CN110907421A - 一种基于石墨炔和点击化学的铜离子的检测方法、试剂盒以及应用 - Google Patents

一种基于石墨炔和点击化学的铜离子的检测方法、试剂盒以及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110907421A
CN110907421A CN201911280833.7A CN201911280833A CN110907421A CN 110907421 A CN110907421 A CN 110907421A CN 201911280833 A CN201911280833 A CN 201911280833A CN 110907421 A CN110907421 A CN 110907421A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
concentration
stranded dna
group
graphdine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201911280833.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110907421B (zh
Inventor
鲍世韵
王斗
葛晨晨
刘利平
刘权
吴宗泽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Peoples Hospital
Original Assignee
Shenzhen Peoples Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Peoples Hospital filed Critical Shenzhen Peoples Hospital
Priority to CN201911280833.7A priority Critical patent/CN110907421B/zh
Publication of CN110907421A publication Critical patent/CN110907421A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110907421B publication Critical patent/CN110907421B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6432—Quenching

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

本发明提供了一种基于石墨炔和点击化学的铜离子的检测方法、试剂盒以及应用；所述检测方法包括如下步骤：(1)将石墨炔和基团修饰的双链DNA的混合液中加入浓度梯度的铜离子标准溶液和还原剂，混合，反应，得到反应液，而后通过荧光光谱法测试反应液的荧光强度，根据浓度和荧光强度的关系，绘制标准曲线；(2)将石墨炔和基团修饰的双链DNA的混合液中加入待测样品溶液和还原剂，混合，反应，得到反应液，而后根据荧光光谱法测试反应液的荧光强度，根据步骤(1)得到的标准曲线定量待测样品中铜离子的浓度；在检测体系中选用石墨炔，能够避免采用炔基基团进行修饰，且能大大提高检测效率，简化操作步骤。

Description

一种基于石墨炔和点击化学的铜离子的检测方法、试剂盒以 及应用
技术领域
本发明属于检测领域，涉及一种基于石墨炔和点击化学的铜离子的检测方法、试剂盒以及应用。
背景技术
Cu2+是人类生命代谢过程中大量氧化还原酶和金属蛋白的配体所必需的基本元素。这些酶和蛋白质，如酪氨酸酶、细胞色素c氧化酶和铜蓝蛋白，在电子转移、氧化和还原中起重要作用。因此，生物系统中Cu2+的含量应该严格控制。异常水平的游离Cu2+可能作为氧和蛋白自由基生成的催化剂，导致严重的神经系统疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病和威尔逊病。早期诊断对控制这些疾病的发生发展具有重要意义。例如，尿液中Cu2+的高水平是Wilson病的临床和诊断特点之一，早期通过尿液中Cu2+的检测来筛查疾病可以大大提高患者的治愈率和生活质量。因此，开发一种方便、灵敏的检测生物体液中Cu2+浓度的方法，对于科学研究和临床诊断都是非常重要的。传统的用于检测重金属离子的方法主要有电感耦合等离子原子发射光谱法。这种方法检测准确可靠，但仪器价格昂贵，需要经验丰富的技术人员操作，因而限制了其在基层实验室的应用。近年来，各种依赖于重金属离子能够切割DNA酶结合的底物链的特定位点的检测方法不断被报道，通过重金属切割特异性底物链，使用一系列的方法来检测释放的底物链，检测方法有比色法，荧光法，和胶体金试纸条法等。铜离子能够切割的三股链DNA酶结构的形成需要变性和复性的过程，这增加了操作的难度。
近年来，铜离子催化的点击化学反应因其高效、选择性强而受到人们的广泛关注。Cu+-催化叠氮化物基团和炔基之间的反应，从而形成环加成产物五元三唑环。Cu+的来源是由抗坏血酸钠(SA)还原Cu2+产生的。与此同时，用于点击化学偶联的官能团通常与其他生物分子不发生反应，甚至在有生物液体、细胞或细胞裂解液存在的情况下也几乎没有副反应。
二维纳米材料以其独特的结构、物理和化学性质在生物检测领域引起了广泛的关注。已经有多种基于二维材料进行铜离子检测的报道。例如蒋兴宇的团队利用Cu+-催化点击化学反应诱导功能化氧化石墨烯(GO)与叠氮化荧光染料之间的共轭，GO被证明是一种理想的猝灭荧光的能量受体。
