CN103282515A - 用于检测人表皮生长因子受体基因中的突变的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明包含用于检测人EGFR基因中导致癌症的突变的试剂和方法。此外，公开了检测所述突变的方法和治疗方法。

Description

用于检测人表皮生长因子受体基因中的突变的方法和组合物
技术领域
本发明涉及癌症诊断学和癌症治疗的伴随诊断学。具体而言，本发明涉及可用于诊断和预后以及预测癌症治疗有效性的突变检测。
背景技术
表皮生长因子受体(EGFR)，也公知为HER-1或Erb-B1，是生长因子受体的1类酪氨酸激酶家族的成员。这些膜结合的蛋白具有与包括Ras/MAPK、PI3K和AKT途径在内的多种信号转导途径相互作用的胞内酪氨酸激酶结构域。通过这些途径，HER家族蛋白调节细胞增殖、分化和存活。
已显示某些癌症在EGFR激酶结构域(外显子18－21)中包含突变(Pao等(2004). "EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from "never smokers" and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib", P.N.A.S. 101 (36): 13306–13311; Sordella等(2004), "Gefitinib-sensitizing EGFR mutations in lung cancer activate anti-apoptotic pathways", Science 305 (5687): 1163–1167.)。
已开发了靶向EGFR的疗法。例如，西妥昔单抗(cetuximab (ERBITUX™))和帕尼单抗(panitumumab (VECTIBIX™))是抗EGFR抗体。厄洛替尼(Erlotinib (TARCEVA™))和吉非替尼(gefitinib (IRESSA™))是用作EGFR酪氨酸激酶的口服活性选择性抑制剂的喹唑啉类。这些药物在具有突变的EGFR基因的患者中是最有效的。例如，Mok等(2009) “ Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma", N Eng J Med 361:947-957)显示了在患有EGFR突变阳性肿瘤的患者中，相比于化学疗法，IRESSA™延长了无进展生存期(PFS)。对于EGFR未突变的肿瘤来说，相反情况是成立的：化学治疗的PFS明显比IRESSA™的更长。因此，为了改善患者成功治疗的机率，必须知道EGFR突变状态。
在癌组织中已鉴定到了许多EGFR基因中的突变。(美国专利号7,960,118；美国专利号7,294,468)。EGFR激酶结构域中的某些突变是常见的，而其它突变则很少发生。然而，重要的是EGFR突变的临床检测以足够的灵敏度靶向尽可能多的突变。这将保证具有稀有突变的患者不会接到“假阴性”的检测结果从而错过了有可能会挽救性命的治疗。挑战在于设计出能以成本有利的方式检查出尽可能多的癌症相关的EGFR突变的测定。
一种灵敏并且可以多重处理的技术是等位基因特异性PCR (AS-PCR)。该技术在存在序列的野生型变体的情况下检测核酸序列中的突变或多态性。在成功的等位基因特异性PCR中，目标核酸的所需变体得到扩增，而其它变体未进行扩增，至少不会扩增到可检测到的水平。在等位基因特异性PCR中，至少一条引物是等位基因特异性的，从而使引物延伸仅在存在序列的特异性变体时进行。在相同的反应混合物中可以存在靶向一个或多个多态位点的一条或多条等位基因特异性引物。设计成功的等位基因特异性引物是不可预知的技术。尽管对于已知序列设计引物是很平常的，但要设计出可以区分非常相似的序列的引物，却无方法可循。
在诊断测定的背景下，需要精确区分。例如，在EGFR突变检测的背景下，等位基因特异性引物的性能可以决定患者癌症治疗的进程。
已将等位基因特异性PCR用于检测EGFR基因中的突变，见美国申请号2008/0261219。然而，仍然需要能够以最大特异性和灵敏度检测最大数目的EGFR突变的全面测定。
发明概述
在一个实施方案中，本发明是在样品中检测人表皮生长因子受体(EGFR)核酸中的突变的方法，包括：将样品中的核酸与权利要求1的寡核苷酸接触；在允许寡核苷酸与EGFR核酸内的目标序列杂交的条件下孵育样品；产生包含EGFR核酸内目标序列的扩增产物；和检测扩增产物的存在，由此检测EGFR核酸中突变的存在。
在进一步的实施方案中，本发明是治疗患者的方法，所述患者具有可能包含在表皮生长因子受体(EGFR)基因中具有突变的细胞的肿瘤，所述方法包括：将患者样品中的核酸与权利要求1的寡核苷酸接触；在允许寡核苷酸与EGFR核酸内的目标序列杂交的条件下孵育样品；产生包含EGFR核酸内目标序列的扩增产物；检测扩增产物的存在，由此检测EGFR核酸中突变的存在，并且如果存在突变，向患者施用抑制由突变基因编码的突变体EGFR蛋白的信号转导的化合物。
