬 수 있음을 확인하였다. 내장 지방세포로 구성된 복부지방은 지방 형성 및 지방 분해 활성이 높으며, 이들의 축적은 문맥 순환에서 유리 지방산의 농도를 증가시킬 수 있다.

과도한 양의 순환 유리 지방산(circulating free fatty acid)은 지질 합성 및 포도당생합성의 증가로 이어질 수 있으므로, 고지혈증, 포도당 불내성 및 죽상동맥경화증(atherosclerosis)을 유발할 수 있다.

이는 비만 관련 유전자형 집합과 복부지방이 제 2 형 당뇨병 위험과 함께 IR 위험을 결정하는데 보완적이고 시너지 효과가 있음을 시사한다.

내장 지방세포는 염증성 사이토카인뿐만 아니라 렙틴 및 아디포넥틴과 같은 지방 특이적인 사이토카인을 분비한다.

지방 조직에 의해 풍부하게 생산되고 분비되는 아디포카인(adipokine)으로 알려진 아디포넥틴(adiponectin)은 에너지 대사에 중요한 역할을 한다. 상기 아디포넥틴의 농도는 비만에서 감소하고 체중 감소 후에 증가한다. 또한 상기 아디포넥틴은 BMI와 포도당, 인슐린 및 트리글리세라이드 수준; 인슐린 저항성 정도; 특히 내장 지방 축적에서 상관 관계가 있다.

본 발명에서는 아디포넥틴이 비만 GRS와 BMI 및 HOMA-IR 지수와 반비례 관계에 있음을 확인하였다.

또한, 비만 GRS와 아디포넥틴 농도의 유의적인 연관성은 교란 인자 보정 후 나타났으며, 이는 비만에 대한 유전적 소인이 한국인의 인슐린 저항성뿐만 아니라 아디포넥틴 농도에도 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.

반면, 복부지방은 유전적 영향을 크게 변화시키지 않았다.

상기 “단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)”은 게놈에서 단일염기(A, T, C 또는 G)가 종의 멤버들 간 또는 한 개체(individual)의 쌍 염색체 간 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다.

예컨대, 서로 다른 개체의 세 개의 DNA 단편들(예: AAGT[A/A]AG, AAGT[A/G]AG, AAGT[G/G]AG)과 같이 단일염기에서 차이가 있을 때, 이를 두 개의 대립유전자(C 또는 T)라고 부르며 대다수의 SNP는 두 개의 대립유전자를 포함한다.

상기 단일염기다형성(SNP)은 한 집단(population)내에서 소수 대립인자 빈도(minor allele frequency, MAF; 특정 집단에서 발견되는 유전자좌에서 가장 낮은 대립인자 빈도)로 할당될 수 있다.

인간 집단 내에서 일부 변이성(variations)이 존재하며, 지질학적 또는 민족적 군에서 공통적인 하나의 SNP 대립유전자는 매우 희귀하다. 상기 단일염기는 폴리뉴클레오타이드 서열에 변화(대체), 제거(결실) 또는 첨가(삽입)될 수 있으므로, 번역 프레임의 변화를 유발할 수 있다.

상기 단일염기다형성은 유전자 코딩 서열, 유전자의 비-코딩 부위 또는 유전자 사이의 내부 지역(intergenic regions)에 포함될 수 있다. 유전자 코딩 서열 내의 SNP는 유전암호의 중복성(degeneracy)으로 인해 반드시 타겟 단백질의 아미노산 서열의 변화를 수반하는 것은 아니다. 동일한 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP는 동의적(synonymous)이라 하고, 다른 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP는 비-동의적(non-synonymous)이라고 한다.

상기 비-동의적 SNP는 미스센스 또는 넌센스일 수 있으며, 상기 미스센스 변화는 다른 아미노산을 발생시킬 수 있고 상기 넌센스 변화는 비성숙 종결코돈을 형성할 수 있다. 단백질-코딩 부위가 아닌 곳에 존재하는 SNP는 유전자 사일런싱, 전사인자 결합 또는 비-코딩 RNA 서열을 유발시킬 수 있다.

