CN103898216B

CN103898216B - 一种桑树品种亲缘关系dna分子评鉴方法

Info

Publication number: CN103898216B
Application number: CN201410117235.9A
Authority: CN
Inventors: 陈仁芳; 陈祥平; 范小敏; 柯皓天; 冯永德
Original assignee: SICHUAN RESEARCH INSTITUTE OF SILK SCIENCE; SICHUAN SILK ENGINEERING TECHNOLOGY RESEARCH CENTER; Southwest University
Current assignee: Sichuan Academy Of Silk Sciences Co ltd; SICHUAN SILK ENGINEERING TECHNOLOGY RESEARCH CENTER; Southwest University
Priority date: 2014-03-27
Filing date: 2014-03-27
Publication date: 2016-05-25
Anticipated expiration: 2034-03-27
Also published as: CN103898216A

Abstract

本发明公开了一种桑树品种亲缘关系DNA分子评鉴方法，包括以下步骤：（1）桑树品种的系统发育分析；1）取材；2）筛选对比序列；3）桑树基因组DNA提取及纯度、浓度检测；4）PCR扩增；5）PCR检测；6）PCR测序；7）序列拼接、对比，鉴定进化关系；（2）桑树品种亲缘关系分析。本发明先进行系统发育分析，且从世界范围内分布桑种及变种合理取材，再进行桑树品种居群遗传多样性分析，进一步确定亲缘关系，通过两步骤分析方法的使用，显著提高了评鉴亲缘关系的准确性和可重复性，为保护桑树品种资源，进行桑树品种指纹鉴别，分子辅助育种、品种资源开发及利用有重大推动作用。

Description

一种桑树品种亲缘关系DNA分子评鉴方法

技术领域

本发明属于桑树品种育种及分子生物学技术领域，具体涉及一种桑树品种亲缘关系DNA分子评鉴方法。

背景技术

我国是蚕丝生产大国，是世界蚕业的发祥地，同时蚕桑生产在国民经济中占有十分重要的位置。桑是蚕的重要饲料，桑树品种资源的开发育种已成为越来越重要的研究课题，目前，国内外众多学者早已开始从理论和实践上开始对桑树品种资源的保存，杂交育种亲本的选择，桑树品种指纹鉴别，分子辅助育种，品种资源开发及利用等展开研究。

迄今为止，国内外已经开展了多项经典分类研究，这些研究对桑属的亲缘关系有重大推动作用，但存在的主要问题是对种类的认识上有差距。虽然均以花柱长短作为一级分类目标，但分出来的种数差异很大，同种异名，异种同名的现象非常普遍，且分类不稳定，鉴定出来的桑属亲缘关系准确性低。

随之，大多数学者开始采用DNA分子亲缘关系分析方法展开研究，主要采用RAPD、AFLP、ISSR、SSR、SRAP等分子标记技术，虽然取得一定的研究成果，但是取材类型及数量不足，代表面较窄，研究方法较为单一，重复性差，因此所取得的研究成果参考研究价值较低。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中中评鉴方法实验结果重复性差，不适合桑树品种的系统发育分析，不能将桑属品种进行种细分、准确性差、取材不合理参考价值等缺陷，提供一种桑树品种亲缘关系DNA分子评鉴方法，本方法简单易行，取材合理，能够通过系统发育分析从而确定亲缘关系的大致框架，再进一步根据框架进行居群遗传多样性分析，从而提高了亲缘关系鉴定的准确性。