然而，这些常规的利用二维材料进行铜离子检测方法需要将二维材料与额外的炔基配体进行修饰，这增加了反应的复杂程度，同时二维材料修饰的不均一性降低了反应的可重复性。
因此，提供一种检测准确性高、检测限低、特异性高，且无须进行额外的炔基配体进行修饰的铜离子的检测方法非常有必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于石墨炔和点击化学的铜离子的检测方法、试剂盒以及应用，在铜离子的检测过程中，基团修饰的双链DNA具有荧光，石墨炔能够淬灭荧光，二价铜离子能够在还原剂的作用下还原成一价铜离子，从而催化基团修饰的双链DNA和石墨炔点击反应的发生，在检测体系中，直接选用石墨炔，一方面能够避免采用炔基基团对二维材料的修饰，另一方面石墨炔由于优异的荧光共振能量转移能力大大提高了检测效率，简化了操作时间和步骤，此外，具有检测灵敏度高，检测限低，且特异性高的优点。
针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种基于石墨炔和点击化学的铜离子的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：
(1)将石墨炔和基团修饰的双链DNA的混合液中加入浓度梯度的铜离子标准溶液和还原剂，混合，反应，得到反应液，而后通过荧光光谱法测试反应液的荧光强度，根据浓度和荧光强度的关系，绘制标准曲线；
(2)将石墨炔和基团修饰的双链DNA的混合液中加入待测样品溶液和还原剂，混合，反应，得到反应液，而后根据荧光光谱法测试反应液的荧光强度，根据步骤(1)得到的标准曲线定量待测样品中铜离子的浓度。
本发明用于铜离子的检测原理如图1所示，二维石墨炔纳米片的炔基基团和叠氮基团修饰的双链DNA可以在一价铜离子(Cu+)的催化下发生点击化学反应，生成五元三唑环。反应中的Cu+可以由二价铜离子(Cu2+)和还原剂(如抗坏血酸钠)的催化下形成。由于二维石墨炔纳米片可通过荧光共振能量转移淬灭双链DNA修饰的FAM荧光，通过检测荧光信号的变化用于铜离子的检测。基于石墨炔的炔基基团和叠氮基团的点击化学是一种快速、特异的生物正交反应，这类反应只有在Cu+铜离子的催化下才能实现，且两种反应基团与其他化学基团不反应，具有高度特异性，不易受到其他基团的干扰，可用于复杂生物样本的检测。
本发明中使用二维石墨炔纳米片，一方面能够避免使用其他二维材料需要进行炔基修饰，简化了操作时间和步骤，另一方面由于二维石墨炔纳米片优异的荧光共振能量转移能力大大提高了检测效率，具有检测灵敏度高，检测限低，且特异性高的优点。
在本发明中，所述石墨炔和基团修饰的双链DNA的混合液的制备方法包括：将石墨炔和基团修饰的双链DNA在PBS缓冲液中混合，得到所述石墨炔和基团修饰的双链DNA的混合液。
在本发明中，PBS缓冲液是指磷酸盐缓冲液，若后文同样出现PBS缓冲液，其指代的意义均与此处相同。
在本发明中，所述石墨炔的平均粒径为10nm-1μm，例如10nm、30nm、50nm、80nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm等。
在本发明中，所述混合的方式为涡旋震荡混合。
在本发明中，所述混合的时间为1s-30s，例如1s、3s、5s、8s、10s、12s、15s、18s、20s、22s、25s、28s、30s等。
在本发明中，所述基团修饰的双链DNA的制备方法包括：将DNA1和DNA2在PBS缓冲液中混合，得到所述基团修饰的双链DNA。
在本发明中，基团修饰的双链DNA为N3-dsDNA-FAM，其中dsDNA指代的意义是双链DNA，N3指代的意义为叠氮基，FAM指代的意义为羧基荧光素，后文如出现N3和FAM指代的意义均与此处相同。
在本发明中，所述DNA1和DNA2的摩尔比为1:1。
在本发明中，DNA1为被叠氮基和羧基荧光素修饰的DNA序列，本发明对DNA序列不做具体限定，本领域技术人员可根据实际需要进行调整，示例性地如N3-5’-TTTTTT-3’-FAM。
在本发明中，DNA2的序列可以为任意的DNA序列，本发明对此不做具体限定，本领域技术人员可根据实际需要进行调整，示例性地如5’-AAAAAA-3’。
在本发明中，所述混合的温度为80-100℃，例如80℃、82℃、85℃、87℃、90℃、92℃、95℃、97℃、100℃等。
在本发明中，所述混合的时间为3-8min，例如3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃等。
在本发明中，所述基团修饰的双链DNA的保存温度为3-5℃，例如3℃、4℃、5℃等。
在本发明中，步骤(1)所述浓度梯度的铜离子标准溶液是通过PBS缓冲液稀释氯化铜、硫酸铜、硝酸铜、醋酸铜、碳酸铜或氢氧化铜中的任意一种得到的。
在本发明中，步骤(1)所述浓度梯度的铜离子标准溶液的浓度分别为0.10nM、50nM、100nM、500nM、1μM、10μM和100μM。
在本发明中，以石墨炔的添加量为1μg计，步骤(1)所述浓度梯度的铜离子标准溶液的添加体积为1-50μL，例如1μL、5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL、35μL、40μL、45μL、50μL等，优选10μL。
在本发明中，以石墨炔的添加量为1μg计，步骤(2)所述待测样品溶液的添加体积为1-50μL，例如1μL、5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL、35μL、40μL、45μL、50μL等，优选10μL。
