CN103031382A - 食品及饲料中貂源性成分实时荧光pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种貂源性成分检测用引物与探针、其使用方法及应用。该方法针对貂线粒体细胞色素b基因，设计了貂cytochrome b gene基因的检测用引物和探针，采用实时荧光PCR法对食品及饲料中貂成分的定性检测。本发明所研制的食品及饲料中貂成分的实时荧光PCR法定性检测方法、对提高食品中貂源性成份的检测效率及灵敏度，降低检测成本，检测市场上相关假冒产品，进行食品安全监测和提高检验检疫技术具有重要意义。具有广阔发展前景。

Description

食品及饲料中貂源性成分实时荧光PCR检测方法

技术领域

本发明属于食品质量控制领域，具体涉及一种食品及饲料中貂源性成分检测方法及其应用。

背景技术

貂在中国主要产于东北地区，有多个品种，属珍贵毛皮动物。主要包括紫貂、黄喉貂、日本貂等。在我国的皮毛养殖场中，水貂是主要的养殖品种，水貂在动物分类学上属于哺乳纲、食肉目、鼬科、鼬属的小型珍贵毛皮动物。在野生状态下，有美洲水貂（M.vison）和欧洲水貂（M.lutreola）两种。现在世界各国人工饲养的均为美欧水貂的后代，我国主要养殖为美洲水貂的后代。

近年来，很多饲养场人工饲养貂以获取其毛皮，剩下的貂肉常被不法商贩以低价收购。每年深秋貂大量上市时，一些人便收购貂肉冰存，不断有媒体曝光，一些厂家所售卖的牛羊肉卷或狗肉等，其价格明显比商场里的要低很多，甚至比成本价还低。实际上是一些不法商家由于某些食用肉类的成本较高，为了多赚钱，便会用貂肉等原料冒充成本较高的肉销售欺骗消费者，向低价肉中掺有廉价的貂肉和貂肉。由于国家没有针对羊肉卷这种食品制定生产标准，质监面临无法可依的窘境。也尚无权威的鉴定机构可以对羊肉卷进行鉴定。

以貂肉冒充高成本肉，卖貂肉，使得貂被作为食物流入市场，则涉及的是食品安全的问题。

由于人们对食品的安全卫生特别重视，食品卫生指标尤其是肉食品中是否掺入貂肉等原料的真伪鉴定就显得特别重要。为了尽量减轻假肉产品的不良影响，力求避免人民的合法利益受到侵害，或以貂肉冒充其他成本较高的肉类，而造成更加不利的影响。由此，急需一种食品及饲料中貂源性成分简便、快速的检测方法。目前我国在食品及饲料中貂源性成分检测方法仍是个空白，在保证方法稳定性、特异性等方面存在很多困难，这也是制约方法建立的瓶颈。

发明内容

为了解决上述实际问题，本发明建立了一种食品中貂源性成分检测方法研究，进行肉制品掺假检测技术研究。采用TaqMan探针技术，能够对食品中掺杂的貂源性成份进行鉴定。该标准的研制成功及推广应用对提高进出口食品及饲料中的貂源性成份的检测效率及灵敏度，降低检测成本，检测市场上相关假冒产品，进行食品安全监测和提高检验检疫技术具有重要意义。

本发明从以下几个方面研究：提取样品DNA，以DNA为模板，分别采用貂成分的特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增，直接读取实时荧光PCR的增幅现象，进行食品和原料中貂源及其制品的鉴伪检测等，在此基础上，进行了特异性和稳定性检测；

本发明的具体技术方案如下：

本发明所述的貂，是指哺乳动物，属哺乳纲，食肉目，鼬科（Mustelidae），鼬亚科（Mustelinae），貂属（Martes）。包括水貂、紫貂、日本貂、黄喉貂等，体细长，色黄或紫黑。

本发明的一方面在于：公开貂源成分检测用引物与探针，其包括以下碱基序列：

线粒体细胞色素b基因cytochrome bgene（Cyt b gene）在生物细胞内高度保守并且在大多数情况下持续表达，Cyt b gene常做为物种鉴定基因。

①水貂源性成分检测引物和探针的设计：

通过GenBank的Blast功能寻找水貂细胞色素b基因（Genebank登录号GQ153579.1）的同源基因，可见该基因具有很高的种属特异性，其他基因与该基因的同源性很小。