在又进一步的实施方案中，本发明是测定用EGFR抑制剂对患有恶性肿瘤的患者的治疗是否可能成功的方法，包括：将患者样品中的核酸与权利要求1的寡核苷酸接触；在允许寡核苷酸与EGFR核酸内的目标序列杂交的条件下孵育样品；产生包含EGFR核酸内目标序列的扩增产物；检测扩增产物的存在，由此检测EGFR核酸中突变的存在，并且如果存在突变，测定治疗是可能成功的。
在进一步的实施方案中，本发明是包含一对或多对选自对(a)-(k)的寡核苷酸的试剂盒：(a) SEQ ID NOs: 2-7之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 8的寡核苷酸; (b) SEQ ID NOs: 10-15之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 16的寡核苷酸; (c) SEQ ID NOs: 18-24之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 25的寡核苷酸; (d) SEQ ID NOs: 27-29之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 30的寡核苷酸; (e) SEQ ID NOs: 32-48之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 49的寡核苷酸; (f) SEQ ID NOs: 51-57之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 58的寡核苷酸; (g) SEQ ID NOs: 60-68之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 69的寡核苷酸; (h) SEQ ID NOs: 71-79之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 80的寡核苷酸; (i) SEQ ID NOs: 82-90之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 91的寡核苷酸; (j) SEQ ID NOs: 93-101之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 102的寡核苷酸; (k) SEQ ID NOs: 104-106之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 107的寡核苷酸。
在又进一步的实施方案中，本发明是用于检测人表皮生长因子受体(EGFR)基因中的突变的反应混合物，所述反应混合物包含一对或多对选自对(a)-(k)的寡核苷酸：SEQ ID NOs: 2-7之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 8的寡核苷酸; SEQ ID NOs: 10-15之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 16的寡核苷酸; SEQ ID NOs: 18-24之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 25的寡核苷酸; SEQ ID NOs: 27-29之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 30的寡核苷酸; SEQ ID NOs: 32-48之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 49的寡核苷酸; SEQ ID NOs: 51-57之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 58的寡核苷酸; SEQ ID NOs: 60-68之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 69的寡核苷酸; SEQ ID NOs: 71-79之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 80的寡核苷酸; SEQ ID NOs: 82-90之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 91的寡核苷酸; SEQ ID NOs: 93-101之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 102的寡核苷酸; SEQ ID NOs: 104-106之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 107的寡核苷酸。
