CN117106865B - 基于双扩增放大和双lna探针特异识别dna突变的高灵敏检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及DNA序列检测领域，公开了基于双扩增放大和双LNA探针特异识别DNA突变的高灵敏检测方法，步骤如下：步骤一：确定新建方法的核心反应原理，明确需评估的方法性能指标；步骤二：制备新建方法建立及验证的生物材料，包括引物、LNA探针、待测样本等；步骤三：建立新建方法的检测流程，优化新建方法的关键参数；步骤四：确定新建方法的检测阈值，评估新建方法的分析性能：包括分析敏感性、分析特异性、重复性等；步骤五：评估新建方法的临床应用价值，实现了基于双扩增放大和双LNA探针识别DNA突变的高灵敏检测新方法的建立，为DNA的灵敏、快速地检出提供技术基础，具有单核苷酸的分辨率，也可以提供技术思路，为DNA检测新技术的研发提供经验方法。
Description
技术领域
本发明涉及DNA序列检测领域，尤其是涉及基于双扩增放大和双LNA探针特异识别DNA突变的高灵敏检测方法。
背景技术
准确、快速、灵敏的分析DNA序列对于癌症和传染病的诊断和临床管理至关重要。例如，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）蛋白是表皮生长因子家族成员，是一类在细胞信号转导和调控方面发挥重要作用的跨膜蛋白，与细胞增殖、分化和转移息息相关。研究表明，EGFR 基因敏感突变与非小细胞肺癌（non-small cell lungcancer，NSCLC）的临床转归密切相关。其中EGFR T790M突变是EGFR酪氨酸激酶抑制剂靶向治疗的患者耐药性产生的最主要原因。对于 EGFR T790M 突变阳性的晚期 NSCLC 患者，可优先选用第三代 EGFR-TKIs 药物进行治疗。准确获取DNA序列突变的信息不仅对肿瘤的疗效判断和治疗方案的制订有重要意义，还在病原体耐药性的产生、人类疾病的遗传等多个临床领域发挥重要作用。因此，建立DNA的快速可靠的检出策略，有助于更好的应对公共卫生和传染病防疫挑战、为肿瘤患者制定个体化精准治疗方案等，提高疾病预防及监测预警能力，助力全面实现“健康中国 2030 ”规划。
DNA突变的检测对方法学的特异性和敏感性提出了更高的要求，然而，目前尚缺乏一种不损失敏感性和特异性的快速检测平台。首先，DNA突变涉及单个碱基水平的变化，对方法学特异性要求高。其次，以液体活检为例，癌症特异性突变的丰度通常在0.01%~10%之间变化，具体取决于疾病分期和患者特异性疾病特征。突变可能具有低突变丰度，这是由于疾病处于早期阶段并且肿瘤质量很小，或者亚克隆突变仅存在于肿瘤细胞的一个子集中。亚克隆突变对于治疗选择尤为重要，因为具有耐药突变的罕见亚克隆可在治疗时扩增导致快速治疗失败。因此，在临床环境中，实现0.1%或更低的突变变异分数检测限至关重要，这便要求检测方法学具有极低的容错率和极高的特异性识别能力。目前临床使用较广泛的如ARMS-PCR技术、高分辨率熔解曲线（high-resolution melting）分析、Sanger测序等方法敏感性较差，且反应时间较长。CRISPR技术亦常与PCR技术或等温扩增技术相结合以提高方法学的特异性和敏感性，但其未能很好的解决这一问题，对原始样本中低拷贝数的靶标仍存在漏检的情况，且CRISPR系统固有的脱靶效应还给高特异性的DNA突变的检出带来了新的不确定性，此外其仅能识别特定位点中的突变，具有较强的序列限制性。新材料的使用为突变的检测带来了快速的优势，如金纳米技术可以辅助DNA突变的快速检测，但其仅在突变型序列和野生型序列比例为1：1的样本上进行了验证，不能检测更高背景序列的样本。二代测序亦在DNA点突变检测中有所应用，但受限于复杂的湿实验过程和生物信息学分析。
多反应的级联可实现不同优势的有机整合。LNA Clamp PCR反应通过将LNA探针引入到PCR反应中以提高特异性，但抑制背景序列扩增的同时会在一定程度上抑制突变型序列的检出，导致敏感性下降。而重组酶聚合酶扩增（RPA）技术作为等温扩增的技术之一，有操作简便、反应快速（5~20 min）、灵敏度高（可在不到10 min内扩增低至1~10拷贝的靶标到可检出水平）等优势，但其低温反应的特性限制了其特异性，相对其他扩增技术，RPA对错配的容忍度较高，迄今为止报道的RPA最多可容忍跨越引物和探针结合位点的 9 个核苷酸碱基对的错配。因此，单独的RPA反应在DNA突变检测中应用受限。过往有研究将RPA反应与PCR反应级联以提高反应的灵敏度，但均为分步反应，在RPA反应完成后将其扩增产物转移到qPCR反应管中进行第二轮扩增，转移过程中开盖的步骤极大程度增加了污染的风险，且所需总检测时间较长，经济成本较高。因此建立单管RPA级联LNA Clamp PCR反应对DNA突变的准确、快速、灵敏检出具有重要意义。