인간의 DNA 서열 상의 변이는 질병의 발병 또는 병원체, 화학물질, 약물, 백신 및 다른 시약에 대한 인체의 반응에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 상기 SNP는 맞춤형 의약의 중요한 도구(key enabler)로 활용될 수 있다.

특히, 상기 SNP는 질병군 또는 비질병군 간의 게놈 부위를 비교하는 방식으로 질병을 진단하는 생의학적 연구에서 고려될 수 있다. 상기 SNP는 인간 게놈의 가장 많은 변이이며, 1.9 kb 당 하나의 SNP 비율로 존재하는 것으로 추측되고 있다(Sachidanandam et al., 2001). 상기 SNP는 매우 안정된 유전적 마커이고, 표현형에 직접적인 영향을 미칠 수 있으며, 자동화된 유전자형 규명 시스템에 매우 적합하다(Landegren et al., 1998; Isaksson et al., 2000).

상기 단일염기다형성의 유무로 유전자 위험 점수(Genetic Risk Score, GRS)를 계산할 수 있다. 상기 유전자 위험 점수(Genetic Risk Score, GRS)는 각 SNP 좌위에 존재하는 위험 대립유전자의 수를 세부점수로 부여하고 그 세부 점수의 총합으로 계산될 수 있다.

일 실시예에서, 각 SNP 좌위마다 0, 1 또는 2중 하나의 세부 점수를 부여할 수 있으며, 위험 대립유전형이 부재한 경우에는 0, 위험 대립유전형이 한 개의 반수체에만 존재하는 경우에는 1, 위험 대립유전형이 두 개의 반수체에 모두 존재하는 경우에는 2의 값을 부여할 수 있다.

상기 위험 대립유전형이 SNP에서 발견되면, 비만 발병 위험도가 높은 것으로 판단된다. 예컨대, rs591120의 경우, 위험 대립 유전자형은 “C”이다.

즉, 상기 rs591120의 유전자형이 “C”인 경우, 상기 rs1421085의 유전자형이 “C”인 경우, 상기 rs4962426의 유전자형이 “G”인 경우, 상기 rs10159486의 유전자형이 “G”인 경우 비만 위험도가 높은 것으로 판단할 수 있다.

상기 프라이머(primer)는 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 포함하는 짧은 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능할 수 있다.

상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있으며, 표적 미생물에 존재하는 핵산과 혼성화되어 상기 표적 미생물의 특정 유전자를 증폭하는데 사용될 수 있다.

상기 프라이머는 증폭의 효율을 고려하여 바람직하게는 단쇄일 수 있으며, 디옥시리보뉴클레오타이드(Deoxyribonucleotide)일 수 있다. 상기 프라이머는 자연 발생(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 발생 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

또한, 상기 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 상기 프라이머는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산(PNA)(M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

상기 프라이머는 타겟 핵산에 어닐링 되어 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 타겟 핵산에 상보적인 서열을 형성하는 연장 프라이머(extension primer)일 수 있으며, 고정화 프로브가 어닐링 되어 있는 위치까지 연장되어 프로브가 어닐링 되어 있는 부위를 차지할 수 있다.

상기 연장 프라이머는 타겟 핵산의 특정 위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 상기 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 “실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함할 수 있다.

상기 프라이머는 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길 수 있다. 상기 프라이머의 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정될 수 있고 일반적으로 15 내지 30개의 뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 상대적으로 낮은 온도가 요구될 수 있다.

상기 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성할 수 있다.

상기 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다.

상기 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함할 수 있다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, ChemicalReviews, 90:543-584(1990)).

상기 특정 서열을 규명하는 것은 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예컨대, 형광 핵산 혼성화(FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석(Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동(DGGE, Wartell et al., Nucl.AcidsRes., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질(예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법(Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 및 대립형-특이 PCR이 사용될 수 있다.

서열변화가 단일-가닥 분자내 염기 결합의 차이를 초래하여 이동성이 다른 밴드가 형성될 수 있으며, 상기 SSCA는 상기 밴드를 검출할 수 있다. 상기 DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 상이한 이동성을 나타내는 서열을 검출할 수 있다.

다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 SNP들을 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용할 수 있다.