本发明通过下述技术方案实现：一种桑树品种亲缘关系DNA分子评鉴方法，包括以下步骤：

（1）桑树品种的系统发育分析：

1）取材；

2）筛选对比序列；

3）桑树基因组DNA提取及浓度、纯度检测；

4）PCR扩增；

5）PCR检测；

6）PCR测序；

7）序列拼接、对比，鉴定进化关系；

（2）桑树品种的亲缘关系分析；

采用DNA分子标记方法对步骤7）获得的进化关系进行亲缘关系分析，获得分析结果。

本方法通过在世界范围内分布的桑种、变种及不同生态类型选材，从而构建桑树品种样本。优选采摘桑树品种春季嫩叶，取1-2位叶，放入到装有变色硅胶并且带封口的塑料袋中，内置变色硅胶使其干燥，常温下放置，如果在放置过程中变色硅胶变色，则重新更换；将桑叶样本用石英砂磨成石英粉，取0.10—0.20g粉末采用2—4倍CTAB提取液进行DNA提取，提取后的DNA进行浓度和纯度的检测，并进行复核，DNA提取、浓度和纯度检测及复核步骤为所属领域的公知常识，这里不再详述；本方法中从桑树品种样本中提取DNA后进行PCR扩增反应、PCR检测反应、PCR测序反应，所得的测序结果用Sequencher4.1.4软件拼接，对少数误判碱基，根据碱基峰形更正。用Clustalx1.83c软件序列对比，并依据筛选出的对比序列核rDNA内转录间隔区ITS（5SrRNA基因间隔区NTS,26S-18SrRNA基因间隔区IGS）序列确定序列范围，用Bioedit软件除去两端非ITS部分。并采用DNAstar软件分析各序列长度、G+C含量及变异位点，同源性及遗传分歧。用ModeltestV3.06和PAUPVersion4.0b10软件进行碱基替换模型计算，基于模型用PAUPVersion4.0b10MP法或mrbayes软件分析系统进化关系。根据鉴定出来的桑树品种亲缘关系，进行进一步的取材。本方法通过在所鉴定品种区域进一步增大取材范围，进一步采用DNA分子标记法对待鉴定品种亲缘关系进行分析，取得分析结果，避免仅采用系统发育分析方法或者DNA分子标记方法进行分析所带来的准确性低，重复性差、取材不合理、参考性差等技术缺陷。

进一步地，所述筛选对比序列步骤中对比序列为核rDNA内转录间隔区ITS，5SrRNA基因间隔区NTS，26S-18SrRNA基因间隔区IGS序列。

进一步地，所述步骤桑树基因组DNA提取及浓度、纯度检测中取经硅胶干燥处理后的桑树品种样本0.10-0.20g，通过2-4倍CTAB提取液提取获得桑树基因组DNA并进行浓度、纯度检测及复核，通过对用于DNA提取的桑树品种的称取量及提取试剂进行了优选，有利于提高待鉴定桑树品种DNA提取效果。

进一步地，所述步骤桑树基因组DNA提取及浓度、纯度检测中桑树品种样品通过4倍CTAB提取液提取获得基因组DNA.，CTAB提取液可以实现对DNA的有效提取，经过大量实验研究发现，优选4倍CTAB提取液，可以有效提高DNA提取效果。

进一步地，所述步骤桑树基因组DNA提取及浓度、纯度检测中干燥桑树品种样本的称取量为0.15g，这里对桑树品种称取量进行了进一步限定，根据实验结果，0.15g的桑树样品粉末，DNA提取量最大。

进一步地，所述步骤PCR扩增反应中PCR扩增反应引物为核rDNA内转录间隔区ITS。

进一步地，所述步骤PCR扩增反应中反应程序为94℃预变性4min，94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1min、每个循环94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1min共33个循环，72℃延伸7min，反应结束控制在12℃。

进一步地，所述步骤筛选对比序列中所用对比序列为转录组测序，这里对筛选的对比序列进行了进一步的优选，采用转录组测序作为对比序列，极大提高了鉴定桑树品种亲缘关系的准确性。