发明内容
为了解决上述技术问题或者至少部分地解决上述技术问题，本发明提供了基于双扩增放大和双LNA探针特异识别DNA突变的高灵敏检测方法。
本发明中，提供如下技术方案：基于双扩增放大和双LNA探针特异识别DNA突变的高灵敏检测方法，包括下述步骤：
步骤一：设计跨越突变位点的引物，根据DNA序列信息，设计一对跨越突变位点的引物，突变序列及相应的野生序列在该引物的作用下进行RPA反应以实现无差别的预富集，预富集完成后，混合序列由双LNA探针进行识别；
步骤二：建立碱基序列验证模板，根据突变位点的碱基序列信息，通过PCR技术制备100%突变型序列和100%野生型序列，并通过琼脂糖电泳凝胶及测序确定所制备序列长度符合预期，碱基序列准确可用；
步骤三：建立方法的检测流程，在冰上按试剂说明书对反应组分进行预组装，其中组分A为RPA反应相关组分，RPA反应相关组分包括引物F/R、Rehydration buffer、酶混合物、醋酸镁以及待测样本，组分B为LNA Clamp PCR反应相关组分，LNA Clamp PCR反应相关组分包括引物F/R、Taqman LNA探针、抑制性LNA探针、qPCR Mix(Probe法）以及ROX参比荧光，分别完成组分A和B的预组装后，向组分A中加入待测DNA，混匀后依次将组分B、组分A分别添加至八连管的管盖和管底，在39℃下进行30min的RPA反应，随后离心使B组分进入反应体系并开始后续改良的20个循环的LNA Clamp PCR反应，通过ABI 7500仪器实时监测荧光变化；
步骤四：分析待测样本的实时荧光值，将检测到的荧光值减去第一个测量的荧光值以进行背景校正和标准化分析，并将差值定义为荧光增量ΔRn,同时检测12个无模板对照样本，计算其ΔRn的平均值和标准差，将平均值＋3倍标准差四舍五入至整数作为结果判定的阈值（cut-off值）；
步骤五：检测临床样本的潜力，制备血浆浓度为0%，25%，50%的模拟临床样本，该样本中均含100 copies/ul的突变型序列，利用新建方法对上述样本进行检测，对各组样本荧光差值进行学生t检验，通过P值判定血浆是否对检测效果有抑制作用。
在所述步骤一~三中，所使用的用于制备样本、反应中所用到的引物、LNA探针的序列分别如下表所示：
；
优选的，在所述步骤一中，双探针包括TaqMan LNA探针与抑制性LNA探针，TaqManLNA探针与突变型序列结合，在Taq聚合酶5’→3’切刻活性的作用下发出荧光信号从而被检出，而抑制性LNA探针则与野生型序列结合，阻滞其检出。
优选的，在所述步骤一中，鉴于RPA反应与Taq聚合酶5’→3’切刻活性的不兼容，本发明采用物理分离的策略建立单管反应，其中RPA反应是小体积的，避免二次混匀的需求。
优选的，在所述步骤一中，鉴于RPA反应多需要在反应开始的3~6分钟进行二次混匀以实现性能的最大化，此需求与物理分离策略不兼容，故本发明采用小体积（5ul）的RPA反应，在不需二次混匀的情况下实现同等的性能。
优选的，在所述步骤三中，采用控制变量法，分别对醋酸镁浓度、TaqMan LNA探针与LNA抑制性探针的浓度比等参数进行优化，其中最佳醋酸镁浓度为28mM，TaqMan LNA探针与LNA抑制性探针的最佳浓度比为1：3。
优选的，在所述步骤四中，检测12个无模板对照样本，将其检测结果的均值加上三倍标准差作为检测的阈值，分析特异性评估采用新建方法对野生型样本进行检测，高于该值则判定为阳性，低于该值则判定为阴性，样本检测时至少进行三次技术重复。
优选的，在所述步骤四中，分析敏感性评估利用新建方法对基因突变样本进行检测，每个样本检测20次，用Medcalc软件对检测结果进行Probit分析，以95%置信区间对应的浓度作为方法学检测下限，该方法可检测单拷贝的DNA样本，对0.007%突变的样本进行选择性识别。
优选的，在所述步骤五中，制备血浆浓度为50%，变异等位基因分数为0%~10%不等的模拟临床样本20例，并将其进行0~20的随机编号，由另一操作人员利用本发明中新建方法对该组样本进行检测与结果判读，比较新建方法检测结果和样本实际结果，判定新建方法具备直接检测临床样本而无需核酸提取的应用价值。