상기 RNase 보호 분석에서, 상기 SNP들을 포함하는 서열에 상보적인 리보프로브가 이용될 수 있다. 상기 분석에서 상기 리보프로브와 인간으로부터 분리한 DNA 또는 mRNA를 혼성화시키고, 미스매치를 검출할 수 있는 RNase A 효소로 절단할 수 있다. 만일, 미스매치가 있어 RNase A가 인식을 한 경우 상대적으로 작은 밴드가 관찰될 수 있다.

상기 혼성화 시그널을 이용하는 분석에서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용될 수 있다. 상기 분석에서 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 당뇨병 또는 대사 증후군 여부를 결정할 수 있다.

상기 “프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미할 수 있다. 상기 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥일 수 있고, 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드일 수 있다.

상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 상기 프로브로서 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다.

상기 프로브는 상기 SNP를 포함하는 10 내지 30개의 연속 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 포함할 수 있다.

일반적으로, 상기 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열 일치에 의해 결정될 수 있으므로, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 상기 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다.

혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., MolecularCloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic AcidHybridization, A PracticalApproach, IRL Press, Washington, D.C.(1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 상기 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 상기 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 상이하게 결정될 수 있다.

상기 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 대상체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것(예컨대, 대사 이상 또는 비만의 동정), 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)를 포함할 수 있다.

상기 유전적 다형성(polymorphism)은 마이크로어레이 또는 유전자 증폭에 의해 식별될 수 있다.

상기 “증폭”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미할 수 있다. 다양한 증폭 반응이 당업계에 알려져 있으며, 예컨대 상기 증폭 반응은 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, MolecularCloning. A LaboratoryManual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self-sustained sequence replication)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오타이드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 방법은 마이크로어레이 방식으로 수행될 수도 있다. 상기 마이크로어레이는 고상표면에 고정화된 프로브를 이용할 수 있다. 상기 프로브는 상기 SNP를 포함하는 각 유전자상의 10 내지 100개의 연속 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다.

상기 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용될 수 있고 기체(substrate) 상에 고정화될 수 있다. 상기 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화될 수 있다.

상기 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시될 수 있다. 예컨대, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수도 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

상기 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화될 수 있다. 혼성화 조건은 다양하게 변경할 수 있고, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수도 있다.

상기 프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다.

상기 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labeling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methodsin Enzymology, 65:499(1986))에 의해 라벨링될 수 있다. 상기 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공할 수 있다.

상기 분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 상기 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

상기 프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킬 수 있다. 상기 적절한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 상기 절차는 연구실에서의 사용을 위한 프로토콜을 수립하고자 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시될 수 있다.

예컨대, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 상기 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)을 참조할 수 있다.

예컨대, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미할 수 있다. 또는 상기 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미할 수 있고, 저 엄격조건은 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미할 수 있다.

상기 혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출할 수 있다. 예컨대, 상기 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 상기 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다.

상기 효소 및 기질은 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl 및 pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF 기질; 글루코오스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)가 사용될 수 있다.

상기 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수도 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 기술한다.

실험방법

실험대상

한국 암 예방 연구 II(Korean Cancer Prevention Study-II, KCPS-II) 바이오뱅크에서 2004년 내지 2013년의 기간 동안 비만(BMI ≥ 25 kg/m²)으로 진단 받은 7,743명의 대상자와 건강 검진 센터(HSC)에서 2010년 내지 2015년의 기간 동안 비만으로 검진 받은 2,022명의 대상자를 선발하였으며, i) 현재 심혈관 질환, 간 질환, 신장 질환, 제1형 또는 제2형 당뇨병, 췌장염 또는 암 진단을 받았거나 기록이 있는 대상자, ii) 약물 복용자는 실험 대상에서 제외하였다.

실험에 착수하기 전에 모든 참가자들에게 실험의 목적을 상세히 설명한 후 동의서를 받았다. 수행된 실험의 프로토콜은 일산병원 및 연세대학교의 승인을 받았으며 헬싱키 선언(Helsinki Declaration)에 따라 수행되었다.

SNP 선별 및 유전자형

Affymetrix AxiomTM KORV1.0-96 어레이(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 총 9,765 개의 샘플을 유전자형으로 분류하였고 유전자형 데이터를 K-CHIP을 사용하여 제조하였다.