②紫貂、日本貂、黄喉貂源性成分检测引物和探针的设计：

通过GenBank的Blast功能寻找三种貂的细胞色素b基因（黄喉貂：Genebank登录号NC-012141；紫貂：Genebank登录号NC-011579；日本貂：Genebank登录号NC-009678）的同源基因。发现与鼬的基因序列同源性很高，本方法采用LNA修饰的碱基标注与鼬的差别序列，合成LNA探针，保证所设计的探针序列可以特异性的检测出三种貂。

据此设计了本发明用于检测的貂源性成分的检测引物和探针如下：

上述引物和探针由宝生物工程(大连)有限公司合成；利用上述2对引物和探针能够检测出常见貂源性成分；

本发明的另一方面在于：一种貂源成分检测试剂盒，其包括上文所述的貂源成分检测用引物与探针。

本试剂盒中还可以包括阳性对照、阴性对照、空白对照。其中，阳性对照可以选择貂肉提取的DNA，内参照可以选择真核生物18SrRNA基因DNA，阴性对照可以选择不含有貂源成分样品提取的DNA，空白对照可以选择灭菌水，也可以每组各设置两个或多个平行的反应体系。其中，

质量控制标准为：以下条件有一条不满足时，实验视为无效：

(a)空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值＞40.0。

(b)阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值＞40.0。

(c)阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0。

(d)内参照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0

结果判定标准为：在符合质量控制标准的情况下，被检样品进行检测时：如Ct值≤35.0，则判定为被检样品阳性。如Ct值≥40.0，则判定为被检样品阴性。如35.0＜Ct值＜40.0，则重复一次。如再次扩增后Ct值仍为＜40.0，则判定被检样品阳性；如再次扩增后Ct值≥40.0，则判定被检样品阴性。

本发明的另一方面在于：一种貂源及其制品的实时荧光PCR鉴伪方法，其利用上文所述的引物与探针，对样品DNA进行实时荧光PCR方法检测。

对于上文所述的貂源及其制品的实时荧光PCR鉴伪方法，所述的实时荧光PCR方法较优的选择如下：

①实时荧光PCR反应体系：

反应体系总体积为25μL，其中：

②实时荧光PCR反应参数：95℃，10s，1个循环；95℃，5s；52℃，10s；72℃，34s；40个循环。

对于上文所述的貂源及其制品的实时荧光PCR鉴伪方法，具体的，所述的样品DNA的制备方法如下：

①称取300mg已制备好的样品于2mL离心管中，加入1.5mL CTAB缓冲液（55mmol/LCTAB，1400mmol/LNaCl，20mmol/L EDTA，100mmo1/L Tris，用10%盐酸调pH至8.0，121℃，高压灭菌20min，备用。）和10μL浓度为20mg/μL蛋白酶K，65℃30min振荡混匀；12000r/min离心5min，吸取上清液至一新离心管中，加400μL的体积比为24：1的三氯甲烷：异戊醇，充分混匀；

②12000r/min离心5min，吸取上清液至一新离心管中，加入0.8倍体积异丙醇，室温下沉淀1～2h；

③12000r/min离心10min，弃上清液；70%乙醇洗涤一次，晾干；加入50μL TE，溶解DNA沉淀；

④DNA浓度和纯度的测定：取步骤③获得的DNA溶液加水稀释，至浓度为10μg/mL～100μg/mL，A260/A280比值在1.7~1.9之间，备用。

通过以上技术方案，本发明最后确定所述方法对貂源成分的最低检出限（LOD）为10mg/kg。从而本发明不仅提供了一套特异性良好的引物和探针，还建立了对食品和饲料中貂源及其制品鉴伪的定性检测方法。必定利于鉴定貂源食品真伪工作的开展，具有广泛的应用价值，还能对我国相关食品的国际贸易起到积极的作用。