本发明的有益效果是：本发明实现了基于双扩增放大和双LNA探针识别DNA突变的高灵敏检测新方法的建立，为DNA的灵敏、快速地检出提供技术基础，具有单核苷酸的分辨率，本发明提供的技术思路，可以为DNA突变检测新技术的研发提供经验方法。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将以EGFR T790M的检出为例，对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
附图1 本发明中的核心反应原理示意图；
附图2 本发明中所制备的EGFR T790M序列琼脂糖凝胶电泳及测序验证结果；
附图3 本发明实施例中利用新建方法检测EGFR T790M序列的结果；
附图4 本发明实施例中对新建方法检测EGFR T790M的关键参数进行优化，包括最佳引物对的筛选，最佳醋酸镁浓度的筛选，最佳TaqMan LNA探针：抑制性LNA探针浓度比的筛选；
附图5 本发明实施例中新建方法检测EGFR T790M的分析性能评估结果展示，包括分析敏感性、分析特异性、重复性等；
附图6 本发明实施例中新建方法检测EGFR T790M的临床应用价值评估结果展示，包括血浆影响的评估、模拟临床样本的检测等。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
下面参照附图，对本发明的具体实施方式进行描述。
本发明围绕DNA突变的灵敏、快速地检出提出一种基于双扩增信号放大和双LNA探针识别的新方法，包括以下步骤：
实施例1：确定新建方法的核心反应原理；
根据DNA序列信息，设计一对跨越突变位点的引物，突变序列及相应的野生序列在该引物的作用下进行RPA反应以实现无差别的预富集。预富集完成后，混合序列由双LNA探针进行识别，其中双探针包括TaqMan LNA探针与抑制性LNA探针，TaqMan LNA探针与突变型序列结合，在Taq聚合酶5’→3’切刻活性的作用下发出荧光信号从而被检出，而抑制性LNA探针则与野生型序列结合，阻滞其检出。
鉴于RPA反应与Taq聚合酶5’→3’切刻活性的不兼容，本发明采用物理分离的策略建立单管反应。本研究将RPA反应组分置于反应管的底部，而LNA Clamp PCR反应组分则置于反应管的顶部，在RPA反应完成后，仅需简单的离心即可使LNA Clamp PCR反应组分进入管底，以RPA反应的扩增子为待测靶标进行检测，以通过简单的操作实现RPA反应级联LNAClamp PCR的单管分步反应。组分的混匀是影响RPA反应性能的关键组分之一，由于RPA反应组分多，易局部聚集而影响扩增效果，通常会在反应中进行两次振荡混匀，第一次混匀为开始反应前，第二次混匀为反应3~6min时。显然，本研究中所建立的物理分区方式无法在RPA反应过程中进行混匀的操作，为解决这一问题，本发明中采用了5ul的小体积RPA反应体系进行扩增，除了可以避免二次混匀的操作外，还可以减少所需试剂的使用体积从而降低成本，具备资源友好和环境友好的特点。
实施例2：制备新建方法建立及验证的生物材料，包括引物、LNA探针、待测样本等；
根据突变位点信息，设计可用于扩增突变位点所在序列的多对引物。同时以最短长度和最少LNA基团修饰为原则，通过调节LNA修饰的数量、位置和碱基类型，设计LNA探针，其中优先选择突变的位置进行修饰，且突变位点应尽量位于探针的中间位置，同时避免4个连续的LNA修饰碱基。预测LNA探针的Tm值，LNA探针与野生型序列结合的Tm值应当高于TaqMan探针，而与突变型序列结合的Tm值应当低于TaqMan探针。通过单纯的LNA Clamp PCR反应，验证双LNA探针区分DNA突变可行。
根据突变位点的碱基序列信息，分别以pUC57-EGFR T790M mutant质粒和A549细胞基因组DNA为模板，通过PCR技术制备100% EGFR T790M突变序列和100% EGFR野生型序列，并通过琼脂糖电泳凝胶及测序确定所制备序列长度符合预期，碱基序列准确可用。
需要说明的是：
1.本发明实施例中检测靶标模型为 20 号外显子 T790M（c.2369C＞T）突变位点，其中 EGFR 基因扩增模板的 DNA 序列来源于网站：http://www.ncbi.nlm.nih.gov，突变位点的信息来源于 COSMIC: http://cancer.sanger.ac.uk/ cancergenome/projects/cosmic；