在本发明中，所述还原剂为抗坏血酸钠溶液。
在本发明中，所述还原剂的浓度为100-1000μM，例如100μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μM、1000μM等。
在本发明中，以石墨炔的添加量为1μg计，所述还原剂的添加量为1mM，添加体积为1-50μL，例如1μL、5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL、35μL、40μL、45μL、50μL等。
在本发明中，所述步骤(1)和步骤(2)混合后得到的混合物中石墨炔的浓度为5-15μg/mL，例如5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、11μg/mL、12μg/mL、13μg/mL、14μg/mL、15μg/mL等，优选10μg/mL。
在本发明中，所述步骤(1)和步骤(2)混合后得到的混合物中基团修饰的双链DNA的浓度为5-15nM，例如5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM、11nM、12nM、13nM、14nM、15nM等，优选10nM。
在本发明中，所述反应的温度为15-40℃，例如15℃、18℃、20℃、22℃、25℃、27℃、30℃、32℃、35℃、37℃、40℃等。
在本发明中，所述反应的时间为1-3h，例如1h、1.2h、1.5h、1.7h、2h、2.2h、2.5h、2.7h、3h等。
在本发明中，所述荧光光谱法检测用仪器为多功能酶标仪。
在本发明中，所述荧光光谱法的激发波长为460-490nm，(例如460nm、465nm、470nm、475nm、480nm、485nm、490nm等)，发射波长为510-540nm，例如510nm、515nm、520nm、525nm、530nm、535nm、540nm等。
作为本发明的优选技术方案，所述检测方法包括如下步骤：
(1)将DNA1和DNA2按照摩尔比为1:1加入到PBS缓冲液中，在80-100℃混合3-8min，得到基团修饰的双链DNA，在3-5℃保存；
(2)将步骤(1)得到的基团修饰的双链DNA和石墨炔在PBS缓冲液中涡旋震荡混合1-30s，得到石墨炔和基团修饰的双链DNA的混合液；
(3)在步骤(2)得到的石墨炔和基团修饰的双链DNA的混合液中加入浓度梯度的铜离子标准溶液和浓度为100-1000μM的抗坏血酸钠溶液，混合，得到混合物(混合物中石墨炔的浓度为5-15μg/mL，基团修饰的双链DNA的浓度为5-15nM)，其次将混合物在15-40℃反应1-3h，得到反应液，而后通过荧光光谱法测试反应液在激发波长为460-490nm，发射波长为510-540nm的荧光强度，根据浓度和荧光强度的关系，绘制标准曲线；
(4)在步骤(2)得到的石墨炔和基团修饰的双链DNA的混合液中加入待测样品溶液和浓度为100-1000μM的抗坏血酸钠溶液，混合，得到混合物(混合物中石墨炔的浓度为5-15μg/mL，基团修饰的双链DNA的浓度为5-15nM)，其次将混合物在15-40℃反应1-3h，得到反应液，而后通过荧光光谱法测试反应液在激发波长为460nm，发射波长为520nm的荧光强度，根据步骤(3)得到的标准曲线定量待测样品中铜离子的浓度。
本发明的目的之二在于提供一种基于石墨炔和点击化学的铜离子检测试剂盒，所述试剂盒包括：石墨炔、含有叠氮基团的修饰的双链DNA、PBS缓冲液以及抗坏血酸钠。
在本发明中，所述试剂盒中石墨炔的浓度为5-15μg/mL，例如5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、11μg/mL、12μg/mL、13μg/mL、14μg/mL、15μg/mL等，优选10μg/mL；
在本发明中，所述试剂盒中基团修饰的双链DNA的浓度为5-15nM，例如5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM、11nM、12nM、13nM、14nM、15nM等，优选10nM。
本发明的目的之三在于提供一种如目的之二所述的基于石墨炔和点击化学的铜离子检测试剂盒在制备用于评估、检测和/或诊断铜离子代谢疾病的产品中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明中铜离子的检测过程中，修饰的双链DNA具有荧光，石墨炔能够淬灭荧光，二价铜离子能够在还原剂的作用下还原成一价铜离子，从而催化修饰的双链DNA和石墨炔点击反应的发生，在检测体系中，直接选用石墨炔，一方面能够避免采用炔基基团对二维材料的修饰，另一方面石墨炔由于优异的荧光共振能量转移能力大大提高了检测效率，简化了操作时间和步骤，此外，具有检测灵敏度高，检测限低，且特异性高的优点，检测误差均低于8％。
附图说明
图1是发明内容中基于石墨炔和点击化学的铜离子的检测方法的检测机理图；
图2为实施例1中铜离子标准溶液的荧光强度和发射波长的曲线图；
图3为实施例1中铜离子标准溶液的浓度和荧光强度的标准曲线图；
图4为实施例1中铜离子标准溶液的浓度的对数值和荧光强度的标准曲线图；
图5为实施例1中石墨炔和基团修饰的双链DNA的混合液在不同离子存在的情况下的荧光强度。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
具体实施方式中，石墨炔、PBS缓冲液、抗坏血酸钠、氯化铜以及不同金属离子的氯化盐均购自西格玛、阿拉丁等公司。
实施例1
本实施例提供一种基于石墨炔和点击化学的铜离子的检测方法，包括如下步骤：