进一步地，所述步骤筛选对比序列中所用对比序列为全基因组测序，通过采用全基因组测序作为对比序列，桑树品种亲缘关系的鉴定效果更好。

进一步地，所述步骤桑树品种的亲缘关系分析中采用的DNA分子标记方法为ISSR方法，DNA分子标记方法有很多种，这里优选ISSR方法。

采用ISSR分子标记方法分析步骤为：

1）取样

根据序列拼接、对比，鉴定进化关系步骤分析获得的进化关系所建立的桑树品种，进行桑树品种所在位置进行取样，并适当增加品种所在地区的品种。

2）总DNA提取及浓度、纯度检测

DNA提取步骤

①取2ml离心管，放置在离心管架上，在离心管中加入经石英砂磨细的桑叶粉0.10g；②往离心管中加入900μl，4×CTAB提取液，加入后充分混匀；③振荡混匀后，65℃水浴1小时，水浴第5min取出摇匀一次，以后每10min取出一次进行摇匀；④水浴完成后，取出冷至室温，加24：1氯仿：异戊醇900μl，混匀，12000转/分，离心10min，取上清液（重复一次）；⑤取上清液移入1.5ml离心管，加异丙醇(-20℃保存)600μl，轻倒转摇匀，放入4~-20℃保存30-60min；⑥从4-20℃冰箱中取出12000转离心5min，此时能看见离心管底部有白色沉淀；倒掉异丙醇，吸水纸吸干离心管口，用75%乙醇(-20℃保存)500μl洗涤一次，再用无水乙醇（-20℃保存)300μl洗涤一次，倒掉无水乙醇，将离心管倒置吸水纸上放置15min，除尽乙醇。⑦加50μlSDW溶解沉淀10min，溶解时用手指弹离心管底部，促使白色沉淀溶解；⑧加已提前制备好的2μlRNA酶，伸入，弹，使其混匀，37℃恒温金属浴30min；取出加10ul3MNaAC，弹，使其混匀，再加120μl无水乙醇，-20℃保存30min；⑨12000转离心5min，此时DNA已附在离心管底部管壁，轻轻倒掉液体，吸水纸吸干离心管口，用500ul，75%乙醇洗一次，再用300μl，无水乙醇洗一次，倒掉无水乙醇，倒置凉干；⑩37℃温干，此时离心管底部管壁应发白，加50-70ulSDW使其溶解，-20℃保存备用。

浓度、纯度检测步骤

①制胶：称取0.4gGel，于烧杯中，加入TAE缓冲液40ml(浓度1%)，微波炉加热，使其溶解，稍冷却后，倒入制胶盒内，室温冷却后使用；②点样：在一次性手套上点样，有多少样品即点多少个点，另多加一个λDNA/HindⅢmarker，浓度为50ng/μl。点样顺序先加ddH2O,3μl，再加6×Loadingbuffer，2μl，最后加样品DNA，2ul；③跑胶：将制好的胶板，取下梳子，将点在一次性手套上的样，用移液器吸入点样胶孔内，放入电泳槽，加电压110V，电泳25-35min。当看见兰色跑到胶的中间时，停止电泳，取出，EB染色10min,将胶放入BIO-RADGelDocTMEZImager2000凝胶成像系统紫外分光核酸测定仪进行检测扫描。根据50ng/μl的λDNA/HinIIImarker亮度，估计DNA浓度。

复核步骤

用Nanodrop2000微量紫外分光光度计自动计算，在260、280nm波长处的紫外吸光度(A)值及DNA纯度和浓度。A260/A280值在1.8-2.0纯度符合要求，浓度在10ng/μl以上符合要求。

3)ISSR-PCR扩增

①引物筛选

选取如下42个引物如下：

ID:(AG)6TA、ID:2(AG)8TA、ID:3(AG)6GC、ID:4(AG)6TC、ID:5(AG)7TC、ID:6(AG)8TC、ID:7(AG)8YT、ID:8(AG)8YC、ID:9(AG)8S、ID:10(AC)8YT、ID:11(AC)6T、ID:12(AC)8T、ID:13(AC)8C、ID:14(AC)8YT、ID:15(ATT)6、ID:16(CT)8G、ID:17(CT)6GC、ID:18(CT)8GC、ID:19(CT)6RC、ID:20(CT)6AC、ID:21(CT)8AC、ID:22(CT)6TG、ID:23(CT)8TG、ID:24(CT)8TC、ID:25(CT)6CC、ID:26(CT)8CC、ID:27(CT)8RT、ID:28(CA)8A、ID:29(CA)8RT、ID:30(CGA)6GG、ID:31(GT)6CG、ID:32(GT)6CC、ID:33(GTG)6、ID:34（GTC）6、ID:35（GTGC）4、ID:36(GA)6GG、ID:37(GAG)4GC、ID:38(GAGT)4、ID:39(GACA)4、ID:40(GCGT)4、ID:41(TG)6GT、ID:42(TG)8GT。