배열 상 총 797,528 개의 SNP와 9,765 개의 샘플 중, 품질 관리(quality control) 후, 357,026 개의 SNP와 9,688 개의 샘플이 남았고 이들은 연관 분석에 사용되었다.

복제 연구 코호트로는 품질 관리 후 357,994 개의 SNP와 7,666 개의 샘플을 포함하는 KCPS-II 대상자를 사용하였다.

유전자 위험 점수(Genetic Risk Score, GRS) 모델의 설계

비만과 밀접하게 연관된 상위 20개의 SNP를 사용하여 GRS를 구축하였다. 서로 연관 불균형(linkage disequilibrium, LD)이 있는 SNP의 경우는 제외하였다.

한국인 집단에서 일관된 효과 방향성을 보이는 SNP가 최종 GRS 구축에 사용되었으며, 위험 대립유전자의 수와 비만 상태 사이의 연관성은 로지스틱 회귀 분석을 통해 분석하였다.

유전자 위험 점수(Genetic Risk Score, GRS)는 각 β-계수에 해당 위험 대립유전자의 수(0, 1 또는 2)를 곱하여 산출하였다.

동형 비-위험성 대립유전자(homozygous of non-risk alleles)는 0, 이형 대립유전자(heterozygous of alleles)는 1, 동형 위험성 대립유전자(homozygous of the risk alleles)는 2로 계산하였다.

임상 측정

의류와 신발을 착용하지 않은 채로 아침에 실험 대상자들의 체중(kg)과 신장(m²)을 측정하고 체질량 지수(BMI)를 계산하였다.

또한, 허리 둘레, 수축기 혈압(Systolic Blood Pressure) 및 이완기 혈압(diastolic blood pressure)을 포함한 인체 계측 데이터를 수집하고 포도당, 인슐린, 중성지방, 총 콜레스테롤(TC), 고밀도 지단백 콜레스테롤(HDL), 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL), 아스파테이트아미노전달효소(aspartate aminotransferase, AST), 알라닌 아미노전달효소(alanine aminotransferase, ALT) 및 고감도 C-반응성 단백질(hs-CRP)의 농도를 자동 분석기를 사용하여 측정하였다.

인슐린 저항성(Insulin resistance, IR)을 산출하기 위해 HOMA(Homostatic Model Assessment)를 사용하였으며 HOMA-B(Beta Cell Function) 또한 계산하였다.

혈장 에디포넥틴(Plasma adiponectin) 농도는 Human Adiponectin ELISA 키트(B-Bridge International Inc., Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 흡광도 값을 기록하였다(Wallac Victor2 multilabel counter, Perkin Elmer Life Sciences, Turku, Finland).

생화학 측정은 대한 실험실 품질 관리 위원회가 요구하는 내/외부 품질 관리 절차에 따라 수행하였다.

통계 분석

통계적 분석은 SPSS v. 24.0(IBM, Chicago, IL, USA)을 이용하여 수행하였다.

왜곡된 변수들은 통계적 분석을 위하여 대수적으로(logarithmically) 변형하였다. 결과값은 평균±표준오차(S.E.)로 표현하였으며, 양측 P-검정값(two-tailed P-value)<0.05를 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

두 그룹을 비교하기 위해서 독립 t-검정을 이용하고, GRS에 의해 분류된 세 그룹 간의 차이를 비교하기 위해 일원배치 분산분석을 수행하였다.

대립유전자의 빈도는 카이 제곱(χ²) 테스트로 평가하고, 로지스틱 회귀분석을 통해 교차비(OR) 및 95% 신뢰 구간(CI)을 계산하였다.

교란 요인을 보정하기 위해 일반 선형 UNIANOVA를 수행하였다.

실험결과

한국인에서 유의성(p<0.05)과 동일한 방향성에 기초하여 15개의 SNP 를 선택하여 GRS를 구성하였다(표 1).