在又进一步的实施方案中，本发明是包含选自SEQ ID NOs. 2、10、18、27、32、51、60、71、82、93和104的寡核苷酸的一级序列的寡核苷酸。在另一个实施方案中，本发明是选自SEQ ID NOs. 3-7、11-15、19-24、28、29、33-48、52-57、61-68、72-79、83-90、94-101、105和106的寡核苷酸。在又另一个的实施方案中，本发明是选自SEQ ID NOs. 8、16、25、30、49、58、69、80、91、102和107的寡核苷酸。在又另一个的实施方案中，本发明是选自SEQ ID NOs. 9、17、26、31、50、59、70、81、92、103和108的寡核苷酸，任选包含可检测标记。
附图概述
图1 (A-C)显示了人EGFR基因的编码序列(SEQ ID NO: 1)。
发明详述
定义
为了便于理解本公开内容，提供了本文使用术语的以下定义。
术语“X[n]Y”指在氨基酸序列中位置[n]上氨基酸X置换为氨基酸Y的错义突变。例如，术语“G719A”指位置719的甘氨酸替换为丙氨酸的突变。
术语“等位基因特异性引物”或“AS引物”指这样的引物，所述引物与多于一个目标序列的变体杂交，但能够在目标序列的变体间区分(因为所述引物仅与变体之一杂交)，所述引物在合适条件下通过核酸聚合酶有效延伸。对于目标序列的其它变体，延伸效率更低或是无效的。
术语“通用引物”指包括等位基因特异性引物的引物对中的第二引物。通用引物不是等位基因特异性的，即无法在等位基因特异性引物可以区分的目标序列的变体间进行区分。
术语“互补的”或“互补性”参考Watson-Crick碱基配对法则涉及的多核苷酸的反向平行链使用。术语“完美互补的”或“100％互补的”指在反向平行链间所有碱基都具有Watson-Crick配对的互补序列，即，在多核苷酸双链体中任何两个碱基之间不存在错配。然而，双链体会在反向平行链之间、甚至在缺少完美互补性的反向平行链之间形成。术语“部分互补的”或“不完全互补的”指在反向平行多核苷酸链间碱基的任何比对少于100％完美的(例如，在多核苷酸双链体中存在至少一个错配或未配对的碱基)。部分互补链间的双链体通常比完美互补链间的双链体更不稳定。
术语“样品”指任何包含或假定包含核酸的组合物。这包括了从个体中分离出的组织或流体例如皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿液、泪液、血细胞、器官和肿瘤的样品，以及从个体取出的细胞建立的体外培养物的样品，包括福尔马林固定的石蜡包埋的组织(FFPET)和从其中分离的核酸。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可以互换使用。“寡核苷酸”是有时用于描述更短的多核苷酸的术语。寡核苷酸可以由对应于指定的核苷酸序列的区域的至少6个核苷酸，例如至少约10－12个核苷酸、或至少约15－30个核苷酸构成。
术语“一级序列”指多核苷酸或寡核苷酸中的核苷酸序列。核苷酸修饰如含氮碱基修饰、糖修饰或其它主链修饰不是一级序列的一部分。标记，如与寡核苷酸缀合的生色团也不是一级序列的一部分。因此，两条寡核苷酸可以共有相同的一级序列但在修饰和标记上有所不同。
术语“引物”指这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸与目标核酸中的序列杂交，并且能够在适合此类合成的条件下作为延核酸互补链合成的起始点。如本文所用，术语“探针”指与目标核酸中的序列杂交并且通常被可检测地标记的寡核苷酸。探针可以具有修饰，例如使探针无法被核酸聚合酶延伸的3'端修饰和一种或多种生色团。具有相同序列的寡核苷酸可以在一个测定中用作引物而在另一测定中用作探针。
如本文所用，术语“目标序列”、“目标核酸”或“目标”指将要扩增、检测或扩增及检测的核酸序列的一部分。
术语“杂交的”和“杂交”指导致两条核酸之间形成双链体的碱基配对相互作用。不要求两条核酸在其全长上具有100％的互补性以实现杂交。
人EGFR cDNA (SEQ ID No: 1)的编码部分显示于图1 (1A-1C) (Ensembl参考号ENST00000275493, www.ensembl.org, 见Hubbard等 (2009), Ensembl 2009, Nucl. Acids Res. 37 (增刊1): D690-D697)，其是完整EGFR cDNA序列(NCBI登录号 NM_005228.3)的一部分。一些在癌症患者中常突变的密码子以下划线和粗体显示。
等位基因特异性PCR已描述于美国专利号6,627,402。在等位基因特异性PCR中，区分引物具有与目标序列的所需变体互补但与目标序列的不需要的变体会错配的序列。通常，引物中的区分核苷酸，即仅与目标序列的一个变体匹配的核苷酸，是3'末端核苷酸。然而，引物的3'末端仅是许多特异性决定因素中的一个。等位基因特异性PCR中的特异性源自错配引物远远慢于匹配引物的延伸速率，最终降低了错配目标的相对扩增效率。降低的延伸动力学以及因此的PCR特异性受许多因素影响，包括酶的性质、反应组分和它们的浓度、延伸温度和错配的全部序列背景。这些因素对每一具体引物的影响无法可靠地定量。由于没有可靠的定量策略，但却存在大量的变量，因此等位基因特异性引物的设计是试验和误差常常具有令人惊讶的结果的问题。对于下文描述的EGFR的突变体等位基因，仅部分检测引物提供了合适性能，即，可接受的PCR效率以及同时突变体和野生型模板间的区分。
