CN113049578A - 一种dna酶及其应用和一种基于dna酶的铜离子检测试纸及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于二价铜离子检测的技术领域，本发明提供了一种DNA酶及其应用和一种基于DNA酶的铜离子检测试纸及其制备方法。本发明提供的一种铜离子检测试纸的制备方法，包括如下步骤：(1)将玻璃纤维滤纸的疏水区在甲基三氯硅烷‑甲苯和盐酸的混合溶液中浸泡改性；(2)用染液浸润玻璃纤维滤纸的亲水区，即得到铜离子检测试纸。本发明提供的DNA酶对铜离子产生的催化点击反应效率高，具有更好的信号放大效果，能够用于检测水质或食品中的铜离子；本发明提供的铜离子检测试纸，具有灵敏度高、检测线低，且特异性高的优点，其检出限低至1.31μM，检测误差低于5％。
Description
技术领域
本发明涉及铜离子检测的技术领域，尤其涉及一种DNA酶及其应用和一种基于DNA酶的铜离子检测试纸及其制备方法。
背景技术
铜是几乎所有生命形态中维持生命活动和生长发育所需的微量元素。异常水平的游离Cu2+可能作为氧和蛋白自由基生成的催化剂，导致严重的神经系统疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病和威尔逊病等。因此，有必要开发一种灵敏、快速、适合现场检测的Cu2+检测方法，以实现实际的应急检测。从源头抑制Cu2+对人体的侵害具有重要意义。例如，检测食品中Cu2+的含量可以帮助人们判别食品的安全系数，对食品中的Cu2+进行筛查可以大大提高人们的生活质量和预防疾病的发生。因此，开发一种方便、灵敏的检测食品中Cu2+浓度的方法，对于科学研究和食品安全都是非常重要的。
铜的现有分析方法包括电感耦合等离子体质谱法、原子吸收光谱法和电化学的应用方法。遗憾的是，尽管这些方法足够敏感，但却需要依靠昂贵的大型精密仪器、复杂的预处理程序和长时间的检测，不能满足现场快速、简便检测的需求。近年来，各种纸芯片的二价铜离子(Cu2+)检测方法受到了越来越多的关注，如比色法、荧光法等，这些方法可以用肉眼快速检测溶液中的Cu2+，但在低浓度时却难以判别并且准确度不高。并且这些常规的利用纸芯片进行Cu2+检测的方法需要通过化学试剂还原Cu2+，这会降低反应的稳定性，同时纸芯片的不均一性以及通过肉眼识别会降低检测的准确度。
一价铜离子(Cu+)催化的点击化学反应因其高效、选择性强而受到人们的广泛关注。其反应原理是Cu+催化叠氮化物基团和炔基发生点击反应，从而形成环加成产物五元三唑环，该产物具有强荧光性质。然而。目前均是采用还原剂将Cu2+还原为Cu+，但还原剂(通常为抗坏血酸钠)的活性也会随着时间而降低，这在一定程度上会影响检测结果的稳定性和准确性。因此，提供一种检测准确性高、检测限低、特异性高，且无须利用还原剂进行Cu2+还原的检测方法非常有必要。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种DNA酶，所述DNA酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供了一种DNA酶用于检测二价铜离子的应用。
优选的，所述DNA酶用于检测水质和食品中二价铜离子的应用。
优选的，所述DNA酶用于制备二价铜离子检测产品的应用。
优选的，所述二价铜离子检测产品为铜离子检测试纸、试剂或试剂盒。
本发明还提供了一种二价铜离子检测试纸的制备方法，包括如下步骤：
(1)将玻璃纤维滤纸的疏水区在甲基三氯硅烷-甲苯和盐酸的混合溶液中浸泡改性；
(2)用包括3-丁炔-1-醇、3-叠氮基-7-羟基香豆素和DNA酶的染液浸润玻璃纤维滤纸的亲水区，即得到铜离子检测试纸。
优选的，所述甲基三氯硅烷-甲苯中甲基三氯硅烷的浓度为1～120mM，所述盐酸的体积分数为20～40％，所述甲基三氯硅烷-甲苯和盐酸的的体积比为1:2～4；所述浸泡改性的时间为5～15min。
