CN105018621A - 一种利用实时荧光定量pcr技术检测花生及制品中黄曲霉毒素潜在污染风险的方法 - Google Patents

一种利用实时荧光定量pcr技术检测花生及制品中黄曲霉毒素潜在污染风险的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用实时荧光定量PCR技术检测花生及制品中黄曲霉毒素潜在污染风险的方法，该方法利用四分法采集样品，利用氯化苄法提取DNA，以黄曲霉菌产毒关键基因AFLR为目标基因，设计特异性引物进行荧光定量PCR，根据荧光定量Ct值判断样品受黄曲霉毒素污染的风险，并建立的黄曲霉毒素污染风险与样品荧光定量Ct值的关系模型，本发明为了快速、准确地判断花生及其制品中黄曲霉毒素潜在污染风险，本发明特异性强，稳定性好，灵敏度高，操作简单快速，适合大批量检测。

Description

一种利用实时荧光定量PCR技术检测花生及制品中黄曲霉毒素潜在污染风险的方法
技术领域
本发明涉及一种利用实时荧光定量PCR技术检测花生及制品中黄曲霉毒素潜在污染风险的方法，属于食品安全与检测领域。
背景技术
花生在中国的种植面积为500万公顷，年产量为1400万吨，占世界花生总产量的40％以上，居世界第一位，是我国重要的经济作物之一。目前我国花生及其制品中黄曲霉毒素污染水平已达到了23～500μg/kg，大大超出了国家标准的规定限值，严重影响着花生制品的食用安全性和国际贸易，黄曲霉毒素污染已成为制约花生产业发展和食用安全的最大限制因子。花生黄曲霉毒素污染严重，其主要原因是花生在收获、加工、运输、贮藏过程中很容易受到黄曲霉菌的侵染而产生黄曲霉毒素，造成花生黄曲霉毒素污染超标。开发快速、灵敏的黄曲霉毒素产生菌株检测方法，用于花生原料和加工过程中的检验可避免或减少黄曲霉素污染风险。
花生及制品中黄曲霉毒素潜在的污染风险主要来源于黄曲霉毒素产生菌，判断其存在的潜在污染风险主要是看样品中是否含有黄曲霉毒素产生菌，而黄曲霉毒素产生菌的检测目前主要是通过形态观察和生理分析，形态观察主要是个体形态和菌落特征，生理分析主要分析培养条件以及产生毒素的种类。这些常规方法易受到实验仪器和实验环境的干扰，从而影响鉴定结果，且鉴定花费的时间也较长。近年来，随着分子生物学领域的快速发展，越来越多的学者开始利用分子生物学手段对某一未知菌进行鉴定及分类研究。普通PCR存在操作步骤繁琐、容易造成污染、难以准确定量检测不足，而荧光定量PCR方法是在传统PCR基础上发展起来的分子生物学检测技术，具有重复性好、特异性强、敏感性高和易操作等优点。
黄曲霉毒素的生物合成过程非常复杂，共涉及到21步酶促反应。迄今为止，大部分与黄曲霉毒素及其前体柄曲霉素(sterigmatocystin,ST)生物合成相关的酶促反应已为人们所认识，这些酶的编码基因也相继被克隆。参与黄曲霉毒素合成的绝大多数基因聚集于某特定基因簇中，其中包括黄曲霉毒素生物合成途径调节基因(aflatoxin biosynthetic pathway regulatorygene,aflR)，该基因为其他参与黄曲霉毒素合成的基因表达所必需。
发明专利(201210584285.9)公布了一种利用多重PCR技术分析花生粕中黄曲霉毒素B1产生趋势的方法，通过条带的丰富度来确定黄曲霉毒素B1产生趋势，该专利通过条带的丰富度来判断黄曲霉毒素B1产生趋势，存在判断标准不精确，无法进行定量判断的缺点。
发明内容
为了准确快速地判断花生及其制品黄曲霉毒素潜在污染风险，为花生及制品的食品安全提供技术支撑，本发明提供了一种利用实时荧光定量PCR技术检测花生及制品中黄曲霉毒素潜在污染风险的方法，利用荧光定量PCR技术、通过黄曲霉毒素合成关键基因的特异性引物进行检测，建立了黄曲霉毒素污染风险与荧光定量Ct值的关系模型。
为达到上述目的本发明所采用的技术方案包括步骤：
(1)基因组DNA的提取：采用四分法采集花生样品0.1g，采用氯化苄法提取DNA，得到粗DNA后，用DNA纯化试剂盒纯化后，用核酸蛋白定量仪检测浓度，稀释至30ng/uL，存于-20℃备用。
(2)以基因组DNA为模板，以黄曲霉菌产毒关键基因AFLR为目标基因，特异性引物为上游引物5’-AACCTGATGACGACTGATAT-3’，下游5’-AGCACCTTGAGAACGATAA-3’，进行荧光定量PCR反应。