有益效果

本发明所述方法具有良好的稳定性和特异性，检测精度达到10mg/kg，方法简单，检验时间短，易于推广。

本发明所述方法能够实时监测反应进程，无需电泳，闭管操作，能够避免样品中受到操作人员和环境的污染等；并能够对结果进行快速判定。

附图说明

图1内参照基因实时PCR检测结果图；

图2水貂源性成分检测结果图；其中：1.水貂毛2.水貂肉3-4阴性对照、空白对照；

图3紫貂、日本貂、黄喉貂源性成分检测结果图；其中：1.紫貂毛2.紫貂肉；

3.日本貂毛；4.黄喉貂毛；5-6阴性对照、空白对照；

图4水貂源性成分特异性检测部分结果；1.水貂毛2.水貂肉；3-24对照表2中其它阴性结果、阴性对照、空白对照；

图5紫貂、日本貂、黄喉貂源性成分特异性检测结果；其中：1.紫貂毛2紫貂肉3黄喉貂毛4黄喉貂血5日本貂毛6日本貂血7-24对照表3中其它阴性结果、阴性对照、空白对照；

图6貂源性成分添加实验灵敏度检测结果；其中，1.200mg/kg2.100mg/kg3.50mg/kg4.20mg/kg5.10mg/kg6.空白对照。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

（一）待测样品：检验过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以貂成分样品提取的DNA为阳性对照，以已知不含有貂源成分的样品提取的DNA为阴性对照，以灭菌水为空白对照，每组各设置两个平行的反应体系。

（二）检测方法

（1）DNA提取

下述DNA提取方法，均为本领域技术人员的常规操作，所有试剂及溶液均为常规途径制备或者由商业途径获得。

①称取300mg已制备好的样品于2mL离心管中，加入1.5mL CTAB缓冲液（55mmol/L CTAB，1400mmol/L NaCl，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris，用10%盐酸调pH至8.0，121℃，高压灭菌20min，备用。）和10μL蛋白酶K（20mg/μL），振荡混匀，65℃30min，期间每隔10min振荡混匀；12000r/min离心5min，吸取上清液至一新离心管中，加400μL三氯甲烷：异戊醇（24：1），充分混匀；

②12000r/min离心5min，吸取上清液至一新离心管中，加入0.8倍体积异丙醇，室温下沉淀1～2h；

③12000r/min离心10min，弃上清液；70%乙醇洗涤一次，晾干；加入50μL TE，溶解DNA沉淀。

④DNA浓度和纯度的测定：

取适量DNA溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的吸收值。当浓度为10μg/mL~100μg/mL，A260/A280比值在1.7~1.9之间时，适宜于实时荧光PCR扩增。

（2）实时荧光PCR检测

①引物信息：

扩增引物和探针：由宝生物工程(大连)有限公司合成；

貂源性成分（线粒体细胞色素b基因cytochrome b gene）扩增引物和探针（为方便描述以下简称貂源性引物/探针），真核生物18SrRNA基因内参照引物和探针（为方便描述以下简称内参照引物/探针）详见表1。

其中：真核生物18SrRNA基因内参照的选取：貂属于真核生物。真核生物18SrRNA基因因为表达保守的基因，常在国家标准、ISO标准、各文献中作为真核生物PCR反应检测的内参照基因，用以验证实验是否有效。

基因序列对应Genebank的登陆号：AB743827.1。

表1试验用引物和探针

其中：FAM（Carboxyfluorescein，羧基荧光素）、TAMRA（Carboxytetramethylrhodamine，羧基四甲基罗丹明）；

②实时荧光PCR反应体系：

反应体系总体积为25μL，其中含：样品DNA（10μg/mL-100μg/mL）2μL，引物（10μmol/L）各1μL，探针（5μmol/L）各1μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，dNTP（10μmol/L）1μL，10×PCR缓冲液2.5μL，水16μL。

按照上述体系，分别以表1中所示引物和探针，分别对步骤①提取的貂源性样品DNA、真核生物内参照的DNA、阴性对照及空白对照进行实时荧光PCR反应。

③实时荧光PCR反应参数：95℃，10s，1个循环；95℃，5s，52℃，10s，72℃，34s，40个循环。

检测仪器：ABI7500实时荧光PCR仪，美国ABI公司；实验结果以附图说明中图谱形式输出。

（3）质量控制标准

以下条件有一条不满足时，实验视为无效：

(a)空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值＞40.0。

(b)阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值＞40.0。

(c)阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0。

(d)内参照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0

（4）结果判定

与物种鉴定检测国标、转基因检测等实时荧光PCR国标对结果判断的标准一致，本实验在符合质量控制的情况下，被检样品进行检测时：同样设置40个循环，Ct值即为循环数。如果Ct值≤35.0，表明样品在经过35个循环以内的扩增，即检测到扩增曲线，则判定为被检样品阳性。如Ct值≥40.0，表明样品经过40个循环扩增，仍没有扩增曲线，则判定为被检样品阴性。如35.0＜Ct值＜40.0，在此之间结果为可疑结果，则重复一次。如再次扩增后Ct值仍为＜40.0，则判定被检样品阳性；如再次扩增后Ct值≥40.0，则判定被检样品阴性。

