CN103382504A - Ercc1基因和tubb3基因检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于生物技术及医学领域，提供一种ERCC1基因和TUBB3基因检测试剂及检测试剂盒。该检测试剂包含：第一引物对序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，第一探针序列SEQ ID NO:3，第二引物对序列SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，第二探针序列SEQ ID NO:6，所述第一探针序列SEQ ID NO:3和第二探针序列SEQ ID NO:6的5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团。该检测试剂盒包括该试剂，可用于判断个体对化疗药物敏感性的应用。该检测试剂盒进行定量检测，具有较高的特异性和敏感性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术及医学领域，尤其涉及一种ERCC1基因和TUBB3基因检测试剂及检测试剂盒及该试剂盒的应用。
背景技术
利用铂类药物杀伤肿瘤细胞的原理是：铂与肿瘤细胞DNA结合形成铂-DNA加合物，导致DNA链间或链内交联，引起DNA损伤，从而抑制肿瘤细胞分裂，诱导肿瘤细胞凋亡。在人类肿瘤细胞中，铂类引起的损伤主要由核苷酸切除修复系统（NER）进行修复，NER中的关键基因ERCC1与XPF表达产物结合形成的异二聚体具有DNA5’端核酸内切酶活性，能识别和切除被铂类药物损伤的DNA部位，以完成DNA损伤的修复。因此ERCC1基因的表达量直接影响DNA的修复，ERCC1基因水平高则患者对药物造成的DNA损伤的修复能力越强，铂类药物的敏感性越低。因此针对高表达ERCC1患者建议选用不含铂类药物的方案化疗，可以取得较好治疗效果。反之，ERCC1低表达患者在使用铂类药物时可根据临床实际情况适当减少用药剂量。在2011年发布的美国国家癌症综合治疗联盟（NCCN）的临床治疗指南（第二版）中明确指出：“在接受铂类化疗前进行ERCC1mRNA表达水平检测可提高治疗有效率和患者生存率。”
研究发现，细胞内微管蛋白是有丝分裂时纺锤体的基本组成单位，也是抗微管类药物的主要作用靶点。TUBB3编码的3型β微管蛋白与抗微管类化疗药敏感性密切相关。在针对多种肿瘤细胞系的研究和临床试验中都发现TUBB3mRNA表达水平与抗微管类化疗药的疗效相关。低TUBB3表达水平的肿瘤患者接受紫杉醇类化疗药物的效果较好，中位表达水平患者生存期较长。反之，TUBB3高表达的患者的疗效较差。
目前许多分子生物学技术已应用于ERCC1和TUBB3mRNA的检测，然而，免疫组化的检测主要限于组织样品，而临床标本的连续采样存在很大的困难；常规RT-PCR技术不能对基因的表达进行定量分析，且在敏感性和特异性方面的不足使某些微量表达的标本未能被准确无误地检出，当前用于ERCC1和TUBB3检测的荧光定量PCR技术均不能对二者进行同时检测，从而大大限制了ERCC1和TUBB3在化疗用药指导和预后评估中的应用。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种ERCC1基因和TUBB3基因检测试剂及包含该试剂的试剂盒，旨在解决现有技术中不能同时检测ERCC1基因和TUBB3基因的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种ERCC1基因和TUBB3基因检测试剂，其包含：第一引物对序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，第一探针序列SEQ IDNO:3，第二引物对序列SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，第二探针序列SEQ IDNO:6，，所述第一探针序列SEQ ID NO:3和第二探针序列SEQ ID NO:6的5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团。
本发明实施例的另一目的在于提供一种ERCC1基因和TUBB3基因检测试剂盒，该试剂盒包括本发明的检测试剂。
本发明实施例的还另一目的在于提供本发明的检测试剂盒用于判断个体对化疗药物敏感性的应用，该应用包括荧光定量PCR反应过程。
本发明提供的检测试剂及检测试剂盒可同时针对ERCC1和TUBB3基因的mRNA表达进行定量检测，具有较高的特异性和敏感性，为肿瘤患者的铂类、紫杉醇和长春碱类等化疗药物的用药指导提供了重要参考，且该试剂盒在应用时操作简便，检测迅速。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种ERCC1基因和TUBB3基因检测试剂，该检测试剂包含：第一引物对序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，第一探针序列SEQ IDNO:3，第二引物对序列SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，第二探针序列SEQ IDNO:6，所述第一探针序列SEQ ID NO:3和第二探针序列SEQ ID NO:6的5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团。