提高等位基因特异性引物特异性的一个方法是通过包括除末端错配之外的内部错配核苷酸。见于2009年10月20日提交的美国专利申请号2010/0099110。引物中的内部错配核苷酸可以与想要的和不想要的目标序列错配。由于错配使具有想要的和不想要的模板的引物-模板杂化物不稳定，因此一些错配能够阻止两种模板的扩增并且导致PCR的失败。因此，无法预测这些内部错配对具体等位基因特异性PCR引物的影响。
对于引物的成功延伸，引物需要与目标序列具有至少部分互补性。通常，引物3'末端的互补性比引物5'末端的互补性更至关重要(Innis等编辑, PCR Protocols, (1990) Academic Press, 第一章, 第9-11页)。因此，本发明包含公开于表1－7中的引物以及具有5'末端变化的这些引物的变体。
之前已描述了对于PCR扩增而言，通常可以通过使用引物中核苷酸的化学修饰来提高引物特异性。具有环外氨基的共价修饰的核苷酸以及此类核苷酸在PCR中的用途已描述于美国专利号6,001,611中。由于修饰破坏了具有想要的和不想要的模板的引物-模板杂化物中的Watson-Crick氢键键合，因此一些修饰能够阻止两种模板的扩增并且导致PCR的失败。因此，无法预测这些共价修饰对等位基因特异性PCR的影响。
在一个实施方案中，本发明是使用表1－7中公开的引物检测EGFR突变的诊断方法。本方法包括在存在对应的第二引物(任选地，也选自表1－7)、核苷三磷酸和核酸聚合酶的情况下，将核酸检测样品与一条或多条选自表1－7用于EGFR突变的等位基因特异性引物接触，从而使一条或多条等位基因特异性引物仅在样品中存在EGFR突变时有效延伸；并且通过检测延伸产物是否存在来检测EGFR突变是否存在。
在具体实施方案中，用探针检测延伸产物的存在。在该实施方案的变化中，探针选自表1－7。可以用放射性的、荧光的或生色团标记对探针进行标记。例如，可以通过实时聚合酶链式反应(rt-PCR)检测延伸产物的扩增来检测突变，其中探针与延伸产物的杂交导致探针的酶消化和产生荧光的检测(TaqMan™ probe method, Holland等 (1991), P.N.A.S. USA 88:7276-7280)。也可以通过检测荧光改变来检测rt-PCR中扩增产物的存在，所述荧光改变是由于探针和延伸产物间形成了核酸双链体(美国申请号2010/0143901)。或者，如例如Sambrook, J. 和Russell, D.W. (2001), Molecular Cloning, 第三版 CSHL Press, 第5和9章中描述，可以通过凝胶电泳随后染色或通过印迹和杂交来检测延伸产物和扩增产物的存在。
在另一个实施方案中，本发明是治疗患者的方法，所述患者具有可能包含具有突变体EGFR基因的细胞的肿瘤。该方法包括在存在一条或多条对应的第二引物(任选地，也选自表1－7)的情况下，将患者样品与一条或多条选自表1－7的用于EGFR突变的等位基因特异性引物接触，进行等位基因特异性扩增，并且通过检测延伸产物是否存在来检测EGFR突变是否存在，并且如果发现至少一个突变，向患者施用抑制由突变基因编码的突变体EGFR蛋白的信号转导的化合物。对于每一突变，可以使用对应探针(任选地，也选自表1－7)进行检测。
在另一个实施方案中，本发明是确定用EGFR抑制剂对患有恶性肿瘤的患者的治疗是否可能成功的方法。该方法包括在存在一条或多条对应的第二引物(任选地，也选自表1－7)的情况下，将患者样品与一条或多条选自表1－7的用于EGFR突变的等位基因特异性引物接触，进行等位基因特异性扩增，并且通过检测延伸产物是否存在来检测EGFR突变是否存在，并且如果发现至少一个突变，则确定治疗是可能成功的。对于每一突变，可以使用对应探针(任选地，也选自表1－7)进行检测。在该实施方案的变化中，EGFR抑制剂是西妥昔单抗、帕尼单抗、厄洛替尼和吉非替尼。
在又一个实施方案中，本发明是包含检测EGFR基因中突变必需试剂的试剂盒。试剂包含一条或多条选自表1－7的用于EGFR突变的等位基因特异性引物、一条或多条对应的第二引物(任选地，也选自表1－7)、和任选地，一个或多个探针(任选地，也选自表1－7)。试剂盒还可以包含对扩增和检测测定的性能必需的试剂，如核苷三磷酸、核酸聚合酶和对聚合酶功能必需的缓冲液。在某些实施方案中，对探针进行可检测地标记。在这些实施方案中，试剂盒可以包含用于标记和检测标记的试剂。
在又一个实施方案中，本发明是检测EGFR基因中突变的反应混合物。混合物包含一条或多条选自表1－7的用于EGFR突变的等位基因特异性引物、一条或多条对应的第二引物(任选地，也选自表1－7)、和任选地，一个或多个探针(任选地，也选自表1－7)。反应混合物还可以包含试剂，如核苷三磷酸、核酸聚合酶和对聚合酶功能必需的缓冲液。