实时荧光PCR检测结果：

内参照基因检测结果如图1，其中横坐标代表Ct值（Threshold Cycle，荧光域值）每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数称为Ct值。纵坐标代表OD值（opticaldensity，光密度）表示被检测物吸收掉的光密度；曲线代表荧光扩增曲线，内参照基因实时PCR检测结果图所示：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0，检测结果为阳性。

实时PCR法检测貂源性成分基因结果如图2～5所示：其中紫貂毛及肉、黄喉貂毛及血、日本貂毛及血、水貂毛及肉样品来源分别为大连市森林动物园、大连种貂养殖场、大连皮毛动物养殖基地，检测结果：

图2水貂源性成分检测结果图；其中：1.水貂毛2.水貂肉；图3紫貂、日本貂、黄喉貂源性成分检测结果图；其中：1.紫貂毛2.紫貂肉；3.日本貂毛；4.黄喉貂毛；图2~3的样品分别出现荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0，证明检测结果为阳性。

实施例2特异性试验

采用本标准方法检测样品（样品详单见表2~3），样品来源分别为大连市森林动物园、大连种貂养殖场、大连皮毛动物养殖基地、以及大连市各大超市和市场等，包括：紫貂毛及肉、黄喉貂毛及血、日本貂毛及血、水貂毛及肉、狐狸肉、猫肉及毛、黄鼠狼毛，马肉、驴肉、狗肉、羊肉、牛肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、鹌鹑肉、虎、狼、豹等近种或非近种DNA样品。

貂源性成分特异性检测部分结果如图4-5和表2~3所示。

表2水貂源性成分检测特异性试验结果

序号	样品名称	试验结果	序号	样品名称	试验结果
						1	水貂毛	+	12	马肉	-
2	水貂肉	+	13	驴肉	-
						3	黄喉貂毛	-	14	狗肉	-
4	日本貂毛	-	15	羊肉	-

5	紫貂毛	-	16	牛肉	-
						6	紫貂肉	-	17	猪肉	-
7	狐狸肉	-	18	鸡肉	-
						8	猫毛	-	19	鸭肉	-
9	黄鼠狼毛	-	20	鹅肉	-
						10	鹌鹑肉	-	21	豹血	-
11	虎血	-	22	狼毛	-

表3紫貂、日本貂、黄喉貂源性成分检测特异性试验结果

序号	样品名称	试验结果	序号	样品名称	试验结果
						1	紫貂毛	+	12	马肉	-
2	紫貂肉	+	13	驴肉	-
						3	黄喉貂毛	+	14	狗肉	-
4	黄喉貂血	+	15	羊肉	-
						5	日本貂毛	+	16	牛肉	-
6	日本貂血	+	17	猪肉	-
						7	狐狸肉	-	18	鸡肉	-
8	猫毛	-	19	鸭肉	-
						9	黄鼠狼毛	-	20	水貂肉	-

10	水貂毛	-	21	豹血	-
						11	虎血	-	22	狼毛	-

采用实施例1所述引物和探针分别检测表2~3中所列出的样品，根据实施例1所述的结果判定标准，对扩增曲线进行判定；表2~3貂源性成分特异性检测结果，其中引物SEQ ID NO：1、2、3对图4中1.水貂毛2.水貂肉具有特异性扩增，分别出现荧光曲线增幅现象，检测结果为阳性。而引物SEQ ID NO：4、5、6对图5中：1.紫貂毛2紫貂肉3黄喉貂毛4黄喉貂血5日本貂毛6日本貂血，分别出现荧光曲线增幅现象，检测结果为阳性。对照表2中3-22，表3中7-22其它阴性结果，所对应的狗等非目标基因检测结果显示，非目的基因均无荧光信号检出，检测结果均为阴性。