其中R＝A／G,Y＝C／T,M＝A／C,K＝G／T,S＝C／G,W＝A／T,H＝A／C／T,B＝C／G,T＝A／C／G,D＝A/G/T,N=A／C／G/T。

用2个DNA样品，对42个引物进行选择，选出条带多且清晰的引物用于ISSR实验。

②PCR扩增反应体系：1.0ul25ng/ul,模板DNA,50umol/L,1.0ulISSRPrimer引物，2.0ul10xPCRBuffer10×PCR缓冲液，2ul2.5mmol/LMgCl₂，2.0ul2.5mmol/LdNTP，0.3ul5U/μlTaq酶，加ddH2O至25ul，混匀稍离心,加一滴矿物油。

③ISSR-PCR扩增程序

ISSR扩增反应在GeneCompanyLimitedPCR仪上进行，扩增程序为94℃预变性5min；94℃变性60s；50℃退火40s；72℃延伸90s；40个循环，72℃延伸10min，反应结束控制在12℃。

4）PCR产物检测

①制胶：称取0.6gGel于烧杯中，加入TAE缓冲液40ml，浓度1.5%，微波炉加热，使其溶解，稍冷却后，倒入制胶盒内，室温冷却后即可使用。

②点样：在一次性手套上点样，有多少样品即点多少个点，另多加1个分子量为100-2000的2μlMarker，点样顺序先加ddH2O,3μl，再加6×Loadingbuffer，2μl，最后加样品DNA2μl。

③电泳跑胶：将制好的胶板，取下梳子，将点在一次性手套上的样，用移液器吸入点样胶孔内，放入电泳槽，稳压50-100Ｖ,电泳约20-30min。当观察到兰色6×Loadingbuffer跑到胶的中间时，停止电泳，取出，将胶放入BIO-RADGelDocTMEZImager2000凝胶成像系统紫外检测器里，进行检测并照相。每个反应重复两次，确定所得条带的可重复性。弱带的处理，将重复性好的弱带给预记录，重复性不好的弱带不给记录。

5）数据处理

记录扩增出的总条带数，不同迁移率带数。根据扩增条带的迁移率，同一迁移率，有条带的记为1，无条带的记为0，形成数据矩阵，按Nei's等,1979的方法，用Popgene32软件计算等位基因数，有效等位基因数，基因多样性指数，Shannon's信息指数（I），遗传一致度（I）遗，传距离（D），用UPGMA法聚类分析。

进一步地，所述步骤桑树品种的亲缘关系分析中采用的DNA分子标记方法为SSR方法。

采用SSR分子标记方法分析步骤如下：

1）取样

取样方法同ISSR分子标记方法一致

2）总DNA提取及浓度、纯度检测

同ISSR分子标记方法一致

3）引物筛选

对引物进行筛选，以多态性高，重复性好，清晰可见的引物作为PCR反应引物。

4）PCR反应

PCR总反应体系为10ul，其中30-50ng/μLDNA模板1μL，25mmol/LMgCl₂0．6ul2mmol/LdNTPs1uL，20μmol/L正反向引物混合工作液各0.8μL，0.5UDNA聚合酶，加ddH2O至10uL。

PCR反应程序为94℃预变性5min,94℃变性45s，55℃退火45s,72℃延伸60s,37个循环,72℃延伸5min，12℃保存。

5）PCR产物检测

PCR产物在48h内，取2μLPCR产物在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上恒电压850v电泳90min。电泳缓冲液为0.5×TBE,硝酸银染色。银染液为0.1%AgNO3溶液1L，显影液为16gNaOH，8mL37%甲醛，加去离子水定容到1L。终止液，为0.75%Na₂CO₃溶液1L。

银染程序为：（a）去离子水冲洗15s；（b）银染8min；（c）去离子水冲洗15s；（d）在显影液中轻摇至显带；（e）放入终止液，终止显影。显影完成之后，将聚丙烯酰胺凝胶放置在阴凉通风处3—4h，待完全干燥后，在透射式看片仪上自动获取数据。

6）数据分析

SSR扩增产物以0和1赋值建立数据矩阵，按Nei等的方法利用NTSYS2.10e软件进化分析，计算品种间的遗传相似系数和遗传距离，按类平均数聚类方法进行UPGMA聚类，桑树群体的遗传结构采用POPGENE3.2软件完成。