优选的，所述染液中，3-叠氮基-7-羟基香豆素的浓度为40～160μM，3-丁炔-1-醇与3-叠氮基-7-羟基香豆素的的浓度比为1～100:1～20，DNA酶的浓度为0.5～6μM。
优选的，所述DNA酶是将DNA单链在R缓冲液中变性，再进行重折叠，得到所述的DNA酶；所述R缓冲液包括80～120mM Li-HEPES和80～120mM MgCl2，二者按照体积比1:2～4混合。
本发明还提供了一种按照上述二价铜离子检测试纸的制备方法制备的二价铜离子检测试纸。
本发明提供的DNA酶对二价铜离子具有更灵敏的还原效果，产生的催化点击反应效率更高，具有更好的信号放大效果。能够用于检测水体或食品环境中的二价铜离子。此外，本发明以DNA酶作为还原比一般的化学还原剂(抗坏血酸)稳定性更好、易于保存、不易变性，可以在水溶液中存在Cu2+的情况下进行CuAAC反应，大大提高了检测效率，简化了操作步骤。本发明基于DNA酶提供的二价铜离子检测试纸，具有灵敏度高、检测限低，且特异性高的优点，其检出限低至1.31μM，检测误差低于5％。此外，本发明以超疏水玻璃纤维滤纸作为制备二价铜离子检测试纸的材料，与普通滤纸相比，颜色分布均匀、显色明显，且解决了浸润范围大的问题，提高了检测效率。
附图说明
图1为实施例2中铜离子标准溶液的浓度和荧光强度的曲线图，其中上方曲线表示有DNA酶的铜离子检测试纸的荧光强度，下方曲线表示无DNA酶的对照检测试纸的荧光强度；
图2为实施例3中铜离子标准溶液的浓度和G通道值的标准图；
图3为实施例4中DNA酶在不同离子存在时的荧光强度；
图4为76个碱基的DNA酶(a)与79个碱基的DNA酶(b)催化二茂铁基乙炔在叠氮基修饰电极表面的信号。
具体实施方式
本发明提供了一种DNA酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。将本发明的DNA酶与另外一种DNA酶(其序列如SEQ ID NO：2所示)进行比较。序列SEQ ID NO：1所示DNA酶比序列SEQ ID NO：2所示DNA酶在5’端缺失了三个碱基(GGA)。由此导致序列SEQ ID NO：1所示DNA酶与二价铜离子的结合更加稳定，产生的催化点击反应效率更高，因此，产生了更好的信号放大效果。这种效果是发明人未曾预料到的。
本发明还提供了一种DNA酶用于检测二价铜离子的应用。
在Cu2+检测过程中，DNA酶能够催化Cu2+得到Cu+，而3-叠氮基-7-羟基香豆素与3-丁炔-1-醇可以在Cu+的催化下发生点击化学反应，生成在紫外灯光下具有强荧光性质的1,2,3-三唑化合物，利用该性质可用于检测Cu2+的存在与否。
在本发明中，所述DNA酶优选用于检测水质和食品中的二价铜离子。
在本发明中，所述DNA酶优选用于制备二价铜离子检测产品。
在本发明中，所述二价铜离子检测产品优选为二价铜离子检测试纸、试剂或试剂盒，进一步优选为二价铜离子检测试纸。
本发明还提供了一种二价铜离子检测试纸的制备方法，包括如下步骤：
(1)将玻璃纤维滤纸的疏水区在甲基三氯硅烷-甲苯和盐酸的混合溶液中浸泡改性；
(2)用包括3-丁炔-1-醇、3-叠氮基-7-羟基香豆素和DNA酶的染液浸润玻璃纤维滤纸的亲水区，即得到铜离子检测试纸。
使用普通纤维试纸进行检测时，在滴加染液后会出现大范围浸润的现象，造成颜色分布不均匀，以致显色不明显，降低了检测灵敏度和检测效率。
为了解决这一问题，本发明以玻璃纤维滤纸作为检测试纸，并将所述玻璃纤维滤纸分为疏水区和亲水区；然后将玻璃纤维滤纸的疏水区在甲基三氯硅烷-甲苯和盐酸的混合溶液中浸泡改性，得到具有超疏水效果的玻璃纤维滤纸。
在本发明中，所述甲基三氯硅烷-甲苯是将甲基三氯硅烷溶于甲苯中得到的混合溶液，在该混合溶液中，甲基三氯硅烷的浓度优选为1～120mM，进一步优选为1mM、2mM、5mM、10mM、20mM、40mM、80mM、120mM，再进一步优选为20mM。