具体地，上述引物对和探针序列分别为：
针对ERCC1的正向引物：5’-GGCGACGTAATTCCCGACTATG-3’SEQIDNO:1，
针对ERCC1的反向引物：5’-GAAGTTCTTCCCCAGGCTCTG-3’SEQIDNO:2，
针对ERCC1的探针：5’-ACCTGTGCCCTGTTCCTCAGCCTCC-3’SEQIDNO:3，
针对TUBB3的正向引物：5’-ACGACCTGGTGTCCGAGTAC-3’SEQIDNO:4，
针对TUBB3的反向引物：5’-CTGCGAGCAGCTTCACTTGG-3’SEQIDNO:5，
针对TUBB3的探针：5’-TCCTCCTCGTCGTCTTCGTACATCTCGC-3’SEQIDNO:6，
其中上述探针序列SEQIDNO:3和SEQIDNO:6的5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团，且两条探针序列5’端的荧光基团不相同。
具体地，上述探针序列5’端连接的荧光基团为FAM、ROX或HEX，3’端连接的淬灭基团为TAMRA、BHQ2或BHQ1。
本发明具体实施例中，上述ERCC1基因和TUBB3基因检测试剂还可包含DNA聚合酶，dNTP，PCR缓冲液（10×PCRbuffer）等PCR反应所必需的组分，并可通过加入双蒸水使反应体积达到需要的值。上述PCR缓冲液可包含合适浓度的镁离子，也可通过将镁离子与不含镁离子的缓冲液在反应之前混合获得，可根据具体情况选择。
本发明实施例中使用的DNA聚合酶可以选用任何适用于荧光定量PCR反应的DNA聚合酶，优选地，该DNA聚合酶为热启动ExTaqDNA聚合酶。
本发明实施例还提供一种ERCC1基因和TUBB3基因检测试剂盒，包括本发明的ERCC1基因和TUBB3基因检测试剂。
具体地，上述检测试剂或者上述检测试剂盒还可包括针对看家基因β-actin的第三引物对SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8以及第三探针序列SEQ ID NO:9，通过对看家基因的定量检测，并将ERCC1基因和TUBB3基因检测结果与之比较可得知后两者（ERCC1基因和TUBB3基因）表达水平的高低，即通过该方法可以给出一个定量的检测结果，该结果可作为判断ERCC1基因和TUBB3基因表达水平高低的依据。
本发明实施例提供的试剂盒包含针对ERCC1、TUBB3和β-actin基因的高度保守区的引物和探针，可特异性地定量检测三种基因表达水平，并通过对荧光定量PCR反应的优化可得到最佳的检测效果。
具体地，上述第三引物对和第三探针序列具体为：
针对β-actin的正向引物：5’-CCTCCTCAGATCATTGCTCCTC-3’SEQIDNO:7，
针对β-actin的反向引物：5’-ATTTGCGGTGGACGATGGAG-3’SEQIDNO:8，
针对β-actin的探针：5’-ACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGCTG-3’SEQIDNO:9，
其中上述探针序列5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团，该荧光基团可以为FAM、ROX或HEX中的一种，该淬灭基团为TAMRA、BHQ2或BHQ1中的一种。
优选地，在本发明实施例的检测试剂盒中，三种探针序列SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:9的5’端连接的荧光基团各不相同，且它们3’端连接的淬灭基团各不相同，由此在对待测样品进行检测时形成三重检测通道，结果直观清晰，便于读取。
具体地，本发明实施例的检测试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，其中该阳性对照为样本标准品ERCC-S、标准品TUBB-S、标准品actin-S和1个阴性对照。其中该标准品ERCC-S可被ERCC1的引物对扩增、标准品TUBB-S可被TUBB3的引物对扩增、标准品actin-S可被β-actin的引物对扩增，用于作为荧光定量PCR反应时的阳性对照。该阴性对照可以为水，可以为其他不含上述三种基因片段的液体。
具体地，本发明实施例的检测试剂盒还可包括用于样品RNA提取的试剂以及将RNA翻转成DNA的试剂以完成RNA提取及反转录的过程。具体地，上述RNA提取试剂包括Trizol裂解液，该反转录试剂包括RNA酶抑制剂、M-MLV反转录酶等。或者，本发明实施例的检测试剂盒检测的样品DNA通过另外的RNA提取及反转录试剂完成。
对于待测样品，在利用本发明实施例的检测试剂盒进行荧光定量PCR检测时，先提取RNA，然后将RNA反转录为cDNA，然后利用本发明的试剂盒通过荧光定量PCR反应对cDNA中相关基因表达水平进行检测。
具体地，本发明实施例的试剂盒中，可使用25μL荧光定量PCR反应体系，也可以使用其他适用于荧光定量PCR反应的反应体系。例如，在25μL反应体系中，可以选用以下组分：
10×PCRbuffer 2-3μL，
dNTP（2-3mmol/L)1.5-2.5μL，
