CN105861652B - 一种鹿源性物种成分的检测鉴定方法 - Google Patents

一种鹿源性物种成分的检测鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鹿源性物种成分的检测鉴定方法，属于鹿制品检测鉴定技术领域。本发明提供了一种可用来检测和鉴定鹿源性物种成分的基因。同时，本发明还提供了利用该基因检测和鉴定鹿源性物种成分的方法。该方法是取待测样品的基因组DNA，通过PCR方法检测待检样品中是否含有鹿源性成份。对含有鹿源性成份的序列进行核苷酸测序，与已测定的核苷酸序列库进行比对，最终确定鹿源性产品来源于何种鹿。本发明所提供的方法具有操作简单快速、准确度高的特点，适合于鹿源性产品的来源检测及质量控制。

Description

一种鹿源性物种成分的检测鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种鹿源性物种成分的检测鉴定方法，属于鹿制品检测鉴定技术领域。
背景技术
鹿是人们熟知的一种珍贵野生动物，远在汉代，即有“鹿身百宝”之说，据《本草纲目》记载，鹿茸、鹿胎、鹿血、鹿脑、鹿尾、鹿肾、鹿筋、鹿脂、鹿肉、鹿骨、鹿鞭等都可入药。由于鹿产品来源有限、价格昂贵，市场上鹿产品鱼龙混杂，许多非鹿源的产品，以假乱真；一些驯鹿、马鹿等低价产品充当高价的梅花鹿产品。
目前鹿产品的鉴定主要依靠传统方法，主要包括直观性状鉴定和理化鉴定。因此很难准确判定鹿产品的真伪。比如一颗猪心的价格与鹿心相差几十倍，药效更是天壤之别，但是几乎不能通过传统方法鉴定真伪。驯鹿、马鹿的鹿茸价格只有梅花鹿鹿茸的一半，切片以后也不能通过传统方法鉴别，因此如何有效地鉴别鹿产品，既困扰着鹿产品加工企业，也困扰着广大消费者。
查代明等曾公开发表了一种利用PCR技术扩增梅花鹿、马鹿、塔里木马鹿、赤鹿以及驯鹿的各线粒体DNA的方法，对不同的鹿种设计了不同的引物，通过PCR扩增判定检测待检样品中是否含有上述动物成分的方法，该方法主要依据线粒体DNA的不同进行判断。由于引物是根据不同的鹿种的线粒体DNA设计，因此覆盖面较窄，仅限于报道的五种鹿。而且要判定一个不明成份的产品，需要同时用到多对引物。周祥山等公开了一种胶类中药及其制品中鹿源性成分的检测方法，主要是利用酶解方法分析胶原蛋白，仅能够用于鉴别梅花鹿和马鹿成份。由于动物基因数量十分庞大，获取某种特定动物的特异性基因的工作难度较大，目前尚未报道有针对鹿科动物的特异性基因。
发明内容
为解决现有技术中检测方法适用的使用范围小，不能区分不同鹿种的技术问题，本发明提供了一种鹿源性成分的检测鉴定方法，所采取的技术方案如下：
发明人在研究过程中偶然发现梅花鹿的Nanog基因存在一个假基因Nanog-ps，通过大范围检测证明Nanog-ps基因为鹿科动物中特异性存在的基因，可用来检测和鉴定鹿源性物种成分。本发明的目的在于提供基因Nanog-ps在鹿源性物种成分的检测和鉴定方法。其中，基因Nanog-ps的核苷酸序列SEQ ID NO.1所示，Gene bank ID为KR005602。
本发明提供了一种利用Nanog-ps基因检测鹿源性物种成分的方法，该方法的步骤如下：
1)根据Gene bank ID KR005602所示的Nanog-ps基因核苷酸序列设计引物；
2)提取待测样品中的DNA；
3)以步骤2)所得的DNA样品为模板，利用步骤1)所得的引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
4)利用电泳检测鉴定步骤3)所得扩增产物。
优选地，步骤1)所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
优选地，步骤3)所述PCR扩增，扩增条件为：扩增条件为：94℃，5min；94℃，30S，57℃，30S，72℃，25S，循环30次，72℃，5min。
优选地，步骤4)所述利用电泳检测和鉴定，是检测PCR扩增产物中是否同时含有270bp和2140bp的条带。
本发明的另一目的在于提供一种利用基因Nanog-ps鉴别鹿源性物种成分的方法，该方法的步骤如下：
1)根据SEQ ID NO.1所示序列设计引物；
2)提取待测样品中的DNA；
3)以步骤2)所得的DNA样品为模板，利用步骤1)所得的引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
4)利用电泳检测步骤3)所得扩增产物是否含有鹿源性成分；
5)提取步骤4)中含有鹿源性成分的核苷酸序列，测序后与数据库进行比对确定基因来源。
优选地，步骤1)所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
优选地，步骤4)所述利用电泳检测和鉴定，是检测PCR扩增产物中是否同时含有270bp和2140bp的条带。
优选地，步骤5)所述提取步骤4)中含有鹿源性成分的核苷酸序列，是指对获得的270bp条带进行基因测序。
本发明获得的有益效果：
本发明发明人偶然发现了一个仅在鹿科动物中存在的基因序列，依据该基因设计了鹿科动物特异性扩增引物，通过PCR方法可以扩增鹿科动物的DNA呈两条带特征，从而快速鉴别待测产品中鹿源性成份。通过基因测序判定鹿源性成份来源于何种鹿。
本发明利用一对引物，一次PCR扩增，就可以直观地判定待测样品中是否含有鹿源性成份。建立了多种鹿科动物的序列数据库，涵盖了鹿科动物的几大分支。通过与待测样品序列比对，能够确定鹿源性成份属于何种鹿。本发明所提供的方法选择利用鹿科动物特异性基因序列，检测鹿源性产品，简单明了地检测待检样品的鹿源性成份，可检测和鉴定多种鹿源性成分，适用范围更广，可从源头上保证鹿产品的保健价值和药效；为鹿产业的可持续性发展保驾护航。
附图说明
图1为几种常见鹿科动物的基因序列。
图2为PCR检测多种常见鹿科动物DNA结果。
图3为市场购买的鹿心样品检测结果；
(其中，一、二、三、四和五分别为五种鹿心样品)。
图4为某种鹿茸胶囊产品检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