在本发明中，所述盐酸的体积分数优选为20～40％，进一步优选为21％、23％、25％、27％、29％、31％、33％、35％、37％、39％，再进一步优选为37％。本发明在浸泡改性的溶剂中加入盐酸，能够加快改性的速度和增强改性的程度，使玻璃纤维滤纸的疏水区具有更好的超疏水效果，一方面能够更有效的限定亲水区的浸润范围，另一方面又使得颜色分布均匀，提高检测的灵敏度和准确度。
在本发明中，所述浸泡改性的时间优选为5～15min，进一步优选为5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min，再进一步优选为12min。
在本发明中，所述甲基三氯硅烷-甲苯和盐酸的体积比优选为1:2～4，进一步优选为1:3。
在本发明中，还优选将浸泡改性后的玻璃纤维滤纸进行干燥处理。
在本发明中，所述干燥处理的温度优选为35～40℃，进一步优选为35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃，再进一步优选为37℃。
在本发明中，所述干燥处理的时间优选为5～20min，进一步优选为5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min，再进一步优选为15min。
本发明还用包括3-丁炔-1-醇、3-叠氮基-7-羟基香豆素和DNA酶的染液浸润玻璃纤维滤纸的亲水区。
在本发明中，所述染液是将3-丁炔-1-醇、3-叠氮基-7-羟基香豆素和DNA酶在HEPES缓冲液中混合，得到包括3-丁炔-1-醇、3-叠氮基-7-羟基香豆素和DNA酶的混合染液。
在本发明中，所述HEPES缓冲液为(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)缓冲液。
在本发明中，所述HEPES缓冲液的PH优选为6～8，进一步优选为6、6.3、6.7、7.0、7.3、7.7、8，再进一步优选为7.0。
在本发明中，所述染液中，3-叠氮基-7-羟基香豆素的浓度优选为40～160μM，进一步优选为40μM、60μM、80μM、100μM、120μM、140μM、160μM，再进一步优选为160μM。
在本发明中，所述3-丁炔-1-醇与3-叠氮基-7-羟基香豆素的浓度比优选为1～100:1～20，进一步优选为1:20、1:10、1:1、20:1、40:1、80:1、100:1，再进一步优选为100:1。
在本发明中，在所述染液中，DNA酶的浓度优选为0.5～6μM，进一步优选为0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM，再进一步优选为4μM。
在本发明中，所述DNA酶是将DNA单链在R缓冲液中变性，再进行重折叠，得到所述的DNA酶。
在本发明中，所述R缓冲液是指包括Li-HEPES和MgCl2的混合溶液，pH＝7.4。
在本发明中，所述Li-HEPES是指羟乙基哌嗪乙硫磺酸锂；在R缓冲液中，所述Li-HEPES的浓度优选为80～120mM，进一步优选为100mM；所述MgCl2的浓度优选为80～120mM，进一步优选为100mM。
在本发明中，所述Li-HEPES和MgCl2混合的体积比优选为1:2～4，进一步优选为1:3。
在本发明中，所述重折叠是将含有DNA单链的R缓冲液在热循环仪中沸腾5min，然后在10min内冷却至22℃进行重折叠，得到DNA酶。
在本发明中，所述DNA酶的保存温度优选为2～5℃，进一步优选为2℃、3℃、4℃、5℃。
在本发明中，所述亲水区优选为规则的圆形。
在本发明中，所述圆形清水区的直径优选为0.6～0.8cm，进一步优选为0.6cm、0.7cm、0.8cm，再进一步优选为0.7cm。
本发明在将亲水区用染液处理后，直接塞回到疏水区的孔洞中，密封保存，即得到铜离子检测试纸。