(1)将浓度为10μM，体积为10μL的DNA1和浓度为10μM，体积为10μL的DNA2加入到PBS缓冲液中，在95℃混合5min，得到基团修饰的双链DNA，在4℃保存；
(2)将步骤(1)得到的基团修饰的双链DNA和2μg石墨炔在0.2mL的PBS缓冲液中涡旋震荡20s，得到石墨炔和基团修饰的双链DNA的混合液；
(3)在步骤(2)得到的石墨炔和基团修饰的双链DNA的混合液中加入体积为20μL浓度分别为100nM、500nM、1μM、5μM、10μM、100μM和1mM的铜离子标准溶液和体积为20μL浓度为5mM的抗坏血酸钠溶液，混合，得到混合物(混合物中石墨炔的浓度为10μg/mL，基团修饰的双链DNA的浓度为10nM)，其次将混合物在25℃反应2h，得到反应液，而后通过荧光光谱法测试反应液在激发波长为460nm，发射波长为520nm的荧光强度，根据浓度和荧光强度的关系，绘制标准曲线；
(4)在步骤(2)得到的石墨炔和基团修饰的双链DNA的混合液中加入待测样品溶液和抗坏血酸钠，混合，得到混合物(混合物中石墨炔的浓度为10μg/mL，基团修饰的双链DNA的浓度为10nM)，其次将混合物在25℃反应2h，得到反应液，而后通过荧光光谱法测试反应液在激发波长为460nm，发射波长为520nm的荧光强度，根据步骤(3)得到的标准曲线定量待测样品中铜离子的浓度。
其中，待测样品溶液为健康人的尿液样品和6组威尔逊病患者的尿液样品(来自深圳人民医院，检测前使用0.22μm的滤膜过滤)。
图2为本实施例中铜离子标准溶液的荧光强度和发射波长的曲线图，从图2可知，随着铜离子浓度的增加，溶液荧光强度逐渐降低。
图3为本实施例中铜离子标准溶液的浓度和荧光强度的标准曲线图，图4为本实施例中铜离子标准溶液的浓度的对数值和荧光强度的标准曲线图，得到线性回归方程y＝785.19x+4061.54，由回归方程得到线性相关系数(R2)为0.976，说明该标准曲线的线性良好，且检测限低至50nM。
以该标准曲线为依据，对健康人的尿液样品和6组威尔逊病患者的尿液样品中的铜离子浓度进行检测，检测结果见表1：
表1
Figure BDA0002316699710000101
其中，a为根据本实施例提供的检测方法测试的实验结果；
b为根据ICP-OES测得的实验结果。
由表1可知，本实施例提供的基于石墨炔和点击化学的铜离子的检测方法与ICP-OES检测方法相比，其相对误差均低于8％，说明该检测方法准确可靠。
将待测样品溶液和抗坏血酸钠溶液加入到石墨炔和基团修饰的双链DNA的混合液，发现威尔逊病患者的尿液得到的混合液的荧光强度明显下降，说明威尔逊病患者尿液中Cu2+浓度远高于健康人。
本实施例还提供了基团修饰的双链DNA和石墨炔的混合液对于其他金属离子的抗干扰能力测试，金属离子包括Cu2+、K+、Na+、Pb2+、Hg2+、Ba2+、Cd2+、Sr2+、Fe2+、Mg2+、Co2+，其中Cu2+的浓度为100μM，其他金属离子的浓度为1mM，如图5可知，基团修饰的双链DNA和石墨炔的混合液只有在铜离子和抗坏血酸钠同时存在的时候才会发生荧光信号的变化，证明了其他离子不会对该检测体系造成干扰。
本实施例还提供了回收率和精密度实验：采用阴性样品(不含铜离子)进行检测，用样品中加标准溶液的方法，按照同样的检测方法，进行加标回收率实验，选取三个浓度，每个浓度做3个平行样，每个平行样在相同的条件下连续测5次，计算相对标准偏差，结果见表2：
表2
Figure BDA0002316699710000111
由表2可知，平均加标回收率可达70％以上，相对标准偏差小于6％，说明本实施例的检测方法准确度较高。
实施例2
本实施例提供一种基于石墨炔和点击化学的铜离子的检测方法，包括如下步骤：
(1)将浓度为5μM体积为10μL的DNA1和浓度为5μM体积为10μL的DNA2加入到PBS缓冲液中，在80℃混合8min，得到基团修饰的双链DNA，在4℃保存；
(2)将步骤(1)得到的基团修饰的双链DNA和2.5μg石墨炔在0.5mL的PBS缓冲液中涡旋震荡混合30s，得到石墨炔和基团修饰的双链DNA的混合液；
(3)在步骤(2)得到的石墨炔和基团修饰的双链DNA的混合液中加入体积为50μL浓度分别为100nM、500nM、1μM、5μM、10μM、100μM和1mM的铜离子标准溶液和体积为50μL浓度为1mM的抗坏血酸钠溶液，混合，得到混合物(混合物中石墨炔的浓度为5μg/mL，基团修饰的双链DNA的浓度为5nM)，其次将混合物在15℃反应3h，得到反应液，而后通过荧光光谱法测试反应液在激发波长为460nm，发射波长为520nm的荧光强度，根据浓度和荧光强度的关系，绘制标准曲线；
(4)在步骤(2)得到的石墨炔和基团修饰的双链DNA的混合液中加入待测样品溶液和抗坏血酸钠，混合，得到混合物(混合物中石墨炔的浓度为5μg/mL，基团修饰的双链DNA的浓度为5nM)，其次将混合物在15℃反应3h，得到反应液，而后通过荧光光谱法测试反应液在激发波长为460nm，发射波长为520nm的荧光强度，根据步骤(3)得到的标准曲线定量待测样品中铜离子的浓度。
以步骤(3)做的标准曲线为依据，对对健康人的尿液样品和6组威尔逊病患者的尿液样品中的铜离子浓度进行检测，检测结果见表3：
表3
Figure BDA0002316699710000121
Figure BDA0002316699710000131
其中，a为根据本实施例提供的检测方法测试的实验结果；
b为根据ICP-OES测得的实验结果。
由表1可知，本实施例提供的基于石墨炔和点击化学的铜离子的检测方法与ICP-OES检测方法相比，其相对误差均低于7％，说明该检测方法准确可靠。