2.通过https://geneglobe.qiagen.com/us/tools/tm-predic tion网站预测LNA探针的Tm值；
3.本实施例中所使用到的相关引物及探针序列如下表：
；
注：下划线表示LNA修饰位点，加粗表示突变位点
实施例3：建立新建方法的检测流程，优化新建方法的关键参数；
反应流程的建立：在冰上按试剂说明书对反应组分进行预组装，其中组分A为RPA反应相关组分，RPA反应相关组分包括引物F/R、Rehydration buffer、酶混合物、醋酸镁以及待测样本，组分B为LNA Clamp PCR反应相关组分，LNA Clamp PCR反应相关组分包括引物F/R、Taqman LNA探针、抑制性LNA探针、qPCR Mix(Probe法）以及ROX参比荧光，分别完成组分A和B的预组装后，向组分A中加入待测DNA，混匀后依次将组分B、组分A分别添加至八连管的管盖和管底，在39℃下进行30min的5 ul体积的RPA反应，随后离心使B组分进入反应体系并开始后续改良的20个循环的LNA Clamp PCR反应，通过ABI 7500仪器实时监测荧光变化;
反应组分如下：
；
反应程序如下：
；
结果表明，突变型序列荧光值迅速增加，而野生型序列荧光值无明显增长，与无模板对照相似。
引物的设计及最佳引物对的筛选：遵循下述指导原则分别设计多条突变型序列和野生型序列通用的RPA F（F1~F4）和R（R1~R3）引物：引物长度在25bp至35bp之间；扩增子长度在100-200bp最佳；GC百分比含量在40~60%之间；引物中无特殊序列，如连续的嘧啶/嘌呤等；5’端的3~5nt应避开G碱基，而3’端的3nt应尽量为G/C碱基以稳定聚合酶的结合。实验筛选引物组合，以 100copies/ul 突变型靶序列作为模板，其他条件相同的情况下，选取荧光增长快速，荧光增值最大，结果与空白对照（No target control，NTC）有明显区别的引物对。结果表明，F3R2引物对效果最佳。
关键参数的优化：采用控制变量法，分别对醋酸镁浓度、TaqMan LNA探针与LNA抑制性探针的浓度比等参数进行优化，设置0.7mM，1.4mM，2.1mM，2.8mM的醋酸镁浓度梯度和1：1，1：2，1：3的探针浓度比梯度，选择荧光曲线抬头最早且荧光增值最大的醋酸镁浓度，选择突变型序列荧光增值强度与野生型序列荧光增值强度的最大比值所对应的探针浓度比。结果表明，最佳醋酸镁浓度为28mM，最佳TaqMan LNA探针和抑制性LNA探针浓度比为1：3。
实施例4：确定新建方法的结果判定规则，评估新建方法的分析性能：包括分析敏感性、分析特异性、重复性等；
结果判定规则的设置：分析待测样本的实时荧光值，将检测到的荧光值减去第一个测量的荧光值以进行背景校正和标准化分析，并将差值定义为荧光增量ΔRn。同时检测12个无模板对照样本，计算其ΔRn的平均值和标准差，将平均值＋3倍标准差四舍五入至整数作为结果判定的阈值（cut-off值），实验结果表明，EGFR T790M检测阈值为31228，高于该值则判定为阳性，低于该值则判定为阴性。
分析特异性的评估：采用新建方法对EGFR野生型样本进行检测，至少进行三次技术重复，检测结果均为阴性，表明分析特异性良好。
分析敏感性的评估：
①评估可检测的最低输入DNA：将EGFR T790M突变序列进行梯度倍比稀释，以制备系列浓度（0.28copies/ul，0.7copies/ul，2.1copies/ul，2.8copies/ul，7copies/ul，14copies/ul，28copies/ul）的突变基因样本，利用新建方法对其进行检测，每个样本检测20次，用Medcalc软件对检测结果进行Probit分析，以95%置信区间对应的浓度作为方法学检测下限，结果表明可检测的最低输入DNA为1.02copies/ul；
②评估可检测的最低突变丰度：将EGFR T790M突变序列以不同的拷贝数比例（0.001%、0.01%、0.1%、1%、5%、10%、25%、50%）与EGFR野生型序列进行混合以制备不同突变丰度的样本盘，使用新建方法进行检测，每个样本检测20次，用Medcalc软件对检测结果进行Probit分析，以95%置信区间对应的浓度作为方法学可以检出的最低突变丰度，结果表明可检测的最低突变丰度为0.007%。