本发明还提供了一种按照上述二价铜离子检测试纸的制备方法制备的二价铜离子检测试纸。使用时，将本发明的二价铜离子检测试纸浸渍在待测溶液中，用肉眼观察紫外灯箱中试纸的变化，若试纸亲水区显蓝绿色荧光，则证明待测溶液中含有Cu2+。用不同浓度梯度的铜离子标准溶液浸渍检测试纸，得到标准比色卡，将待测溶液的检测结果与之对比，即可获得待测溶液中二价铜离子的浓度。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明中的3-丁炔-1-醇、3-叠氮基-7-羟基香豆素、HEPES缓冲液(pH＝7.0)以及配制铜离子标准溶液所用到的铜盐均购自西格玛、阿拉丁等公司；
实施例1
本实施例提供了一种铜离子检测试纸，该铜离子检测试纸的制备方法如下：
(1)利用打孔器在玻璃纤维滤纸上打出一个直径为0.7cm的圆形孔片，以该孔片作为亲水区，将玻璃纤维滤纸的其余部分作为疏水区。将疏水区在20mM甲基三氯硅烷-甲苯和37％盐酸(二者混合时的体积比为1:3)的混合溶液中浸泡15min，取出在37℃条件下干燥20min，即得到具有超疏水效果的玻璃纤维滤纸疏水区；将如SEQ ID NO：1所示的DNA单链在R缓冲液中变性，在热循环仪中沸腾5min，并在10min内冷却至室温(22℃)进行重折叠，得到本发明的DNA酶。将得到的DNA酶保存于4℃环境下，备用；在本实施例中所述R缓冲液是指浓度100mM的Li-HEPES缓冲液与浓度为100mM的MgCl2按照体积比1:3混合组成的缓冲液，pH为7.4；
(2)将3-丁炔-1-醇、3-叠氮基-7-羟基香豆素和DNA酶混合于HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)缓冲液中，涡旋振荡混匀，得到浓度分别为16mM 3-丁炔-1-醇、160μM3-叠氮基-7-羟基香豆素和4μM DNA酶的混合染液，将该染液滴加到玻璃纤维滤纸的亲水区，然后将亲水区塞回到疏水区的孔洞中，密封保存，即得到铜离子检测试纸。
实施例2
本实施例提供了一种利用实施例1制备的铜离子检测试纸检测铜离子的方法。
(1)配制铜离子标准溶液：将硫酸铜溶液用水配制成浓度分别为0、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM的硫酸铜标准溶液。
(2)将铜离子检测试纸分别放入到上述浓度的铜离子标准溶液中，在37℃下反应30min；取出铜离子检测试纸，放入烘箱中在55℃下干燥10min，然后置于紫外灯箱中照射，绘制铜离子标准溶液的浓度与荧光强度的曲线图，并与未加入DNA酶的对照检测试纸进行比较，如图1所示，从图1可以看出随着铜离子浓度的增加，铜离子检测试纸的荧光强度逐渐增强，而对照检测试纸(与铜离子检测试纸的区别仅在于没有DNA酶)的荧光强度没有明显变化；而后用智能手机拍照成像，用手机软件分析试纸亲水区的RGB值，根据G通道值与浓度的关系，得到标准比色卡；
(3)取待测样品溶液：自来水(来自浙江省宁波市江东水厂)、湖水(来自浙江省宁波市甬江分支江北大河)、牛奶(娃哈哈)；将上述三种待测样品分别取7mL到15mL的离心管中，在8000r/min下离心5min，取上清液放入一片铜离子检测试纸，在37℃下反应30min；
(4)取出步骤(3)中的铜离子检测试纸，放入烘箱中在55℃下干燥10min，在紫外灯下照射后通过智能手机拍照成像，手机软件分析试纸亲水区的RGB值，根据G通道值对照标准比色卡，即可得到三种样品中的铜离子浓度分别为：自来水0μM、湖水1.43μM、牛奶0μM。
实施例3
根据实施例2的实验结果绘制铜离子标准溶液的浓度和G通道值的标准图，如图2所示；得到线性回归方程y＝0.01225x+1.02796，线性相关系数R2为0.99752，且检测限低至1.31μM，线性范围为0～150μM。
以该标准曲线为依据，对自来水、湖水和牛奶样品中的铜离子浓度进行检测，同时还提供了回收率和精密度实验：用样品中加标准溶液的方法，按照同样的检测方法(同实施例2)，进行加标回收实验，选取两个浓度、每个浓度做3个平行样，每个平行样在相同的条件下连续测3次，计算相对标准偏差，检测结果见表1。