Chr	SNP	인근 유전자	위험 대립 유전자	EAF (대상/대조군)	무보정		나이 및 성별 보정
Chr	SNP	인근 유전자	위험 대립 유전자	EAF (대상/대조군)	p -값	OR (95% CI)	p -값	OR (95% CI)
1	rs516636	LOC101928778, SEC16B	A/C	0.265/0.238	0.000021	1.157(1.082-1.238)	0.000021	1.161(1.084-1.243)
1	rs591120	SEC16B	C/G	0.458/0.420	3.70E-07	1.167(1.099-1.238)	2.53E-07	1.172(1.104-1.245)
16	rs1421085	FTO	C/T	0.140/0.119	0.000034	1.201(1.101-1.310)	0.000008	1.222(1.119-1.335)
1	rs9203	TMEM222	G/A	0.393/0.365	0.000097	1.127(1.061-1.197)	0.000024	1.142(1.074-1.214)
4	rs7697339	TMPRSS11A	A/G	0.938/0.921	0.000007	1.309(1.163-1.472)	0.000005	1.320(1.172-1.488)
8	rs2108124	DLGAP2	C/T	0.568/0.535	0.000011	1.140(1.075-1.209)	0.000009	1.145(1.079-1.215)
10	rs17134592	AKR1C4	G/C	0.097/0.079	0.000039	1.240(1.119-1.374)	0.000026	1.252(1.127-1.390)
10	rs4962426	CTBP2, TEX36-AS1	G/T	0.292/0.264	0.000028	1.150(1.077-1.228)	0.000012	1.160(1.085-1.239)
10	rs10159486	C10orf90, DOCK1	G/T	0.548/0.515	0.000014	1.139(1.074-1.208)	0.000005	1.149(1.083-1.220)
13	rs6490797	LINC00327	A/G	0.906/0.887	0.000058	1.223(1.109-1.350)	0.000017	1.245(1.127-1.376)
13	rs72646743	HS6ST3	A/G	0.958/0.945	0.000111	1.319(1.146-1.518)	0.000023	1.360(1.179-1.568)
13	rs2127779	FARP1	G/A	0.531/0.498	0.000011	1.142(1.077-1.212)	0.000022	1.140(1.073-1.211)
14	rs2130179	LOC105370478, LOC105370479	C/T	0.821/0.797	0.000049	1.170(1.085-1.262)	0.00002	1.182(1.095-1.277)
15	rs2303580	NEDD4	T/C	0.588/0.555	0.000013	1.141(1.075-1.210)	0.000028	1.137(1.071-1.208)
16	rs16974231	COTL1	G/A	0.259/0.232	0.000037	1.153(1.078-1.234)	0.000027	1.159(1.082-1.241)
-	GRS3	-	-	-	9.82E^-13	2.097(1.711-2.570)	3.34E^-13	2.158(1.754-2.655)
-	GRS11	-	-	-	1.64E^-41	2.682(2.324-3.096)	2.44E^-43	2.798(2.418-3.239)
-	GRS14	-	-	-	6.39E^-50	2.456(2.181-2.765)	4.09E^-52	2.553(2.262-2.882)
-	GRS4	-	-	-	1.66E^-20	2.715(2.199-3.352)	8.07E^-22	2.865(2.311-3.551)

표 1을 참조하면, SNP 1 내지 3은 이전에 비만 관련 유전자좌로 알려졌으며, SNP 4 내지 15는 새롭게 비만 관련 유전자좌인 것으로 확인되었다.

GRS3은 SNP 1 내지 3을 포함하여 계산하였으며, GRS11은 SNP 11(rs72646743)이 일관되지 않은 방향을 보였으므로, SNP 4 내지 10 및 12 내지 15를 포함하여 계산하였다. GRS14는 SNP 1 내지 10 및 12 내지 15 를, GRS4는 SNP 1, 2, 5 및 8을 포함하여 계산하였다.

나이 및 성별을 보정한 후 GRS11에서 비만 위험도와 유의한 관련(OR = 2.798, 95 % CI = 2.418-3.239)이 있었다.

한편, GRS4는 나이 및 성별을 보정한 후 2.865(95 % CI = 2.311-3.551)의 OR로 비만 위험도와 가장 높은 연관성을 보였다

복제 대상자에서 SNP 위치와 비만의 연관성

복제 대상자에서 유의성(p<0.05)과 동일한 방향성에 기초하여 14개의 SNP 를 선택하여 GRS를 구성하였다(표 2).