引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2各8-12pmol；
引物SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5各8-12pmol；
引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8各10-14pmol；
探针SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9各4-6pmol；
热启动ExTaqDNA聚合酶1.5-2.5U。
上述体系在进行检测时加入2μL待测样品的cDNA模板，并用双蒸水补足至25μL。
优选地，该25μL反应体系由以下组成：
10×PCRbuffer 2.5μL，
dNTP（2.5mmol/L) 2μL，
引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2各10pmol；
引物SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5各10pmol；
引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8各12pmol；
探针SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9各5pmol；
热启动ExTaq DNA聚合酶 2.0U，
并在检测是加入待检测样品cDNA模板2μL，并用双蒸水补足至25μL。
利用本发明检测试剂盒进行荧光定量PCR检测是，采用的PCR反应程序为：94-95℃3-3.5min；93-4℃15-20s，58-62℃68-72s，38-42个循环。
优选的PCR反应程序为：95℃3min；94℃15s，60℃70s，40个循环。
本发明实施例还提供上述检测试剂盒用于判断个体对化疗药物敏感性的应用，以对于肿瘤患者提供个体化治疗提供辅助依据。
具体地，利用本发明实施例的检测试剂盒对于取自待检测个体的样品进行检测，获得ERCC1基因和TUBB3基因的具体表达量，具体治疗方案制定者可根据该表达量信息确定对于肿瘤患者用药情况，尤其是使用铂类、紫杉醇和长春碱类等化疗药物时，例如，对于ERCC1基因表达水平高的患者应使用不含铂类药物的方案化疗，对于低表达量患者可以使用铂类药物；而对于TUBB3基因表达水平高的患者应避免使用紫杉醇，对于低表达量患者可使用紫杉醇类药物。
以下通过具体实施例对本发明进行详细描述。
实施例1阳性对照的合成
1.按照如下内容合成引物及探针序列：
ERCC1-F：GGCGACGTAATTCCCGACTATG(SEQ ID NO:1)，
ERCC1-R：GAAGTTCTTCCCCAGGCTCTG（SEQ ID NO:2）,
ERCC1探针:FAM-ACCTGTGCCCTGTTCCTCAGCCTCC-TAMRA（SEQID NO:3）；
TUBB3-F：ACGACCTGGTGTCCGAGTAC（SEQ ID NO:4），
TUBB3-R：CTGCGAGCAGCTTCACTTGG（SEQ ID NO:5）,
TUBB3探针:ROX-TCCTCCTCGTCGTCTTCGTACATCTCGC-BHQ2（SEQID NO:6）；
β-actin-F：CCTCCTCAGATCATTGCTCCTC（SEQ ID NO:7），
β-actin-R：ATTTGCGGTGGACGATGGAG（SEQ ID NO:8）,
β-actin探针:HEX-ACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGCTG-BHQ1（SEQID NO:9）。
上述引物探针序列分别制成50mM的母液储存。
2.采集肿瘤患者EDTA抗凝血约3mL，利用Ficoll分离液常规分离外周血单个核细胞(PBMC)和血浆，具体操作如下：将3mL抗凝全血缓慢加入至Ficoll分离液上层；室温下离心800g/min15min;仔细缓慢吸出中层的乳白色PBMC，加4℃的PBS缓冲液4-5mL，室温下离心400g/min10min；弃上清液，加4℃的PBS缓冲液4-5mL，室温下离心400g/min10min；弃上清，加入约2mLPBS缓冲液，混匀后分装，置于液氮中保存待用。
3.利用Trizol试剂提取上述PBMC的总RNA，具体操作按照Trizol说明书进行。然后利用M-MLV反转录酶进行反转录，合成cDNA。
4.以cDNA为模板，利用上述合成的ERCC1、TUBB3和β-actin基因的特异性引物进行PCR扩增。ERCC1和TUBB3基因的PCR反应条件均为95℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃15s，30个循环；72℃5min。β-actin基因PCR反应条件为95℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃20s，30个循环；72℃5min。凝胶回收ERCC1、TUBB3和actinPCR扩增片段，利用pMD18-T载体构建重组质粒，并测序鉴定序列是否正确。
按照以下公式计算ERCC1、TUBB3和β-actin重组质粒的拷贝数：拷贝数