实施例3
本实施例提供一种基于石墨炔和点击化学的铜离子的检测方法，包括如下步骤：
(1)将浓度为15μM体积为10μL的DNA1和浓度为15μM体积为10μL的DNA2加入到PBS缓冲液中，在100℃混合3min，得到基团修饰的双链DNA，在4℃保存；
(2)将步骤(1)得到的基团修饰的双链DNA和7.5μg石墨炔在0.5mL的PBS缓冲液中涡旋震荡混合10s，得到石墨炔和基团修饰的双链DNA的混合液；
(3)在步骤(2)得到的石墨炔和基团修饰的双链DNA的混合液中加入体积为50μL浓度分别为100nM、500nM、1μM、5μM、10μM、100μM和1mM的铜离子标准溶液和体积为50μL浓度为1mM的抗坏血酸钠溶液，混合，得到混合物(混合物中石墨炔的浓度为15μg/mL，基团修饰的双链DNA的浓度为15nM)，其次将混合物在40℃反应1h，得到反应液，而后通过荧光光谱法测试反应液在激发波长为460nm，发射波长为520nm的荧光强度，根据浓度和荧光强度的关系，绘制标准曲线；
(4)在步骤(2)得到的石墨炔和基团修饰的双链DNA的混合液中加入待测样品溶液和抗坏血酸钠，混合，得到混合物(混合物中石墨炔的浓度为15μg/mL，基团修饰的双链DNA的浓度为15nM)，其次将混合物在40℃反应1h，得到反应液，而后通过荧光光谱法测试反应液在激发波长为460nm，发射波长为520nm的荧光强度，根据步骤(3)得到的标准曲线定量待测样品中铜离子的浓度。
以步骤(3)做的标准曲线为依据，对对健康人的尿液样品和6组威尔逊病患者的尿液样品中的铜离子浓度进行检测，检测结果见表4：
表4
Figure BDA0002316699710000141
其中，a为根据本实施例提供的检测方法测试的实验结果；
b为根据ICP-OES测得的实验结果。
由表1可知，本实施例提供的基于石墨炔和点击化学的铜离子的检测方法与ICP-OES检测方法相比，其相对误差均低于7％，说明该检测方法准确可靠。
对比例1
与实施例1的区别仅在于将石墨炔替换为石墨烯，其余检测方法均与实施例1相同。
通过将实施例1中的石墨炔替换为石墨烯，无法检测铜离子的含量，是因为石墨烯无法和叠氮基团修饰的双链DNA在Cu+的催化下发生点击反应，从而无法检测Cu2+的含量。
对比例2
与实施例1的区别仅在于基团修饰的双链DNA不进行基团修饰，其余检测方法均与实施例1相同。
通过将实施例1中的基团修饰的双链DNA不进行FAM基团修饰，该双链DNA不具备荧光性，因此，无法发生荧光共振能量转移反应，从而无法检测铜离子的含量。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种基于石墨炔和点击化学的铜离子的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
(1)将石墨炔和基团修饰的双链DNA的混合液中加入浓度梯度的铜离子标准溶液和还原剂，混合，反应，得到反应液，而后通过荧光光谱法测试反应液的荧光强度，根据浓度和荧光强度的关系，绘制标准曲线；
(2)将石墨炔和基团修饰的双链DNA的混合液中加入待测样品溶液和还原剂，混合，反应，得到反应液，而后根据荧光光谱法测试反应液的荧光强度，根据步骤(1)得到的标准曲线定量待测样品中铜离子的浓度。
2.根据权利要求1所述的基于石墨炔和点击化学的铜离子的检测方法，其特征在于，所述石墨炔和基团修饰的双链DNA的混合液的制备方法包括：将石墨炔和基团修饰的双链DNA在PBS缓冲液中混合，得到所述石墨炔和基团修饰的双链DNA的混合液；
优选地，所述石墨炔的平均粒径为10nm-1μm；
优选地，所述混合的方式为涡旋震荡混合；
优选地，所述混合的时间为1-30s。
3.根据权利要求1或2所述的基于石墨炔和点击化学的铜离子的检测方法，其特征在于，所述基团修饰的双链DNA的制备方法包括：将DNA1和DNA2在PBS缓冲液中混合，得到所述基团修饰的双链DNA；
优选地，所述DNA1和DNA2的摩尔比为1:1；
优选地，所述混合的温度为25-37℃；
优选地，所述混合的时间为1-30min；
优选地，所述基团修饰的双链DNA的保存温度为0-5℃。
4.根据权利要求1-3任一项所述的基于石墨炔和点击化学的铜离子的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述浓度梯度的铜离子标准溶液是通过PBS缓冲液稀释氯化铜溶液、硫酸铜溶液、硝酸铜溶液、醋酸铜溶液、碳酸铜溶液或氢氧化铜溶液中的任意一种得到的；
优选地，步骤(1)所述浓度梯度的铜离子标准溶液的浓度分别为0.10nM、50nM、100nM、500nM、1μM、10μM和100μM；
优选地，以石墨炔的添加量为1μg计，步骤(1)所述浓度梯度的铜离子标准溶液的添加体积为1-50μL；
优选地，以石墨炔的添加量为1μg计，步骤(2)所述待测样品溶液的添加体积为1-50μL。
5.根据权利要求1-4任一项所述的基于石墨炔和点击化学的铜离子的检测方法，其特征在于，所述还原剂为抗坏血酸钠溶液；
优选地，所述还原剂的浓度为100-1000μM；
优选地，以石墨炔的添加量为1μg计，所述还原剂的添加浓度为1mM，还原剂的添加体积为1-50μL；
优选地，所述步骤(1)和步骤(2)混合后得到的混合物中石墨炔的浓度为5-15μg/mL，优选10μg/mL；
优选地，所述步骤(1)和步骤(2)混合后得到的混合物中基团修饰的双链DNA的浓度为5-15nM，优选10nM；
优选地，所述反应的温度为15-40℃；
优选地，所述反应的时间为1-3h。
6.根据权利要求1-5任一项所述的基于石墨炔和点击化学的铜离子的检测方法，其特征在于，所述荧光光谱法检测用仪器为多功能酶标仪；