Chr	SNP	인근 유전자	위험 대립 유전자	EAF (대상/대조군)	무보정		나이 및 성별 보정
Chr	SNP	인근 유전자	위험 대립 유전자	EAF (대상/대조군)	p -값	OR (95% CI)	p -값	OR (95% CI)
1	rs591120	SEC16B	C/G	0.457/0.422	0.000027	1.153(1.079-1.233)	0.000016	1.162(1.085-1.244)
16	rs1421085	FTO	C/T	0.140/0.118	8.30E^-05	1.217(1.104-1.342)	2.00E^-05	1.244(1.125-1.376)
3	rs13075905	TBC1D5, LOC339862	A/G	0.947/0.928	0.000003	1.400(1.215-1.613)	0.000004	1.406(1.216-1.625)
6	rs1886674	C6orf118, QKI	C/T	0.133/0.110	0.000054	1.232(1.113-1.363)	0.000009	1.266(1.140-1.405)
10	rs4962426	CTBP2, TEX36-AS1	G/T	0.293/0.261	0.000027	1.171(1.088-1.261)	0.000011	1.185(1.099-1.278)
5	rs2269290	EDIL3	T/C	0.285/0.254	0.000045	1.166(1.083-1.256)	0.000015	1.182(1.096-1.276)
10	rs10741175	MGMT, LINC01163	G/A	0.864/0.839	0.00006	1.211(1.103-1.330)	0.000016	1.235(1.122-1.359)
10	rs10159486	C10orf90, DOCK1	G/T	0.548/0.513	0.000033	1.151(1.077-1.230)	0.000023	1.158(1.082-1.240)
17	rs12937910	CASC17, KCNJ2	C/T	0.216/0.189	0.00006	1.182(1.090-1.283)	0.000024	1.198(1.102-1.303)
7	rs6942830	CPA4	C/T	0.491/0.457	0.000037	1.150(1.076-1.230)	0.000025	1.158(1.082-1.240)
2	rs3096734	ICOS, PARD3B	C/T	0.834/0.805	0.000012	1.215(1.114-1.327)	0.000026	1.213(1.108-1.326)
2	rs979375	SLC4A10, AHCTF1P1	T/G	0.369/0.339	0.000171	1.142(1.066-1.224)	0.000027	1.164(1.085-1.250)
17	rs12453398	WSCD1	T/C	0.788/0.759	0.000066	1.176(1.086-1.274)	0.000033	1.189(1.096-1.290)
13	rs4619288	PCDH17, LOC101926897	T/C	0.710/0.681	0.000149	1.149(1.069-1.235)	0.000034	1.168(1.085-1.257)
-	GRS2	-	-	-	1.25E^-09	2.774(1.996-3.856)	2.56E^-10	2.977(2.123-4.174)
-	GRS10	-	-	-	1.08E^-37	2.780(2.378-3.249)	8.18E^-40	2.942(2.507-3.453)
-	GRS12	-	-	-	9.35E^-43	2.691(2.335-3.100)	2.02E^-45	2.851(2.466-3.297)
-	GRS4	-	-	-	1.44E^-17	2.720(2.162-3.424)	1.90E^-18	2.873(2.269-3.638)

GRS2는 SNP 1 및 2를 포함하여 계산하였으며, GRS10은 SNP 6(rs2269290) 및 SNP 9(rs12937910)가 일관되지 않은 방향을 보였으므로, SNP 3 내지 5, 7, 8 및 10 내지 14를 포함하여 계산하였고, GRS12는 SNP 3 내지 14를, GRS4는 SNP 1, 2, 5 및 8을 포함하여 계산하였다.

표 2를 참조하면, 나이 및 성별을 보정한 후, GRS2가 비만 위험도와 가장 관련이 있었지만(OR = 2.977, 95 % CI = 2.123-4.174), GRS10 또한 비만 위험도와 유의한 관련이 있었다(OR = 2.942, 95 % CI = 2.507-3.453).