由上述实验结果可见，该标准方法具有很好的特异性。

实施例3检测灵敏度及添加试验

以羊肉为基质做添加试验。分别取貂肉和羊肉样品在绞肉机绞碎后，把貂肉糜添加至羊肉糜中混匀，先形成10％的添加样品。以此比例添加至新的羊肉糜中直至分别形成含貂肉200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg、20mg/kg、10mg/kg共5个梯度的添加样品。在添加过程中充分混匀，保证样品在羊肉中均匀散布。

根据实施例1所述的结果判定标准，对扩增曲线进行判定；添加试验结果：如图6貂源性成分添加实验灵敏度检测结果显示，以羊肉作为加工产品基质，分别添加貂肉，制成添加浓度分别为200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg、20mg/kg、10mg/kg（对应图6中的1.200mg/kg、2.100mg/kg、3.50mg/kg、4.20mg/kg、5.10mg/kg），分别按实施例1所述方法，提取各浓度添加样品的DNA，经实施例1所述的实时荧光PCR方法检测，从图6的结果可知，1~5不同浓度的各个样品，均分别出现荧光曲线增幅现象，检测结果均为阳性，证明检测灵敏度可达到10mg/kg。

实施例4方法的应用

选取实际检测样品，样品来源为检验检疫进出口送检样品，从大连市内各超市、市场、烧烤摊等处采购的肉制品等，采用本发明实施例1所述方法检测貂源性成分，根据实施例1所述的结果判定标准，对扩增曲线进行判定；样品名称及结果如表4。

表4实际样品检测结果

由以上检测结果可见，运用本标准方法检测实际样品共432份。其中检测貂肉、生羊肉卷、羊肉串、羊肉片、狗肉、驴肉、牛肉等生制品196份，检测出含有貂肉成分样品14份，其中有14份样品含有貂肉成分但没有标注，为假冒产品；检测羊肉串、狗肉等熟制品157份，检测出含有貂肉成分样品16份，其中有16份样品含有貂肉成分但没有标注，为假冒产品；检测鱼肠、腊肠、火腿、火腿肠等熟食品79份，检测出含有貂肉成分样品4份，其中有4份样品含有貂肉成分但没有标注，为假冒产品；由大量的实际应用结果可见，本标准方法检测食品中貂源性成分具有很好适用性。可用以满足食品鉴伪的要求。

Claims (5)

1.貂源性成分检测用引物与探针，其特征在于，包括以下碱基序列：

紫貂、日本貂、黄喉貂源性成分检测引物和探针：

上游引物：  SEQ IDNO：1

下游引物：  SEQ ID NO：2

探针：      SEQ ID NO：3

水貂源性成分检测引物和探针：

上游引物：  SEQ IDNO：4

下游引物：  SEQ IDNO：5

探针：      SEQ ID NO：6。

2.一种貂源性成分检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述貂源性成分检测用引物与探针SEQ ID NO：1~6。

3.一种貂源性及其制品的实时荧光PCR鉴伪方法，其特征在于：利用权利要求1所述的引物与探针SEQ ID NO：1~6，对样品DNA进行实时荧光PCR方法检测。

4.根据权利要求3所述的貂源性及其制品的实时荧光PCR鉴伪方法，其特征在于：利用权利要求1所述的引物SEQ ID NO：1~6，分别对样品按下述方法进行实时荧光PCR检测：

①实时荧光PCR反应体系：

反应体系总体积为25μL，其中：

②实时荧光PCR反应参数：95℃，10s，1个循环；95℃，5s；52℃，10s；72℃，34s；40个循环。

5.根据权利要求3所述的貂源性及其制品的实时荧光PCR鉴伪方法，其特征在于：所述的样品DNA的制备方法如下：

①称取300mg已制备好的样品于2mL离心管中，加入1.5mL CTAB缓冲液和10μL浓度为20mg/μL蛋白酶K，65℃30min振荡混匀；12000r/min离心5min，吸取上清液至一新离心管中，加400μL的体积比为24：1的三氯甲烷：异戊醇，充分混匀；

②12000r/min离心5min，吸取上清液至一新离心管中，加入0.8倍体积异丙醇，室温下沉淀1～2h；

③12000r/min离心10min，弃上清液；70%乙醇洗涤一次，晾干；加入50μL TE，溶解DNA沉淀；

④DNA浓度和纯度的测定：取步骤③获得的DNA溶液加水稀释，至浓度为10~100μg/mL，A260/A280比值1.7~1.9之间，备用。

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