表1自来水、湖水、牛奶样品中的铜离子浓度及加标回收实验结果
由表1可知，本发明提供的铜离子检测试纸的回收率均在95％以上，其相对偏差均低于5％，说明该检测试纸准确可靠。
实施例4
本实施例还提供了3-丁炔-1-醇、3-叠氮基-7-羟基香豆素和DNA酶混合液对于其他金属离子的抗干扰能力测试，金属离子包括Cu2+、Pb2+、Cd2+、Fe3+、Mg2+、Zn2+、Ag+，其中Cu2+的浓度为100μM，其他金属离子的浓度为1mM，如图3可知，3-丁炔-1-醇、3-叠氮基-7-羟基香豆素和DNA酶混合液只有在Cu2+存在的时候才会发生荧光信号的变化，证明本发明DNA酶具有特异性，其他离子不会对该检测体系造成干扰。
实施例5
本发明还研究了如SEQ ID NO：1所示的76个碱基的DNA酶和如SEQ ID NO：2所示79个碱基的DNA酶分别催化二茂铁基乙炔(FBA)在叠氮基修饰电极表面的方波伏安信号，均采用10-4M的二价铜离子和25mM HEPES缓冲液(pH6.5)，扫描速度为100mV/S，结果显示(如图4)，本发明采用的76个碱基的DNA酶检测信号(a)为79个碱基DNA酶(b)的3倍。说明本发明提供的具有76个碱基的DNA酶具有更好的信号放大效果，具有更高的检测效率和检测灵敏度。
实施例6
本实施例提供了一种铜离子检测试纸，该铜离子检测试纸的制备方法如下：
(1)利用打孔器在玻璃纤维滤纸上打出一个直径为0.7cm的圆形孔片，并以该孔片作为亲水区，并将玻璃纤维滤纸的其余部分作为疏水区。将疏水区在120mM甲基三氯硅烷-甲苯和40％盐酸(二者混合时的体积比为1:2)的混合溶液中浸泡12min，取出在35℃条件下干燥15min，即得到具有超疏水效果的玻璃纤维滤纸疏水区；将如SEQ ID NO：1所示的DNA单链在R缓冲液中变性，在热循环仪中沸腾5min，并在10min内冷却至室温(22℃)进行重折叠，得到本发明的DNA酶。将得到的DNA酶保存于4℃环境下，备用；在本实施例中所述R缓冲液是指浓度80mM的Li-HEPES缓冲液与浓度为100mM的MgCl2按照体积比1:2混合组成的缓冲液，pH为7.4；
(2)将3-丁炔-1-醇、3-叠氮基-7-羟基香豆素和DNA酶混合于HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)缓冲液(pH6.5)中，涡旋振荡混匀，得到浓度分别为2μM 3-丁炔-1-醇、40μM 3-叠氮基-7-羟基香豆素和6μM DNA酶的混合染液，将该染液滴加到玻璃纤维滤纸的亲水区，然后将亲水区塞回到疏水区的孔洞中，密封保存，即得到铜离子检测试纸。
实施例7
本实施例提供了一种铜离子检测试纸，该铜离子检测试纸的制备方法如下：
(1)利用打孔器在玻璃纤维滤纸上打出一个直径为0.8cm的圆形孔片，并以该孔片作为亲水区，并将玻璃纤维滤纸的其余部分作为疏水区。将疏水区在1mM甲基三氯硅烷-甲苯和20％盐酸(二者混合时的体积比为1:4)的混合溶液中浸泡5min，取出在37℃条件下干燥5min，即得到具有超疏水效果的玻璃纤维滤纸疏水区；将如SEQ ID NO：1所示的DNA单链在R缓冲液中变性，在热循环仪中沸腾5min，并在10min内冷却至室温(22℃)进行重折叠，得到本发明的DNA酶。将得到的DNA酶保存于4℃环境下，备用；在本实施例中所述R缓冲液是指浓度120mM的Li-HEPES缓冲液与浓度为80mM的MgCl2按照体积比1:4混合组成的缓冲液，pH为7.4；
(2)将3-丁炔-1-醇、3-叠氮基-7-羟基香豆素和DNA酶混合于HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)缓冲液(pH7.0)中，涡旋振荡混匀，得到浓度分别为100μM 3-丁炔-1-醇、100μM 3-叠氮基-7-羟基香豆素和0.5μMDNA酶的混合染液，将该染液滴加到玻璃纤维滤纸的亲水区，然后将亲水区塞回到疏水区的孔洞中，密封保存，即得到铜离子检测试纸。