本发明与现有技术相比，具有的优点及有益效果为：

（1）本发明通过第一步进行系统发育分析，确定桑树品种样本亲缘关系大致框架后，再根据所要鉴定的桑树品种所在的框架，有目的的取材，再进行桑树品种居群遗传多样性分析，进一步确定品种的亲缘关系，通过两步骤分析方法的使用，克服了现有技术方法所带来的重复性差、准确性低等缺陷，进一步显著提高了评鉴桑树品种亲缘关系DNA分子的准确性。

（2）本法明通过对所鉴定品种第一步系统发育分析步骤中在世界范围内取材，第二步骤亲缘关系分析是在第一步骤分析的基础上，在所鉴定品种的系统位置取材，体现了桑树品种取材的合理性，亲缘关系鉴定更加准确。

（3）本发明建立了一种客观、准确的桑树品种亲缘关系DNA分子评鉴方法体系，为保护桑树品种资源，进行桑树品种指纹鉴别，分子辅助育种、品种资源开发及利用有重大的推动作用。

附图说明

图1是本发明所述桑树品种亲缘关系DNA分子评鉴方法的流程图；

图2是本发明实施例中钦州桑品种DNA分子亲缘关系系统发育进化关系分支图；

图3是本发明实施例中钦州桑品种DNA分子亲缘关系分析聚类图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此，在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。

实施例：

本实施例提供一种桑树品种亲缘关系DNA分子评鉴方法，本方法简单易行，取材合理，通过将桑树品种进行系统发育和亲缘关系两步骤进行系统分析，有效弥补了各自的缺点，适用范围广，提高了亲缘关系鉴定的准确性和可重复性。

本实施例以钦州桑为例，分析其亲缘关系，包括以下具体步骤，如图1所示。

1）取材

在取材上要取桑属的各个代表桑种，以确定钦州桑品种在桑属中的系统位置。取材如下：1、昆明白桑；2、浙江裂叶火桑；3、湖北罗田弯条桑；4、四川鬼桑；5、广东顺德荆桑；6、四川荥经川桑；7、神农架高海拔鸡桑；8、新疆和田黑桑；9、云南西双版纳毛叶奶桑；10、四川珙县川桑；11、四川长果桑；12、神农架神农山桑；13、雅安雅周桑；14、广东沙2×109；15、贵州蒙桑；16、广东轮教40；17、湖北来凤水桑；18、斯里兰卡桑；19、四川华桑；20、云南河口奶桑；21、广西钦州长果桑；22、广西鸡桑；23、云南华桑；24：越南白桑:25、广西环江1号；26、广西钦州桑；27、云南长穗桑；28、湖北利川长穗桑；29、湖北咸丰长穗桑；30、昆明植物园云南光叶桑；31：国家公园哥斯达黎加朴桑；32、巴西美洲桑；33、尼日利亚非洲桑；34、小石城赤桑；35、吉隆细齿桑；36、云南滇桑；37、重庆构树。

实验材料取自西南大学、云南、广西、湖北桑资源圃和昆明植物园，哥斯达黎加国家公园，安第斯山，非洲尼日利亚，阿肯色州小石城，西藏吉隆，部分材料为野外考察获得，经鉴定无误后采集。