优选地，所述荧光光谱法的激发波长为460-490nm，发射波长为515-540nm。
7.根据权利要求1-6任一项所述的基于石墨炔和点击化学的铜离子的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
(1)将DNA1和DNA2按照摩尔比为1:1加入到PBS缓冲液中，在80-100℃混合3-8min，得到基团修饰的双链DNA，在3-5℃保存；
(2)将步骤(1)得到的基团修饰的双链DNA和石墨炔在PBS缓冲液中涡旋震荡混合1-30s，得到石墨炔和基团修饰的双链DNA的混合液；
(3)在步骤(2)得到的石墨炔和基团修饰的双链DNA的混合液中加入浓度梯度的铜离子标准溶液和浓度为100-1000μM的抗坏血酸钠溶液，混合，得到混合物(混合物中石墨炔的浓度为5-15μg/mL，基团修饰的双链DNA的浓度为5-15nM)，其次将混合物在15-40℃反应1-3h，得到反应液，而后通过荧光光谱法测试反应液在激发波长为460-490nm，发射波长为510-540nm的荧光强度，根据浓度和荧光强度的关系，绘制标准曲线；
(4)在步骤(2)得到的石墨炔和基团修饰的双链DNA的混合液中加入待测样品溶液和浓度为100-1000μM的抗坏血酸钠溶液，混合，得到混合物(混合物中石墨炔的浓度为5-15μg/mL，基团修饰的双链DNA的浓度为5-15nM)，其次将混合物在15-40℃反应1-3h，得到反应液，而后通过荧光光谱法测试反应液在激发波长为460nm，发射波长为520nm的荧光强度，根据步骤(3)得到的标准曲线定量待测样品中铜离子的浓度。
8.一种基于石墨炔和点击化学的铜离子检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：权利要求1-7任一项所述的石墨炔、含有叠氮基团的修饰的双链DNA、PBS缓冲液以及抗坏血酸钠。
9.根据权利要求8所述的基于石墨炔和点击化学的铜离子检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中石墨炔的浓度为5-15μg/mL，优选10μg/mL；
优选地，所述试剂盒中基团修饰的双链DNA的浓度为5-15nM，优选10nM。
10.根据权利要求8或9所述的基于石墨炔和点击化学的铜离子检测试剂盒在制备用于评估、检测和/或诊断铜离子代谢疾病的产品中的应用。
CN201911280833.7A 2019-12-13 2019-12-13 一种基于石墨炔和点击化学的铜离子的检测方法、试剂盒以及应用 Active CN110907421B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911280833.7A CN110907421B (zh) 2019-12-13 2019-12-13 一种基于石墨炔和点击化学的铜离子的检测方法、试剂盒以及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911280833.7A CN110907421B (zh) 2019-12-13 2019-12-13 一种基于石墨炔和点击化学的铜离子的检测方法、试剂盒以及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110907421A true CN110907421A (zh) 2020-03-24
CN110907421B CN110907421B (zh) 2022-06-17

Family

ID=69825378

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911280833.7A Active CN110907421B (zh) 2019-12-13 2019-12-13 一种基于石墨炔和点击化学的铜离子的检测方法、试剂盒以及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110907421B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113049578A (zh) * 2021-03-15 2021-06-29 宁波大学 一种dna酶及其应用和一种基于dna酶的铜离子检测试纸及其制备方法
CN113049565A (zh) * 2021-04-30 2021-06-29 南京师范大学 一种Bi3+浓度的快速检测方法
CN113138183A (zh) * 2021-04-30 2021-07-20 南京师范大学 一种基于石墨炔量子点荧光淬灭作用的阿莫西林的检测方法
CN113773894A (zh) * 2021-09-14 2021-12-10 曲阜师范大学 一种石墨炔基固液复合润滑薄膜的制备方法及其应用
CN114280015A (zh) * 2021-11-30 2022-04-05 苏州科技大学 石墨炔/血红素复合材料的应用及采用该材料对还原型小分子检测的方法
CN116539686A (zh) * 2023-04-20 2023-08-04 宁波大学 基于点击化学和快速扫描伏安法的单原子检测铜离子电化学传感器的制备方法及应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130231473A1 (en) * 2012-03-01 2013-09-05 Tom Brown Oligonucleotide ligation