实施例8
本实施例提供了一种铜离子检测试纸，该铜离子检测试纸的制备方法如下：
(1)利用打孔器在玻璃纤维滤纸上打出一个直径为0.6cm的圆形孔片，并以该孔片作为亲水区，并将玻璃纤维滤纸的其余部分作为疏水区。将疏水区在40mM甲基三氯硅烷-甲苯和25％盐酸(二者混合时的体积比为1:3)的混合溶液中浸泡10min，取出在37℃条件下干燥10min，即得到具有超疏水效果的玻璃纤维滤纸疏水区；将如SEQ ID NO：1所示的DNA单链在R缓冲液中变性，在热循环仪中沸腾5min，并在10min内冷却至室温(22℃)进行重折叠，得到本发明的DNA酶。将得到的DNA酶保存于4℃环境下，备用；在本实施例中所述R缓冲液是指浓度100mM的Li-HEPES缓冲液与浓度为100mM的MgCl2按照体积比1:3混合组成的缓冲液，pH为7.4；
(2)将3-丁炔-1-醇、3-叠氮基-7-羟基香豆素和DNA酶混合于HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)缓冲液(pH8.0)中，涡旋振荡混匀，得到浓度分别为4.8mM 3-丁炔-1-醇、120μM 3-叠氮基-7-羟基香豆素和3μM DNA酶的混合染液，将该染液滴加到玻璃纤维滤纸的亲水区，然后将亲水区塞回到疏水区的孔洞中，密封保存，即得到铜离子检测试纸。
实施例9
本实施例提供了一种铜离子检测试纸，该铜离子检测试纸的制备方法如下：
(1)利用打孔器在玻璃纤维滤纸上打出一个直径为0.7cm的圆形孔片，并以该孔片作为亲水区，并将玻璃纤维滤纸的其余部分作为疏水区。将疏水区在10mM甲基三氯硅烷-甲苯和31％盐酸(二者混合时的体积比为1:3)的混合溶液中浸泡8min，取出在37℃条件下干燥12min，即得到具有超疏水效果的玻璃纤维滤纸疏水区；将如SEQ ID NO：1所示的DNA单链在R缓冲液中变性，在热循环仪中沸腾5min，并在10min内冷却至室温(22℃)进行重折叠，得到本发明的DNA酶。将得到的DNA酶保存于4℃环境下，备用；在本实施例中所述R缓冲液是指浓度100mM的Li-HEPES缓冲液与浓度为100mM的MgCl2按照体积比1:3混合组成的缓冲液，pH为7.4；
(2)将3-丁炔-1-醇、3-叠氮基-7-羟基香豆素和DNA酶混合于HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)缓冲液(pH7.3)中，涡旋振荡混匀，得到浓度分别为6.4mM 3-丁炔-1-醇、80μM 3-叠氮基-7-羟基香豆素和1μM DNA酶的混合染液，将该染液滴加到玻璃纤维滤纸的亲水区，然后将亲水区塞回到疏水区的孔洞中，密封保存，即得到铜离子检测试纸。
实施例10
本实施例提供了一种铜离子检测试纸，该铜离子检测试纸的制备方法如下：
(1)利用打孔器在玻璃纤维滤纸上打出一个直径为0.7cm的圆形孔片，并以该孔片作为亲水区，并将玻璃纤维滤纸的其余部分作为疏水区。将疏水区在5mM甲基三氯硅烷-甲苯和35％盐酸(二者混合时的体积比为1:3)的混合溶液中浸泡15min，取出在37℃条件下干燥18min，即得到具有超疏水效果的玻璃纤维滤纸疏水区；将如SEQ ID NO：1所示的DNA单链在R缓冲液中变性，在热循环仪中沸腾5min，并在10min内冷却至室温(22℃)进行重折叠，得到本发明的DNA酶。将得到的DNA酶保存于4℃环境下，备用；在本实施例中所述R缓冲液是指浓度100mM的Li-HEPES缓冲液与浓度为100mM的MgCl2按照体积比1:3混合组成的缓冲液，pH为7.4；
(2)将3-丁炔-1-醇、3-叠氮基-7-羟基香豆素和DNA酶混合于HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)缓冲液(pH6.0)中，涡旋振荡混匀，得到浓度分别为14μM 3-丁炔-1-醇、140μM 3-叠氮基-7-羟基香豆素和5μM DNA酶的混合染液，将该染液滴加到玻璃纤维滤纸的亲水区，然后将亲水区塞回到疏水区的孔洞中，密封保存，即得到铜离子检测试纸。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 宁波大学