2）对比序列

核rDNA内转录间隔区ITS,5SrRNA基因间隔区NTS,26S-18SrRNA基因间隔区IGS序列

3）钦州桑品种DNA提取及浓度、纯度检测及复核

取0.15g硅胶干燥桑叶采用4倍CTAB提取液进行DNA提取。

DNA提取流程

①取2ml离心管，放入离心管架，在离心管中加入0.15g桑叶粉末样品（桑叶粉应放入乳钵中，加石英砂研磨细）；②往离心管中加入900μl，4×CTAB提取液（提取液中已有β-巯基乙醇，不需要再加，如果没有就加10μl），加后充分混匀；③振荡混匀后，65℃水浴1小时，最先5min取出摇匀一次，以后每10min取出摇匀；④水浴完成后，取出冷至室温，加24:1氯仿：异戊醇900μl，混匀，12000转/分，离心10min，取上清液（重复一次）；⑤上清液移入1.5ml离心管，加异丙醇(-20℃保存)600μl，轻倒转摇匀，放入4-20℃保存30-60min；⑥冰箱取出12000转离心5min，此时能看见离心管底部有白色沉淀；倒掉异丙醇，吸水纸吸干离心管口，用75%乙醇(-20℃保存)500μl洗涤一次，再用无水乙醇（-20℃保存)300μl洗涤一次，倒掉无水乙醇，将离心管倒置吸水纸上放置15min，除尽乙醇。⑦加50μlSDW溶解沉淀，溶解时用手指弹离心管底部，促使白色沉淀溶解；⑧加2μlRNA酶，伸入，弹，使其混匀，37℃恒温金属浴30min；取出加10μl，3MNaAC，弹，使其混匀，再加120μl无水乙醇，-20℃保存30min；⑨12000转离心5min，此时DNA已附在离心管底部管壁，轻轻倒掉液体，吸水纸吸干离心管口，用500μl，75%乙醇洗一次，再用300μl，无水乙醇洗一次，倒掉无水乙醇，倒置凉干；⑩37℃温干，此时离心管底部管壁应发白，加50-70ulSDW使其溶解，-20℃保存备用。

DNA浓度和纯度检测流程

提取后的桑树基因组DNA采用1%琼脂糖凝胶电泳，λDNA/HindⅢmarker在BIO-RADGelDocTMEZImager2000凝胶成像系统紫外分光核酸测定仪测定DNA的浓度及纯度，并用Nanodrop2000微量紫外分光光度计自动计算复核。

复核流程

用Nanodrop2000微量紫外分光光度计自动计算，在260、280nm波长处的紫外吸光度(A)值及DNA纯度和浓度，A260/A280值在1.8-2.0纯度符合要求，浓度在10ng/μl以上符合要求。

4）PCR扩增

PCR扩增反应总体积20μL，其中含10ngDNA模板，50ng正反向引物，2.5mM的dNTPs，10×PCRBuffer和5UTaqDNA聚合酶。扩增程序为94℃预变性，4min；每个循环94℃1min，55℃1min，72℃1min，共33个循环，72℃延伸7min，反应结束控制在12℃。扩增引物参照Whiteetal1990略加调整，由上海生工测序部合成，引物如下：ITS5：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG，ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC。

5）PCR产物检测

采用1.5%GEL进行PCR产物检测。

6）PCR测序

扩增产物用MicroconYM100柱纯化，并调整DNA浓度，上海生工测序部ABIPrism3730自动测序仪测序。测序试剂为BigDyeterminatorv3.1，PCR反应引物作测序引物,双脱氧终止法终端荧光标记测定ITS正、反向序列。

7）序列拼接、对比，鉴定进化关系

测序结果用Sequencher4.1.4软件拼接，对少数误判碱基，根据碱基峰形更正。用Clustalx1.83c软件序列对比，并依据核rDNA内转录间隔区ITS,5SrRNA基因间隔区NTS,26S-18SrRNA基因间隔区IGS序列确定序列范围，用Bioedit软件除去两端非ITS部分。用ModeltestV3.06和PAUPVersion4.0b10软件进行碱基替换模型计算，基于模型用PAUPVersion4.0b10MP法或mrbayes软件分析系统进化关系。得到如图2。

可知，钦州桑分在第一支，与裂叶火桑，高海拔鸡桑，贵州蒙桑，雅周桑，轮教40，四川鬼桑，广西鸡桑，斯里兰卡桑，来凤水桑，湖北弯条桑，广东荆桑，越南白桑，沙2×109，神农山桑，昆明白桑，小石城赤桑，滇桑，利川长穗桑，咸丰长穗桑，云南长穗桑有较近的亲缘关系。

（2）桑树品种的亲缘关系分析

1）取材

由于所要鉴定的桑树品种为广西的桑树品种，尽量多选广西的桑树品种。本实施例采用ISSR方法。材料选取如下：

ISSR分析供试桑品种资源材料的名称及来源：1、栽培类型灵山县灵太3号；2、栽培类型罗田县湖北弯条桑；3、栽培类型昆明白桑；4、栽培类型南宁市邕新3号；5、栽培类型南宁市刘圩2号；6、南宁市那陈2号；7、南宁市池塘1号；8、钦州市那学8号；9、小石城小石城赤桑；10、野生类型来凤水桑；11、栽培类型南宁市邕新11号；12、栽培类型轮教40；13、栽培类型灵山县太平2号；14、栽培类型钦州市大寺特号；15、栽培类型灵山县冯屋5号；16、栽培类型平乐县沙油4号；17、栽培类型灵山县太平新1号；18、栽培类型恭城县恭城4号；19、栽培类型钦州市板朝1号；20、栽培类型钦州市那学14号；21、栽培类型钦州市板屯车2号；22、栽培类型恭城县恭同9号；23、栽培类型钦州市大寺5号；24、栽培类型南宁市池塘4号；25、栽培类型广东沙2×109；26、栽培类型浙江裂叶火桑；27、栽培类型恭城县恭同4号；28、栽培类型钦州市板罗1号；29、栽培类型北海市涠盛4号；30、栽培类型灵山县灵太1号；31、栽培类型斯里兰卡桑；32、野生类型凤山县广西鸡桑；33、野生类型大新县越南白桑；34、栽培类型广东顺德广东荆桑；35、野生类型神农架神农山桑；36、野生类型雅安市雅周桑；37、栽培类型钦州市钦州桑；38、野生类型北海市涠州岛白桑；39、野生类型利川市利川长穗桑；40、野生类型昆明市滇桑；41、野生类型隆林县隆林蒙桑；42、野生类型四川鬼桑。

2）DNA提取及浓度、纯度检测及复核

3）筛选引物

ID:1(AG)6TA；ID:2(AG)8TA；ID:3(AG)6GC,ID:4(AG)6TC；ID:5(AG)7TCID:6(AG)8TC；ID:7(AG)8YT；ID:8(AG)8YC；ID:9(AG)8S；ID:10(AC)8YT；ID:11(AC)6T；ID:11(AC)6T；ID:12(AC)8T；ID:13(AC)8C；ID:14(AC)8YT；ID:15(ATT)6；ID:16(CT)8G；ID:17(CT)6GC；ID:18(CT)8GC；ID:19(CT)6RC；ID:20(CT)6AC；ID:21(CT)8AC；ID:22(CT)6TG；ID:23(CT)8TG；ID:24(CT)8TC；ID:25(CT)6CC；ID:26(CT)8CC；ID:27(CT)8RT；ID:28(CA)8A；ID:29(CA)8RT；ID:30(CGA)6GG；ID:31(GT)6CG；ID:32(GT)6CC；ID:33(GTG)6；ID:34（GTC）6；ID:35（GTGC）4；ID:36(GA)6GG；ID:37(GAG)4GC；ID:38(GAGT)4；ID:39(GACA)4；ID:40(GCGT)4；ID:41(TG)6GT；ID:42(TG)8GT。

4）PCR反应及产物检测

ISSR扩增反应在GeneCompanyLimitedPCR仪上进行，反应总体积20μl，其中含模板1.0μl（25ng/μl）、10×PCRbuffer2.0μl、引物1μl（50ng/μl）、Mg²⁺2μl（2.5mM）、dNTPs2μl（2.5mM）、Ex-taq0.3μl（5U/μl），用ddH₂O补至25μl，最后加矿物油一滴。扩增程序为94℃预变性5min；94℃变性60s；50℃退火40s；72℃延伸90s；40个循环，72℃延伸10min，反应结束控制在12℃。

PCR反应产物经1.5%琼脂糖电泳，电压为110V(4V/cm，稳压)电泳约30min，溴化乙锭染色10min，在BIO-RADGelDocTMEZImager2000凝胶成像系统扫描记录。每个反应重复两次，确定所得条带的可重复性。弱带的处理，将重复性好的弱带给预记录，重复性不好的弱带不给记录。

5）数据分析

记录扩增出的总条带数，不同迁移率带数。根据扩增条带的迁移率，同一迁移率，有条带的记为1，无条带的记为0，形成数据矩阵，按Nei's等,1979的方法，用Popgene32软件，UPGMA法聚类分析。