CN103558215A (zh) * 2013-11-06 2014-02-05 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种基于点击化学和g四聚体的铜离子检测试剂盒以及检测方法
WO2014200164A1 (ko) * 2013-06-11 2014-12-18 한국기초과학지원연구원 초고감도 및 높은 선택성을 갖는 구리이온 검출용 조성물 및 형광화학센서
CN104611419A (zh) * 2014-12-29 2015-05-13 江苏大学 一种基于石墨烯氧化物芯片dna解旋酶的检测方法
CN105352924A (zh) * 2015-10-21 2016-02-24 广东省生态环境与土壤研究所 一种铜离子检测方法及检测试剂盒
CN105372220A (zh) * 2015-11-25 2016-03-02 中国科学院过程工程研究所 二维石墨炔材料用于生物标志物荧光检测的非诊断目的的应用
CN105717290A (zh) * 2014-10-21 2016-06-29 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种基于点击化学的二价铜离子的检测方法及试剂盒
CN107064515A (zh) * 2017-03-13 2017-08-18 广东省生态环境技术研究所 一种基于点击化学的铜离子检测方法及检测试剂盒

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130231473A1 (en) * 2012-03-01 2013-09-05 Tom Brown Oligonucleotide ligation
WO2014200164A1 (ko) * 2013-06-11 2014-12-18 한국기초과학지원연구원 초고감도 및 높은 선택성을 갖는 구리이온 검출용 조성물 및 형광화학센서
CN103558215A (zh) * 2013-11-06 2014-02-05 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种基于点击化学和g四聚体的铜离子检测试剂盒以及检测方法
CN105717290A (zh) * 2014-10-21 2016-06-29 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种基于点击化学的二价铜离子的检测方法及试剂盒
CN104611419A (zh) * 2014-12-29 2015-05-13 江苏大学 一种基于石墨烯氧化物芯片dna解旋酶的检测方法
CN105352924A (zh) * 2015-10-21 2016-02-24 广东省生态环境与土壤研究所 一种铜离子检测方法及检测试剂盒
CN105372220A (zh) * 2015-11-25 2016-03-02 中国科学院过程工程研究所 二维石墨炔材料用于生物标志物荧光检测的非诊断目的的应用
CN107064515A (zh) * 2017-03-13 2017-08-18 广东省生态环境技术研究所 一种基于点击化学的铜离子检测方法及检测试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
杨立敏 等: "纳米荧光探针用于核酸分子的检测及成像研究", 《化学学报》 *
邱素艳等: "点击化学最新进展", 《化学进展》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113049578A (zh) * 2021-03-15 2021-06-29 宁波大学 一种dna酶及其应用和一种基于dna酶的铜离子检测试纸及其制备方法
CN113049565A (zh) * 2021-04-30 2021-06-29 南京师范大学 一种Bi3+浓度的快速检测方法
CN113138183A (zh) * 2021-04-30 2021-07-20 南京师范大学 一种基于石墨炔量子点荧光淬灭作用的阿莫西林的检测方法
CN113138183B (zh) * 2021-04-30 2024-05-28 南京师范大学 一种基于石墨炔量子点荧光淬灭作用的阿莫西林的检测方法
CN113773894A (zh) * 2021-09-14 2021-12-10 曲阜师范大学 一种石墨炔基固液复合润滑薄膜的制备方法及其应用
CN114280015A (zh) * 2021-11-30 2022-04-05 苏州科技大学 石墨炔/血红素复合材料的应用及采用该材料对还原型小分子检测的方法
CN116539686A (zh) * 2023-04-20 2023-08-04 宁波大学 基于点击化学和快速扫描伏安法的单原子检测铜离子电化学传感器的制备方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110907421B (zh) 2022-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110907421B (zh) 一种基于石墨炔和点击化学的铜离子的检测方法、试剂盒以及应用
US8172997B2 (en) Cerium oxide nanoparticle regenerative free radical sensor
CN109266332B (zh) 一种用于定量检测血液中AChE和BChE的比率型荧光探针的制备方法