한편, GRS4는 나이와 성별을 보정한 후 2.873(95% CI = 2.269-3.638)의 OR로 GRS2 또는 GRS10보다 낮은 OR 값을 보였다.

임상 특징 및 비만에 대한 GRS 분석

실험 대상자는 GRS에 의해 세 그룹으로 분류하였다.

구체적으로, 상기 GRS 값이 0.3020 이하인 경우 T1, GRS 값이 0.3020 초과 0.4380 이하인 경우 T2, GRS 값이 0.4380 초과인 경우 T3로 분류하였다(표 3).

구분	T1	T2	T3	p -값
대상자 수	3,085	3,228	3,130
성별(남성)	1,888	2,006	1,895	0.592
연령(년)	46.6±0.20	46.5±0.19	46.5±0.20	0.764
BMI(kg/m²)	23.8±0.05	23.9±0.05	24.4±0.06	<0.001
허리둘레(cm)	82.2±0.16	82.7±0.16	83.5±0.17	<0.001
수축기 혈압(mmHg)	120.1±0.28	120.7±0.57	121.1±0.27	0.011
이완기 혈압(mmHg)	75.3±0.19	75.7±0.19	76.0±0.19	0.009
공복혈당(mg/dL) ^§	94.4±0.39	93.8±0.37	94.8±0.39	0.329
인슐린(μIU/dL) ^§	5.39±0.08	5.59±0.09	5.72±0.09	0.001
HOMA-IR ^§	1.28±0.02	1.32±0.03	1.38±0.03	0.001
HOMA-B(%) ^§	77.7±1.87	77.6±3.03	81.9±2.84	0.023
중성지방(mg/dL) ^§	138.5±1.60	142.2±1.71	143.9±1.69	0.024
총 콜레스테롤(mg/dL) ^§	193.1±0.63	193.1±0.60	194.6±0.63	0.075
HDL 콜레스테롤(mg/dL) ^§	51.3±0.20	50.9±0.20	50.8±0.20	0.123
LDL 콜레스테롤(mg/dL) ^§	116.4±0.58	115.8±0.56	117.5±0.60	0.298
C-반응성 단백 시험(mg/L) ^§	0.79±0.06	0.80±0.05	0.80±0.08	0.195
아디포넥틴(ng/mL) ^§	7.29±0.08	7.02±0.08	6.96±0.08	0.005
AST(IU/L) ^§	25.0±0.63	24.0±0.20	24.3±0.22	0.655
ALT(IU/L) ^§	25.8±0.44	25.6±0.34	26.3±0.40	0.034

각 값들은 평균±표준오차로 나타내었다; ∮은 로그 변환으로 검사한 값이다. P-값은 세 그룹에서 일대일 ANOVA(one-way ANOVA)에서 파생되었다. p<0.05를 나타내는 문자는 Bonferroni post hoc test에서 유래되었다. 유의한 차이가 없는 비교는 동일한 문자로 표시하고, 유의한 차이는 다른 문자로 표시하였다.

GRS 값이 증가할수록 BMI, 허리둘레, 수축기/이완기 혈압, HOMA-IR, HOMA-B, 인슐린, 중성지방 및 ALT 수준이 증가하였으나, 아디포넥틴 수치는 감소하였다.

비만 GRS와 공복혈당, 인슐린, HOMA-IR, HOMA-B(인슐린 분비) 및 아디포넥틴과의 관계를 하기 표 4에 나타내었다.

구분	모델 1		모델 2		모델 3
구분	Beta	p	Beta	p	Beta	p
공복혈당(mg/dL) ^§	0.007	0.484	0.004	0.746	0.001	0.916
인슐린(μIU/dL) ^§	0.034	0.002	0.027	0.017	0.025	0.034
HOMA-IR ^§	0.034	0.002	0.027	0.019	0.025	0.038
HOMA-B(%) ^§	0.026	0.019	0.022	0.051	0.020	0.080
아디포넥틴(ng/mL) ^§	-0.025	0.023	-0.028	0.017	-0.027	0.028

상기 표 4의 Beta는 표준화된 Beta이고, 모델 1은 보정없이, 모델 2는 성별, 연령, 수축기 혈압 및 이완기 혈압을 보정, 모델 3은 성별, 연령, 수축기 혈압, 이완기 혈압, 중성 지방, TC, HDL 및 LDL을 보정하여 분류하였다.