分析结果：2个DNA样品对42个引物筛选，选出条带多且清晰的如下11个引物用于ISSR实验。

ID:2(AG)8TA；ID:5(AG)7TC；ID:6(AG)8TC；ID:7(AG)8YT；ID:8(AG)8YC；ID:10(AC)8YT；ID:12(AC)8T；ID:24(CT)8TC；ID:32(GT)6CC；ID:37(GAG)4GC；ID:42(TG)8GT。

11个引物，42个样品，PCR共扩增出迁移率（分子量）不同的DNA带92条，2号引物最多为12条，42号引物最少6条，平均每个引物8.36条，最长2200bp，最短200bp。

聚类分析：将ISSR扩增反应有条带的记为1，无条带的记为0，形成数据矩阵，根据遗传距离，输入popgen32软件，按Nei's，1978邻接法，UPGMA聚类，得聚类图图3。

从聚类图可知，钦州桑与越南白桑、广东荆桑、涠州岛白桑、神农山桑有较近的亲缘关系，与广西的许多桑树品种亲缘关系较远，而与一些野生桑亲缘关系近，是桑品种中很特殊的一个品种。

通过系统发育分析确定大致亲缘关系框架，再通过DNA分子标记方法对在确定亲缘关系的基础上进行分析，提高了鉴定钦州桑亲缘关系的准确性和重复性，克服了现有技术方法鉴定亲缘关系准确性差、适用范围窄等缺陷，本发明方法对于桑树品种资源的保存、品种资源的开发和利用有重大推动作用，同时也为蚕桑产业的快速发展做出突出性贡献。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种桑树品种亲缘关系DNA分子评鉴方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）桑树品种的系统发育分析：

1）取材:通过在世界范围内分布的桑种、变种及不同生态类型选材；

2）筛选比对序列；

3）桑树基因组DNA提取及浓度、纯度检测：经硅胶干燥处理后的桑树品种样本0.10—0.20g，通过4倍CTAB提取液提取获得桑树基因组DNA并进行浓度、纯度检测及复核；

4）PCR扩增；

5）PCR产物检测；

6）PCR产物测序；

7）序列拼接、比对，鉴定进化关系：测序结果用Sequencher4.1.4软件拼接，对少数误判碱基，根据碱基峰形更正，用Clustalx1.83c软件序列比对，并依据GenBank的核rDNA内转录间隔区ITS序列确定序列范围，用Bioedit软件除去两端非ITS部分，DNAstar软件分析各序列长度、G+C含量及变异位点，同源性及遗传分歧，用ModeltestV3.06和PAUPVersion4.0b10软件进行碱基替换模型计算，基于模型用PAUPVersion4.0b10MP法或mrbayes软件分析系统进化关系；

（2）桑树品种的亲缘关系分析：

2.根据权利要求1所述的一种桑树品种亲缘关系DNA分子评鉴方法，其特征在于：所述步骤2）中比对序列为核rDNA内转录间隔区ITS。

3.根据权利要求1所述的一种桑树品种亲缘关系DNA分子评鉴方法，其特征在于：所述步骤3）中干燥桑树品种样本的称取量为0.15g。

4.根据权利要求1所述的一种桑树品种亲缘关系DNA分子评鉴方法，其特征在于：所述步骤4）PCR扩增反应引物为核rDNA内转录间隔区ITS。

5.根据权利要求4所述的一种桑树品种亲缘关系DNA分子评鉴方法，其特征在于：所述步骤4）PCR扩增反应程序为94℃预变性4min，94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1min、每个循环94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1min共33个循环，72℃延伸7min，反应结束控制在12℃。

6.根据权利要求1所述的一种桑树品种亲缘关系DNA分子评鉴方法，其特征在于：所述步骤2）中所用比对序列为转录组测序。

7.根据权利要求1所述的一种桑树品种亲缘关系DNA分子评鉴方法，其特征在于：所述步骤2）中所用比对序列为全基因组测序。

8.根据权利要求1所述的一种桑树品种亲缘关系DNA分子评鉴方法，其特征在于：所述步骤（2）DNA分子标记方法为ISSR方法或SSR方法。