在又一个实施方案中，本发明包含在单一管中同时检测多个EGFR突变的寡核苷酸。在一个实施方案中，本发明包含用于特异性检测人EGFR基因中突变的寡核苷酸(表1－7)(SEQ ID NOS: 2-108)。这些引物中的一些包含如表1－7中显示的内部错配和共价修饰。作为选择，本发明的等位基因特异性引物可以与“通用”即非等位基因特异性的第二引物配对。公开的第二引物的使用是任选的。任何其它合适的下游引物可以与本发明的等位基因特异性引物配对。
实施例
示例性反应条件
用于检测引物性能的示例性反应条件如下。PCR混合物包括50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、80-100 mM 氯化钾、200 µM的每一种dATP、dCTP和dGTP、400 µM dUTP、0.1 µM的每一种选择性或通用引物、0.05 µM探针、目标DNA (10,000个拷贝的具有突变体的质粒或10,000 个拷贝的野生型基因组DNA (混合基因组DNA, Clontech, Mountain View, Calif., 目录号636401)、0.02 U/uL 尿嘧啶-N-糖基化酶、200 nM NTQ21-46A适配子、20 nM DNA聚合酶、0.1 mM EDTA、2.6 mM醋酸镁。使用Roche LightCycler® 480仪器(Roche Applied Science, Indianapolis, Ind.)完成扩增和分析。使用以下温度概况：95℃ 1分钟(或2个循环的95℃(10秒钟)至62℃ (25秒钟))，随后从92℃ (10 秒钟)至62℃ (25-30秒钟)循环99次。在每一个62℃步骤开始时收集荧光数据。任选地，反应包含内源阳性对照模板。
将野生型和突变体序列间的区分测定为野生型和突变体目标的循环至阈值(cycles-to-threshold，∆Ct)值之间的差异。例如，当突变体目标的反应在26个循环后达到阈值循环，而野生型目标的反应仅在55个循环后才达到阈值循环时，记录下29个循环的∆Ct。
表格说明
将以下简写用于修饰碱基核苷酸：“t-bb-dA”和“t-bb-dC”分别表示N6-叔丁基-苯甲基-脱氧腺嘌呤和N4-叔丁基-苯甲基-脱氧胞嘧啶；术语“et-dC”表示N4-乙基-脱氧胞嘧啶；术语“met-dC”表示N4-甲基-脱氧胞嘧啶；和术语“5-p-dU”表示5-丙炔基-脱氧尿嘧啶。在引物和探针序列中，粗体、下划线的核苷酸是修饰碱基核苷酸或与野生型和突变体序列都错配的核苷酸。
实施例 1
用于检测人 EGFR 基因中的突变 G719A 的引物
该突变由EGFR基因(SEQ ID NO: 1)中核苷酸改变2156 G->C产生。用于检测突变的引物和探针显示于表1中。可以使用选自SEQ ID NOs: 2-7的等位基因特异性引物和通用引物检测突变。任选地，通用引物可以是SEQ ID NO: 8。使用与等位基因特异性和通用引物间的区域杂交的探针检测扩增。任选地，探针可以是SEQ ID NO: 9。
表 1
用于检测突变 G719A 的引物和探针
Figure 968441DEST_PATH_IMAGE001
H = Hex, Q = BHQ-2, P = 磷酸盐。
根据反应条件，本实施例中公开的等位基因特异性引物达到了∆Ct 最高达68个循环的野生型序列和G719A突变间的区分。
实施例 2
用于检测人 EGFR 基因中的突变 G719C 的引物
该突变由EGFR基因(SEQ ID NO: 1)中核苷酸改变2156 G->T产生。用于检测突变的引物和探针显示于表2中。可以使用选自SEQ ID NOs: 10-15的等位基因特异性引物和通用引物检测突变。任选地，通用引物可以是SEQ ID NO: 16。使用与等位基因特异性和通用引物间的区域杂交的探针检测扩增。任选地，探针可以是SEQ ID NO: 17。
表 2
用于检测突变 G719C 的引物和探针
Figure 823265DEST_PATH_IMAGE002
H = Hex, Q = BHQ-2, P = 磷酸盐。
根据反应条件，本实施例中公开的等位基因特异性引物达到了∆Ct 最高达69个循环的野生型序列和G719C突变间的区分。
实施例 3
用于检测人 EGFR 基因中的突变 G719S 的引物
该突变由EGFR基因(SEQ ID NO: 1)中核苷酸改变2155-2156 GG->TC产生。用于检测突变的引物和探针显示于表3中。可以使用选自SEQ ID NOs: 18-24的等位基因特异性引物和通用引物检测突变。任选地，通用引物可以是SEQ ID NO: 25。使用与等位基因特异性和通用引物间的区域杂交的探针检测扩增。任选地，探针可以是SEQ ID NO: 26。
表 3
用于检测突变 G719S 的引物和探针
H = Hex, Q = BHQ-2, P = 磷酸盐。
实施例 4
用于检测人 EGFR 基因中的突变 T790M 的引物
该突变由EGFR基因(SEQ ID NO: 1)中核苷酸改变2369 C->T产生。用于检测突变的引物和探针显示于表4a和4b中。可以使用选自SEQ ID NOs: 27-29的等位基因特异性引物和通用引物检测突变。任选地，通用引物可以是SEQ ID NO: 30。使用与等位基因特异性和通用引物间的区域杂交的探针检测扩增。任选地，探针可以是SEQ ID NO: 31。如果使用反义链，可以使用选自SEQ ID NOs: 32-48的等位基因特异性引物和通用引物检测突变。任选地，通用引物可以是SEQ ID NO: 49。使用与等位基因特异性和通用引物间的区域杂交的探针检测扩增。任选地，探针可以是SEQ ID NO: 50。
表 4a
用于检测突变 T790M 的引物和探针 ( 有义 )
Figure 670315DEST_PATH_IMAGE004
J = Ja270, Q = BHQ-2, P = 磷酸盐。
表 4b
用于检测突变 T790M 的引物和探针 ( 反义 )
Figure 484687DEST_PATH_IMAGE005
J = Ja270, Q = BHQ-2, P = 磷酸盐。
根据反应条件，本实施例中公开的等位基因特异性引物达到了∆Ct 最高达51个循环的野生型序列和T790M突变间的区分。
实施例 5
用于检测人 EGFR 基因中的突变 L858R 的引物
该突变由EGFR基因(SEQ ID NO: 1)中核苷酸改变2573 T->G产生。用于检测突变的引物和探针显示于表5中。可以使用选自SEQ ID NOs: 51-57的等位基因特异性引物和通用引物检测突变。任选地，通用引物可以是SEQ ID NO: 58。使用与等位基因特异性和通用引物间的区域杂交的探针检测扩增。任选地，探针可以是SEQ ID NO: 59。如果使用反义链，可以使用选自SEQ ID NOs: 60-68的等位基因特异性引物和通用引物检测突变。任选地，通用引物可以是SEQ ID NO: 69。使用与等位基因特异性和通用引物间的区域杂交的探针检测扩增。任选地，探针可以是SEQ ID NO: 70。
表 5
用于检测突变 L858R 的引物和探针
Figure 510412DEST_PATH_IMAGE006
F = FAM, Q = BHQ-2, P = 磷酸盐。
根据反应条件，本实施例中公开的等位基因特异性引物达到了∆Ct 最高达69个循环的野生型序列和L858R突变间的区分。
实施例 6
用于检测人 EGFR 基因中的突变 L861Q 的引物
该突变由EGFR基因(SEQ ID NO: 1)中核苷酸改变2582 T->A产生。用于检测突变的引物和探针显示于表6中。可以使用选自SEQ ID NOs: 71-79的等位基因特异性引物和通用引物检测突变。任选地，通用引物可以是SEQ ID NO: 80。使用与等位基因特异性和通用引物间的区域杂交的探针检测扩增。任选地，探针可以是SEQ ID NO: 81。如果使用反义链，可以使用选自SEQ ID NOs: 82-90的等位基因特异性引物和通用引物检测突变。任选地，通用引物可以是SEQ ID NO: 91。使用与等位基因特异性和通用引物间的区域杂交的探针检测扩增。任选地，探针可以是SEQ ID NO: 92。
表 6
用于检测突变 L861Q 的引物和探针
Figure 777445DEST_PATH_IMAGE007
F = FAM, Q = BHQ-2, P = 磷酸盐。
根据反应条件，本实施例中公开的等位基因特异性引物达到了∆Ct 最高达57.5个循环的野生型序列和L861Q突变间的区分。
实施例 7
用于检测人 EGFR 基因中的突变 S768I 的引物
该突变由EGFR基因(SEQ ID NO: 1)中核苷酸改变2301 G->T产生。用于检测突变的引物和探针显示于表7中。可以使用选自SEQ ID NOs: 93-101的等位基因特异性引物和通用引物检测突变。任选地，通用引物可以是SEQ ID NO: 102。使用与等位基因特异性和通用引物间的区域杂交的探针检测扩增。任选地，探针可以是SEQ ID NO: 103。如果使用反义链，可以使用选自SEQ ID NOs: 104-106的等位基因特异性引物和通用引物检测突变。任选地，通用引物可以是SEQ ID NO: 107。使用与等位基因特异性和通用引物间的区域杂交的探针检测扩增。任选地，探针可以是SEQ ID NO: 108。
表 7
用于检测突变 S768I 的引物和探针
Figure 976346DEST_PATH_IMAGE008
J = Ja270, Q = BHQ-2, P = 磷酸盐。
本实施例中公开的等位基因特异性引物达到了∆Ct 最高达71个循环的野生型序列和S768I突变间的区分。

Claims (24)

1.在样品中检测人表皮生长因子受体(EGFR)核酸中的突变的方法，包括：
(a) 将所述样品中的核酸与寡核苷酸接触，所述寡核苷酸包含选自SEQ ID NOs: 2、10、18、27、32、51、60、71、82、93和104的寡核苷酸的一级序列；
(b) 在允许所述寡核苷酸与EGFR核酸内的目标序列杂交的条件下孵育所述样品；
(c) 产生包含所述EGFR核酸内目标序列的扩增产物；和