<120> 一种DNA酶及其应用和一种基于DNA酶的铜离子检测试纸及其制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgtcagtgc attgagatta ttatgcaact ctatgggtcc actctgtgaa tgtgacggtg 60
gtatccgcaa cgggta 76
<210> 2
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggatcgtcag tgcattgaga ttattatgca actctatggg tccactctgt gaatgtgacg 60
gtggtatccg caacgggta 79
Claims (10)
1.一种DNA酶，其特征在于，所述DNA酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种权利要求1所述的DNA酶用于检测二价铜离子的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述DNA酶用于检测水质和食品中二价铜离子的应用。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述DNA酶用于制备二价铜离子检测产品的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述铜离子检测产品为二价铜离子检测试纸、试剂或试剂盒。
6.一种二价铜离子检测试纸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将玻璃纤维滤纸的疏水区在甲基三氯硅烷-甲苯和盐酸的混合溶液中浸泡改性；
(2)用包括3-丁炔-1-醇、3-叠氮基-7-羟基香豆素和DNA酶的染液浸润玻璃纤维滤纸的亲水区，即得到铜离子检测试纸。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述甲基三氯硅烷-甲苯中甲基三氯硅烷的浓度为1～120mM，所述盐酸的体积分数为20～40％，所述甲基三氯硅烷-甲苯和盐酸的的体积比为1:2～4；所述浸泡改性的时间为5～15min。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述染液中，3-叠氮基-7-羟基香豆素的浓度为40～160μM，3-丁炔-1-醇与3-叠氮基-7-羟基香豆素的的浓度比为1～100:1～20，DNA酶的浓度为0.5～6μM。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述DNA酶是将DNA单链在R缓冲液中变性，再进行重折叠，得到所述的DNA酶；所述R缓冲液包括80～120mM Li-HEPES和80～120mMMgCl2，二者按照体积比1:2～4混合。
10.一种按照权利要求6～9任一项所述的制备方法制备的二价铜离子检测试纸。
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- 2021-03-15 CN CN202110275424.9A patent/CN113049578B/zh active Active
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113049578B (zh) | 2021-12-24 |
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