实施例1鹿科动物特异性基因的筛选
1)大范围采集鹿科动物血液样品，包括梅花鹿、马鹿、水鹿、赤鹿、麋鹿、驯鹿、獐鹿等常见鹿科动物，以及牛和羊的抗凝血1-2毫升。
2)用血液DNA提取试剂盒，提取上述样品的基因组DNA，提取方法按照试剂盒说明书操作，也可以使用自己配置的DNA提取液，均不影响实验结果。
3)以1微升样品的DNA为模板，用我们设计的特异性引物进行扩增，PCR程序设置如下：
4)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用紫外光相机采集图像。经过对大量所得结果如图2所示，所有检测的鹿科动物均有270bp和2140bp两条带，而非鹿科动物的牛和羊只有2140bp一条带。驯鹿和獐鹿是鹿科动物最古老的分支，而牛和羊是鹿科动物亲缘关系最近的非鹿科动物。因此270bp条带为鹿科动物所特有。
实施例2多种鹿科动物核苷酸序列数据库的建立
1)将实施例1中各种鹿科动物中扩增的270bp条带，通过电泳切胶回收，回收片段重组到T载体中。
2)重组T载体转化感受态大肠杆菌，转化后均匀涂抹到含氨苄青霉素的LB固体培养基中，倒置培养16小时。
3)每一个鹿种挑选5个单克隆菌株，接种到LB液体培养基中，37℃摇床培养8小时，从菌液中提取质粒进行基因测序。
4)分析测序结果，排除测序造成的误差后，建立不同鹿科动物核苷酸序列数据库(图1)。
实施例3鹿心样品检测结果
1)从不同的市场上购买的五份标明鹿心的产品进行检测。
2)切一小块组织，研磨成粉，称取50微克，用组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA。
3)以1微升样品的DNA为模板，用我们设计的特异性引物进行扩增，PCR程序设置同实例1。
4)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用紫外光相机采集图像。所得结果如图3所示，五个样品中有4个出现两条带，可以判定为鹿源性产品。而只有一条带的产品为非鹿源性产品。
实施例4鹿源性产品所属鹿种的鉴定
1)对实施例2中检测到的鹿源性产品进行基因测序。
2)将琼脂糖凝胶中的鹿特性条带纯化回收。
3)以回收的片段为模板，进行基因测序。
4)测序所得的核苷酸序列与数据库中的序列进行比对，结果显示有两个样品来源于梅花鹿，两个样品来源于赤鹿。
实施例5某品牌全鹿茸粉胶囊的检测
(1)取胶囊内粉剂50微克，用组织DNA提取试剂盒提取基因组DNA。
(2)以1微升样品的DNA为模板，用我们设计的特异性引物进行扩增，PCR程序设置如下：
(3)PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用紫外光相机采集图像。结果如图4所示，可以判定该产品中含有鹿源性成份。
(4)对鹿科动物特有的小条带进行基因测序，与数据库中序列进行比对，结果发现所测的序列中既有梅花鹿的序列又有驯鹿的序列，由此可以判断该产品是梅花鹿和驯鹿的混合物。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.检测基因Nanog-ps的试剂在用于鉴定和检测鹿源性物种成分中的应用，所述基因Nanog-ps的Genebank ID为KR005602，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤如下：
1)根据SEQ ID NO.1所示核苷酸序列设计引物；
2)提取待测样品中的DNA；
3)以步骤2)所得的DNA样品为模板，利用步骤1)所得的引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
4)利用电泳检测鉴定步骤3)所得扩增产物。
3.权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤1)所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
4.权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤3)所述PCR扩增，扩增条件为：94℃，5min；94℃，30 S，57℃，30 S，72℃，25 S，循环30次，72℃，5min。
5.权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤4)所述利用电泳检测和鉴定，是检测PCR扩增产物中是否同时含有270bp和2140bp的条带。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤如下：
1)根据SEQ ID NO.1所示序列设计引物；
2)提取待测样品中的DNA；
3)以步骤2)所得的DNA样品为模板，利用步骤1)所得的引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
4)利用电泳检测步骤3)所得扩增产物是否含有鹿源性成分；
5)提取步骤4)中含有鹿源性成分的核苷酸序列，测序后与数据库进行比对确定基因来源。
7.权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤1)所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
8.权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤4)所述利用电泳检测和鉴定，是检测PCR扩增产物中是否同时含有270bp和2140bp的条带。
9.权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤5)所述提取步骤4)中含有鹿源性成分的核苷酸序列，是提取鹿科动物特有的270bp的条带进行基因测序。
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