(d) 检测所述扩增产物的存在，由此检测所述EGFR核酸中突变的存在。
2.权利要求1的方法，其中将所述样品中的核酸与所述寡核苷酸接触，所述寡核苷酸还包含至少一个与SEQ ID NO: 1对应部分的额外错配。
3.权利要求1的方法，其中将所述样品中的核酸与所述寡核苷酸接触，所述寡核苷酸还包含至少一个具有在环外氨基上修饰的碱基的核苷酸。
4.权利要求3的方法，其中所述具有在环外氨基上修饰的碱基的核苷酸选自叔丁基-苯甲基-脱氧腺嘌呤、叔丁基-苯甲基-脱氧胞嘧啶、甲基-脱氧腺嘌呤、甲基-脱氧胞嘧啶、乙基-脱氧腺嘌呤和乙基-脱氧胞嘧啶。
5.权利要求1的方法，其中所述扩增通过实时PCR进行。
6.确定患有恶性肿瘤的患者是否可能对EGFR抑制剂响应的方法，包括：
(a) 将所述患者样品中的核酸与寡核苷酸接触，所述寡核苷酸包含选自SEQ ID NOs: 2、10、18、27、32、51、60、71、82、93和104的寡核苷酸的一级序列；
(b) 在允许所述寡核苷酸与EGFR核酸内的目标序列杂交的条件下孵育所述样品；并且产生包含所述EGFR核酸内目标序列的扩增产物；
(c) 检测所述扩增产物的存在，由此检测所述EGFR核酸中突变的存在，并且如果存在突变，
(d) 确定所述患者可能对EGFR抑制剂响应。
7.权利要求6的方法，其中将所述样品中的核酸与所述寡核苷酸接触，所述寡核苷酸还包含至少一个与SEQ ID NO: 1对应部分的额外错配。
8.权利要求6的方法，其中将所述样品中的核酸与所述寡核苷酸接触，所述寡核苷酸还包含至少一个具有在环外氨基上修饰的碱基的核苷酸。
9.权利要求8的方法，其中具有在环外氨基上修饰的碱基的核苷酸选自叔丁基-苯甲基-脱氧腺嘌呤、叔丁基-苯甲基-脱氧胞嘧啶、甲基-脱氧腺嘌呤、甲基-脱氧胞嘧啶、乙基-脱氧腺嘌呤和乙基-脱氧胞嘧啶。
10.权利要求6的方法，其中所述步骤(b)中的扩增和步骤(c)中的检测通过实时PCR进行。
11.权利要求6的方法，其中所述EGFR抑制剂是西妥昔单抗、帕尼单抗、厄洛替尼或吉非替尼。
12.检测人表皮生长因子受体(EGFR)基因中的突变的试剂盒，包含一对或多对选自对(a)-(k)的寡核苷酸：
(a) SEQ ID NOs: 2-7之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 8的寡核苷酸；
(b) SEQ ID NOs: 10-15之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 16的寡核苷酸；
(c) SEQ ID NOs: 18-24之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 25的寡核苷酸；
(d) SEQ ID NOs: 27-29之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 30的寡核苷酸；
(e) SEQ ID NOs: 32-48之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 49的寡核苷酸；
(f) SEQ ID NOs: 51-57之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 58的寡核苷酸；
(g) SEQ ID NOs: 60-68之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 69的寡核苷酸；
(h) SEQ ID NOs: 71-79之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 80的寡核苷酸；
(i) SEQ ID NOs: 82-90之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 91的寡核苷酸；
(j) SEQ ID NOs: 93-101之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 102的寡核苷酸；
(k) SEQ ID NOs: 104-106之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 107的寡核苷酸。
13.权利要求12的试剂盒，还包含额外寡核苷酸，如下：
具有还包含SEQ ID NO: 9的寡核苷酸的寡核苷酸对(a)的试剂盒；
具有还包含SEQ ID NO: 17的寡核苷酸的寡核苷酸对(b)的试剂盒；
具有还包含SEQ ID NO: 26的寡核苷酸的寡核苷酸对(c)的试剂盒；
具有还包含SEQ ID NO: 31的寡核苷酸的寡核苷酸对(d)的试剂盒；
具有还包含SEQ ID NO: 50的寡核苷酸的寡核苷酸对(e)的试剂盒；
具有还包含SEQ ID NO: 59的寡核苷酸的寡核苷酸对(f)的试剂盒；
具有还包含SEQ ID NO: 70的寡核苷酸的寡核苷酸对(g)的试剂盒；