모델 1에서 비만 GRS와 인슐린(β = 0.034, p = 0.002), HOMA-IR(β= 0.034, p = 0.002) 및 HOMA-B(β= 0.026, p = 0.019) 및 아디포넥틴(-0.025, p = 0.023)은 유의한 연관성이 보였다.

또한, 모델 3 에서 비만 GRS와 인슐린(β= 0.025, p = 0.034), HOMA-IR(β = 0.025, p = 0.038) 및 아디포넥틴(β = -0.027, p = 0.028)은 유의한 연관성을 보였다.

한편, 보정을 추가함에 따라 비만 GRS와 HOMA-B 값의 연관성은 감소하는 경향을 보였다.

복부지방에 의해 비만 GRS와 인슐린, HOMA-IR 및 아디포넥틴 사이의 관계를 성별, 연령, 수축기 혈압, 이완기 혈압, 중성지방, 총콜레스테롤, HDL 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤을 보정하여 하기 표 5에 나타내었다.

구분	분류	Beta	S.E.	P for trend	P for interaction
인슐린
허리둘레(cm)	남성< 90, 여성< 85	0.003	0.016	0.318	<0.001
허리둘레(cm)	남성≥ 90, 여성≥ 85	0.037	0.029	0.071	<0.001
HOMA-IR
허리둘레(cm)	남성< 90, 여성< 85	0.001	0.015	0.395	<0.001
허리둘레(cm)	남성≥ 90, 여성≥ 85	0.044	0.027	0.047	<0.001
아디포넥틴
허리둘레(cm)	남성< 90, 여성< 85	-0.026	0.020	0.079	<0.001
허리둘레(cm)	남성≥ 90, 여성≥ 85	-0.016	0.033	0.246	<0.001

허리 둘레는 인슐린, HOMA-IR 및 아디포넥틴에 대한 비만 GRS와 유의한 상호 작용을 보였다(p<0.001).

HOMA-IR은 복부비만 환자(남성≥ 90, 여성≥ 85, p-trend = 0.047)에서 비만 GRS와 관련하여 유일하게 중요한 요소로 나타났다.

또한, 비만 GRS와 인슐린은 복부비만 환자(p-trend = 0.071)와 연관성이 있는 것으로 나타났으나, 아디포넥틴은 허리둘레가 더 낮은 환자들(남성< 90, 여성< 85)에서 비만 GRS와 관련되었다(p-trend = 0.079).

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

(a) 대상체(subject)의 생물학적 시료를 제공하는 단계; 및
(b) 상기 생물학적 시료에서 rs591120, rs1421085, rs4962426 및 rs10159486의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)을 판단하는 단계;를 포함하는 비만의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법으로서,
상기 (b) 단계에서 rs591120, rs1421085, rs4962426 및 rs10159486으로 이루어진 군의 유전자 위험 점수(Genetic Risk Score, GRS)를 산출하는 비만의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 상기 rs591120의 유전자형이 “C”인 경우, 상기 rs1421085의 유전자형이 “C”인 경우, 상기 rs4962426의 유전자형이 “G”인 경우, 상기 rs10159486의 유전자형이 “G”인 경우 비만 위험도가 높은 것으로 판단하는 비만의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 혈액 또는 소변인 비만의 예후 또는 위험도를 평가하는 방법.
rs591120, rs1421085, rs4962426 및 rs10159486의 단일염기다형성(SNP) 마커 좌위에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 비만 발병 위험도 진단용 키트.
제5항에 있어서,
상기 rs591120의 유전자형이 “C”인 경우, 상기 rs1421085의 유전자형이 “C”인 경우, 상기 rs4962426의 유전자형이 “G”인 경우, 상기 rs10159486의 유전자형이 “G”인 경우 비만 발병 위험도가 높은 것으로 판단하는 비만 발병 위험도 진단용 키트.
제6항에 있어서,
상기 진단용 키트는 크로마토그래피 및 질량분석기를 정량장치로 하는 진단용 키트.