NA为阿伏伽德罗常数，将重组质粒均稀释至1010copies/μL，并分别命名为ERCC-S、TUBB-S和actin-S，将该质粒于-20℃保存待用，作为阳性对照。
实施例2检测试剂盒的制备
制备25μLPCR反应体系：10×PCRbuffer2.5μL，dNTP（2.5mmol/L)2μL，ERCC1及TUBB3基因的上下游引物（10pmol/μL）各为1μL，β-actin基因的上下游引物（10pmol/μL）均各为1.2μL，ERCC1、TUBB3和β-actin探针（10pmol/μL）均为0.5μL，热启动（Hotstart）ExTaqDNA聚合酶0.5μL，灭菌水10.1μL，混合均匀，得总体积为23μL的混合物。
将上述混合物至于PCR反应管中，与实施例1制备的阳性对照包装成为检测试剂盒。
实施例3ERCC1基因及TUBB3基因定量检测
于广州某医院住院及接受治疗的肺癌患者各12例，患者的诊断主要根据PET检查，所有患者均经病理组织学确诊。随机选取本院正常体检的健康受试者12例，心、肺、肝、肾等脏器均无疾患，功能正常，无肿瘤病史。
对上述受试者取外周血，提取总RNA并反转录为cDNA，具体操作步骤按照实施例1的步骤2和3进行，该cDNA于溶液中保存。
取上述cDNA溶液2μL加入至实施例2制备的23μL混合物中，混匀得25μL反应体系。
阳性对照反应体系中将实施例1制备的阳性对照与实施例2制备的23μL混合物混合，阴性对照反应体系中用水与实施例2制备的23μL混合物混合。
将上述三种反应体系同时按如下程序进行：
95℃3min；94℃15s，60℃70s，40个循环。
检测结果：
12例肺癌患者的ERCC1及TUBB3的检测结果均为阳性，而12例健康受试者中，仅11例ERCC1及TUBB3的检测结果为阳性。肺癌患者中ERCC1及TUBB3基因mRNA的表达量的对数值范围分别为3.47～5.38和3.33～4.90；阳性结果的健康受试者中ERCC1及TUBB3基因mRNA的表达量的对数值范围分别为2.54～3.68和2.56～3.45，低于肺癌患者对应的数值。
实施例4检测试剂盒敏感度及重复性检测
敏感性检测，将实施例1获得的ERCC1、TUBB3及β-actin基因的重组质粒的拷贝数设定为100copies/μL，并加入实施例2的PCR反应体系中进行荧光定量PCR反应，可在设定阈值范围内检测到特异、清晰的荧光扩增曲线。
重复性检测：
取来自同一受试者的同一批次的待测样品在不同稀释度下测试，所得结果中ERCC1、TUBB3及β-actin基因的CT变异系数分别为1.47～4.29%、1.69～4.70%和1.52～4.55%；然后对来自不同批次的样品进行检测，得到的CT变异系数则分别为2.82%～4.39%,2.62%～4.81%和2.54%～4.28%，说明三重荧光定量RT-PCR反应的重复性较好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种ERCC1基因和TUBB3基因检测试剂，包含：第一引物对序列SEQID NO:1和SEQ ID NO:2，第一探针序列SEQ ID NO:3，第二引物对序列SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5，第二探针序列SEQ ID NO:6，所述第一探针序列SEQ IDNO:3和第二探针序列SEQ ID NO:6的5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团。
2.如权利要求1所述的ERCC1基因和TUBB3基因检测试剂，其特征在于，还包含第三引物对SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8以及第三探针序列SEQ IDNO:9，所述第三探针序列SEQ ID NO:9的5’端连接有荧光基团，3’端连接有淬灭基团。
3.如权利要求2所述的ERCC1基因和TUBB3基因检测试剂，其特征在于，所述第一探针序列SEQ ID NO:3、第二探针序列SEQ ID NO:6和所述第三探针序列SEQ ID NO:9的5’端连接的荧光基团各不相同。
4.一种ERCC1基因和TUBB3基因检测试剂盒，包括如权利要求1-3中任一项所述的ERCC1基因和TUBB3基因检测试剂。
5.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照，所述阳性对照包含可被第一引物对序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2扩增的序列，可被第二引物对序列SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5扩增的序列，以及可被第三引物对序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2扩增的序列。
6.如权利要求4或5所述的检测试剂盒用于判断个体对化疗药物敏感性的应用，该应用包括荧光定量PCR反应。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述PCR反应程序为：94-95℃3-3.5min；93-4℃15-20s，58-62℃68-72s，38-42个循环。
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