具有还包含SEQ ID NO: 81的寡核苷酸的寡核苷酸对(h)的试剂盒；
具有还包含SEQ ID NO: 92的寡核苷酸的寡核苷酸对(i)的试剂盒；
具有还包含SEQ ID NO: 103的寡核苷酸的寡核苷酸对(j)的试剂盒；
具有还包含SEQ ID NO: 108的寡核苷酸的寡核苷酸对(k)的试剂盒。
14.权利要求12的试剂盒，其中所述额外寡核苷酸是标记的。
15.权利要求12的试剂盒，还包含核苷三磷酸、核酸聚合酶和对所述核酸聚合酶功能必需的缓冲液。
16.检测人表皮生长因子受体(EGFR)基因中的突变的反应混合物，包含一对或多对选自对(a)-(k)的寡核苷酸：
(a) SEQ ID NOs: 2-7之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 8的寡核苷酸；
(b) SEQ ID NOs: 10-15之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 16的寡核苷酸；
(c) SEQ ID NOs: 18-24之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 25的寡核苷酸；
(d) SEQ ID NOs: 27-29之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 30的寡核苷酸；
(e) SEQ ID NOs: 32-48之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 49的寡核苷酸；
(f) SEQ ID NOs: 51-57之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 58的寡核苷酸；
(g) SEQ ID NOs: 60-68之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 69的寡核苷酸；
(h) SEQ ID NOs: 71-79之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 80的寡核苷酸；
(i) SEQ ID NOs: 82-90之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 91的寡核苷酸；
(j) SEQ ID NOs: 93-101之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 102的寡核苷酸；
(k) SEQ ID NOs: 104-106之一的寡核苷酸和SEQ ID NO: 107的寡核苷酸。
17.权利要求16的反应混合物，还包含额外寡核苷酸，如下：
具有还包含SEQ ID NO: 9的寡核苷酸的寡核苷酸对(a)的反应混合物；
具有还包含SEQ ID NO: 17的寡核苷酸的寡核苷酸对(b)的反应混合物；
具有还包含SEQ ID NO: 26的寡核苷酸的寡核苷酸对(c)的反应混合物；
具有还包含SEQ ID NO: 31的寡核苷酸的寡核苷酸对(d)的反应混合物；
具有还包含SEQ ID NO: 50的寡核苷酸的寡核苷酸对(e)的反应混合物；
具有还包含SEQ ID NO: 59的寡核苷酸的寡核苷酸对(f)的反应混合物；
具有还包含SEQ ID NO: 70的寡核苷酸的寡核苷酸对(g)的反应混合物；
具有还包含SEQ ID NO: 81的寡核苷酸的寡核苷酸对(h)的反应混合物；
具有还包含SEQ ID NO: 92的寡核苷酸的寡核苷酸对(i)的反应混合物；
具有还包含SEQ ID NO: 103的寡核苷酸的寡核苷酸对(j)的反应混合物；
具有还包含SEQ ID NO: 108的寡核苷酸的寡核苷酸对(k)的反应混合物。
18.寡核苷酸，包含选自SEQ ID NOs：2、10、18、27、32、51、60、71、82、93和104的寡核苷酸的一级序列。
19.权利要求18的寡核苷酸，还包含至少一个与SEQ ID NO: 1对应部分的额外错配。
20.权利要求18的寡核苷酸，还包含至少一个具有在环外氨基上修饰的碱基的核苷酸。
21.权利要求20的寡核苷酸，其中所述具有在环外氨基上修饰的碱基的核苷酸选自叔丁基-苯甲基-脱氧腺嘌呤、叔丁基-苯甲基-脱氧胞嘧啶、甲基-脱氧腺嘌呤、甲基-脱氧胞嘧啶、乙基-脱氧腺嘌呤和乙基-脱氧胞嘧啶。
22.寡核苷酸，选自SEQ ID NOs: 3-7、11-15、19-24、28、29、33-48、52-57、61-68、72-79、83-90、94-101、105和106。
23.寡核苷酸，选自SEQ ID NOs：8、16、25、30、49、58、69、80、91、102和107。
24.寡核苷酸，选自SEQ ID NOs：9、17、26、31、50、59、70、81、92、103和108。
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