(3)根据荧光定量PCR结果判断花生及制品中是否感染黄曲霉毒素产生菌，当有扩增曲线时，判断花生及制品感染黄曲霉毒素产生菌；未有扩增曲线，判断花生及制品未感染黄曲霉毒素产生菌。
(4)根据样品荧光定量PCR的Ct值来判断花生及制品黄曲霉毒素的含量，花生样品中的黄曲霉毒素含量和Real-time PCR的Ct值呈显著的负相关，数学关系方程式为：
y＝-0.0852x+27.257。(x为黄曲霉毒素含量)
优选地，一种利用实时荧光定量PCR技术检测花生及制品中黄曲霉毒素潜在污染风险的方法步骤(2)中荧光定量PCR反应体系如下：
荧光定量PCR扩增条件为：95℃30s，1个循环；95℃5s，60℃34s,40个循；95℃15s，60℃60s,95℃30s。
优选地，一种利用实时荧光定量PCR技术检测花生及制品中黄曲霉毒素潜在污染风险的方法于步骤(4)所述的花生样品中的黄曲霉毒素含量和Real-time PCR的Ct值的关系方程式，x(黄曲霉毒素)线性范围为0-60，Ct值越低，花生及制品中黄曲霉毒素含量越大或者受黄曲霉毒素污染风险越高。
本发明的有益效果如下
(1)本发明特异性强，只对含有AFLR基因的菌株产生扩增，而对不含有AFLR基因的菌株未有扩增。
(2)本发明灵敏度高，只要含有AFLR基因，均能有扩增结果。
(3)本发明稳定性好，检测结果安全可靠。
(4)本发明能够快速、准确的检测黄曲霉毒素产生菌，整个检测过程在4-8h内可完成，适合大批量检测。
(5)本发明不仅能判断产毒菌的存在，而且能定量判断判断出花生及制品受黄曲霉毒素污染风险大小。
(6)本发明不仅可以检测花生及其制品，也可检测加工过程中的加工品，可应用于花生加工过程中黄曲霉毒素的污染防控。
附图说明
图1是黄曲霉菌AFLR引物的荧光定量PCR反应图
图2是不同浓度黄曲霉DNA的Real-time PCR扩增曲线
具体实施方式
实施例1----实时荧光定量PCR技术检测花生及制品中黄曲霉毒素污染风险的方法特异性好。
根据Genebank公布的AFLR基因序列，应用Primer Premier5.0软件设计了特异性引物，其序列为：上游引物5’-AACCTGATGACGACTGATAT-3’，下游引物5’-AGCACCTTGAGAACGATAA-3’，由图1可以看出，用设计的引物对黄曲霉做Real-time PCR，无杂峰，产物平行性好。
对黄曲霉菌产毒菌和黄曲霉不产毒菌(不含有AFLR基因)做了特异性验证，结果显示该引物只对含有AFLR基因的菌株产生扩增，而对不含有AFLR基因的菌株未有扩增，表明该引物特异性较强，适合于黄曲霉产毒菌的检测。
实施例2----实时荧光定量PCR技术检测花生及制品中黄曲霉毒素污染风险的方法灵敏度高
用核酸蛋白分析仪测量黄曲霉菌标准菌株DNA的含量后，进行10倍倍比稀释，得到3×10-2、3×10-3、3×10-4、3×10-5、3×10-6、3×10-7、3×10-8、3×10-9、3×10-10、3×10-11、3×10-12、3×10-13DNA浓度的模板，分别作为Real-time PCR的DNA模板,结果见图2。结果显示3×10-13的DNA能够被扩增，灵敏性强。
实施例3----实时荧光定量PCR技术检测花生及制品中黄曲霉毒素污染风险的方法稳定性好
将黄曲霉产毒菌DNA稀释至浓度3×10-13mg/ml，做6次重复，结果见表1。变异系数为2.67％，说明可重复性较好。
表1 荧光定量PCR重复性检验结果
实施例4—建立花生中黄曲霉毒素污染风险与黄曲霉菌afIR基因的实时荧光定量PCR关系模型
对花生样品中的黄曲霉毒素含量和Real-time PCR的Ct值进行相关性分析，相关系数为-0.718，显著的负相关；数学关系方程式为：y＝-0.0852x+27.257。
表2 花生中黄曲霉毒素的含量与荧光定量PCR的Ct
注：C为黄曲霉毒素含量，Ct为每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
实施例5
采用四分法采集花生样品0.1g，采用氯化苄法提取DNA，得到粗DNA后，用DNA纯化试剂盒纯化后，用核酸蛋白定量仪检测浓度，稀释至30ng/uL，存于-20℃备用。以黄曲霉菌产毒关键基因AFLR为目标基因，特异性引物为上游引物5’-AACCTGATGACGACTGATAT-3’，下游5’-AGCACCTTGAGAACGATAA-3’，进行荧光定量PCR反应。
荧光定量PCR反应体系如下：
荧光定量PCR扩增条件为：95℃30s，1个循环；95℃5s，60℃34s,40个循；95℃15s，60℃60s,95℃30s。
荧光定量PCR结果显示该样品Ct值为24.38，根据建立花生中黄曲霉毒素污染风险与黄曲霉菌afIR基因的实时荧光定量PCR关系模型，推测该样品中受黄曲霉毒素污染风险高，该样品中即将或已被黄曲霉毒素污染，浓度可达到42ppb，应密切注意该样品中黄曲霉毒素的变化，及时检测样品中黄曲霉毒素的含量。
实施例6
采用四分法采集花生样品0.1g，采用氯化苄法提取DNA，得到粗DNA后，用DNA纯化试剂盒纯化后，用核酸蛋白定量仪检测浓度，稀释至30ng/uL，存于-20℃备用。以黄曲霉菌产毒关键基因AFLR为目标基因，特异性引物为上游引物5’-AACCTGATGACGACTGATAT-3’，下游5’-AGCACCTTGAGAACGATAA-3’，进行荧光定量PCR反应。
荧光定量PCR反应体系如下：
荧光定量PCR扩增条件为：95℃30s，1个循环；95℃5s，60℃34s,40个循；95℃15s，60℃60s,95℃30s。
荧光定量PCR结果显示该样品Ct值为28.89，根据建立花生中黄曲霉毒素污染风险与黄曲霉菌afIR基因的实时荧光定量PCR关系模型，推测该样品中受黄曲霉毒素污染风险低，该样品可用于食品生产和加工，安全性高。
实施例7
采用四分法采集花生样品0.1g，采用氯化苄法提取DNA，得到粗DNA后，用DNA纯化试剂盒纯化后，用核酸蛋白定量仪检测浓度，稀释至30ng/uL，存于-20℃备用。以黄曲霉菌产毒关键基因AFLR为目标基因，特异性引物为上游引物5’-AACCTGATGACGACTGATAT-3’，下游5’-AGCACCTTGAGAACGATAA-3’，进行荧光定量PCR反应。
荧光定量PCR反应体系如下：
荧光定量PCR扩增条件为：95℃30s，1个循环；95℃5s，60℃34s,40个循；95℃15s，60℃60s,95℃30s。
荧光定量PCR结果显示该样品Ct值为25.7，根据建立花生中黄曲霉毒素污染风险与黄曲霉菌afIR基因的实时荧光定量PCR关系模型，推测该样品中受黄曲霉毒素污染风险为中等，该样品中即将或已被黄曲霉毒素污染，浓度预测为16ppb，应严格注意贮藏和加工过程中黄曲霉毒素的防控，控制花生中的黄曲霉毒素控制的国标范围内，用于食品的加工和生产。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种利用实时荧光定量PCR技术检测花生及制品中黄曲霉毒素潜在污染风险的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)基因组DNA的提取：采用四分法采集花生样品0.1g，采用氯化苄法提取DNA，得到粗DNA后，用DNA纯化试剂盒纯化后，用核酸蛋白定量仪检测浓度，稀释至30ng/uL，存于-20℃备用。
(2)以基因组DNA为模板，以黄曲霉菌产毒关键基因AFLR为目标基因，特异性引物为上游引物5’-AACCTGATGACGACTGATAT-3’，下游5’-AGCACCTTGAGAACGATAA-3’，进行荧光定量PCR反应。
(3)根据荧光定量PCR结果判断花生及制品中是否感染黄曲霉毒素产生菌，当有扩增曲线时，判断花生及制品感染黄曲霉毒素产生菌；未有扩增曲线，判断花生及制品未感染黄曲霉毒素产生菌。
(4)根据样品荧光定量PCR的Ct值来判断花生及制品中黄曲霉毒素污染的潜在的风险，花生样品中的黄曲霉毒素潜在风险(黄曲霉毒素含量)和Real-time PCR的Ct值呈显著的负相关，数学关系方程式为：y＝-0.0852x+27.257(x为黄曲霉毒素含量)。
2.根据权利要求1所述的一种利用实时荧光定量PCR技术检测花生及制品中黄曲霉毒素潜在污染风险的方法，其特征在于步骤(2)中荧光定量PCR反应体系如下：
荧光定量PCR扩增条件为：95℃30s，1个循环；95℃5s，60℃34s,40个循；95℃15s，60℃60s,95℃30s。
3.根据权利要求1所述的一种利用实时荧光定量PCR技术检测花生及制品中黄曲霉毒素潜在污染风险的方法，其特征在于步骤(4)所述的花生样品中的黄曲霉毒素含量和Real-timePCR的Ct值的关系方程式，x(黄曲霉毒素)线性范围为0-60，Ct值越低，花生及制品中黄曲霉毒素含量越大或者受黄曲霉毒素污染风险越高。
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