重复性的评估：对含10%，1%，0.1%的EGFR T790M等位突变基因丰度的样本在一天内重复检测10次，计算检测结果的ΔRn值，分析批内变异；并通过在10天内每天重复检测上述样本，分析批间变异。根据检测结果计算变异系数（coefficient of variation，CV），上述三个浓度样本的CV%均小于20%，可判定为重复性良好。
实施例5：评估新建方法的临床应用价值；
制备血浆浓度为0%，25%，50%的模拟临床样本，该样本中均含100 copies/ul的突变型序列。利用新建方法对上述样本进行检测，对各组样本荧光差值进行学生t检验，通过P值判定血浆是否对检测效果有抑制作用。结果表明，50%的血浆浓度对检测效果无抑制作用。
制备血浆浓度为50%，突变丰度为0%~10%不等的模拟临床样本20例，并将其进行0~20的随机编号，由另一操作人员利用本发明中新建方法对该组样本进行检测与结果判读，比较新建方法检测结果和样本实际结果，判定新建方法检测临床样本的应用价值。结果表明，使用本发明中新建方法的检测结果与实际检测结果一致，表明新建方法具有直接检测临床样本的潜力，而无需进行额外的核酸提取步骤。
本发明实施例如上所述，通过双扩增信号放大及双LNA探针特异性识别实现DNA的快速、灵敏的检测，具备SNV分型的能力。
基于本发明开发的DNA检测新方法，可以检测单拷贝水平的DNA序列，并实现低至0.007%突变丰度样本的SNV分型，全程仅需45分钟，每个样本成本低至不到6元人民币，性能优于现有技术。基于本发明提供的基于双扩增放大和双LNA探针特异识别DNA突变检测新方法，可以实现DNA突变序列的灵敏、快速检测，广泛应用于相关的各临床领域。
在不偏离本发明的基本技术思路和精神原则的情况下，针对上述细节所做出的任何明显的修改，或等同的替换，或进一步的优化，均应包含在本发明的权利要求范围内。
Claims (1)
1.基于双扩增放大和双LNA探针特异识别的检测EGFR T790M DNA突变的方法，其特征在于，所述方法用于非诊断目的，包括下述步骤：
步骤一：设计跨越突变位点的引物，根据DNA序列信息，设计一对跨越突变位点的引物，突变序列及相应的野生序列在该引物的作用下进行RPA反应以实现无差别的预富集，所述引物对序列如下：F3:TGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCAC和R2:CCAATATTGTCTTTGTGTTCCCGGAC；
步骤二：建立碱基序列验证模板，根据突变位点的碱基序列信息，分别以pUC57-EGFRT790M mutant质粒和A549细胞基因组DNA为模板，通过PCR技术制备100% EGFR T790M突变序列和100% EGFR野生型序列，并通过琼脂糖电泳凝胶及测序确定所制备序列长度符合预期，碱基序列准确；
步骤三：建立方法的检测流程，在冰上按试剂说明书对反应组分进行预组装，其中组分A为RPA反应组分，反应体积为5ul，组分B为LNA Clamp PCR反应组分，反应体积为15ul，具体如下：
；
其中引物F/R,为F3和R2的混合物；
所述抑制性LNA探针的序列为：GCAGCTCATCACGCAGCTCA;所述TaqMan LNA探针的序列为：FAM-CTCATCATGCAGCTCATGCCCTTCGGC-BHQ1;
下划线表示LNA修饰位点，加粗表示突变位点；
分别完成组分A和B的预组装后，向组分A中加入待测样品，混匀后依次将组分B、组分A分别添加至八连管的管盖和管底，在39℃下进行30min的RPA反应,随后离心使B组分进入反应体系，反应条件为95℃反应1min，以及20个循环的95℃10sec和60℃31sec，通过ABI 7500仪器实时监测荧光变化；
步骤四：分析待测样本的实时荧光值，将检测到的荧光值减去第一个测量的荧光值以进行背景校正和标准化分析，并将差值定义为荧光增量ΔRn,同时检测12个无模板对照样本，计算其ΔRn的平均值和标准差，将所述无模板对照样本的ΔRn平均值＋3倍标准差四舍五入至整数作为结果判定的阈值，检测EGFR T790M的阈值为31228，待测样品的ΔRn高于阈值则判定为阳性，低于阈值则判定为阴性，样本检测时至少进行三次技术重复；
所述待测样品为血浆浓度为50%的模拟临床样本；所述方法具备直接检测临床样本而无需核酸提取的应用价值。
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