Ji et al. Enhanced luminol chemiluminescence with oxidase-like properties of FeOOH nanorods for the sensitive detection of uric acid
Ge et al. Human serum albumin templated MnO 2 nanosheets as an efficient biomimetic oxidase for biomolecule sensing
Shobana Nanoferrites in biosensors–a review
Lee et al. A comprehensive review on emerging role of rare earth oxides in electrochemical biosensors
Chauhan et al. Immobilization of barley oxalate oxidase onto gold–nanoparticle-porous CaCO3 microsphere hybrid for amperometric determination of oxalate in biological materials
Chen et al. Signal-on bimodal sensing glucose based on enzyme product-etching MnO2 nanosheets for detachment of MoS2 quantum dots
Li et al. Enhanced peroxidase-like activity of MOF nanozymes by co-catalysis for colorimetric detection of cholesterol
Finny et al. Cerium oxide nanoparticles for chemical and biological sensors: properties, sensing designs, and applications
Song et al. Bioactivity-protective electrochemiluminescence sensor using CeO2/Co4N heterostructures as highly effective coreaction accelerators for ultrasensitive immunodetection
Zhao et al. MOF-derived porous Co3O4 coupled with AuNPs and nucleic acids as electrocatalysis signal probe for sensitive electrochemical aptasensing of adenosine triphosphate
Chen et al. Enhancing catalytic performance of Fe and Mo co-doped dual single-atom catalysts with dual-enzyme activities for sensitive detection of hydrogen peroxide and uric acid
Tan et al. Determination of uric acid in serum by SERS system based on VO-MnCo2O4/Ag nanozyme
CN105738447A (zh) 一种电化学氯霉素生物传感器的制备方法及应用
CN113358726A (zh) 用于电化学方法检测肌酐的电极、试纸及其制备方法
CN112525963B (zh) 一种基于ZnO纳米材料的电化学生物传感器及其进行葡萄糖浓度检测的方法
Cheng et al. Colorimetric and electrochemical integrated dual-mode detection of glucose by utilizing CoOOH@ Cu nanosheets as peroxidase mimetics
Hu et al. Inorganic–organic hybrid materials to detect urinary biomarkers: recent progress and future prospects
Liu et al. Colorimetric and electrochemical dual-mode uric acid determination utilizing peroxidase-mimicking activity of CoCu bimetallic nanoclusters
CN112179875B (zh) 一种一型透明质酸酶荧光纳米传感器的制备及应用
Fei et al. A biosensor based on Fe3O4@ MXene-Au nanocomposites with high peroxidase-like activity for colorimetric and smartphone-based detection of glucose
CN113861962A (zh) 一种比率型荧光探针及其制备方法和在检测过氧化氢中的应用
CN113913183A (zh) 一种氧化型tmb纳米材料及其在检测谷胱甘肽中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant