CN113092784A - 功能化磁珠及采用其的生物正交化学的大分子一步捕获方法 - Google Patents

功能化磁珠及采用其的生物正交化学的大分子一步捕获方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113092784A
CN113092784A CN202110376388.5A CN202110376388A CN113092784A CN 113092784 A CN113092784 A CN 113092784A CN 202110376388 A CN202110376388 A CN 202110376388A CN 113092784 A CN113092784 A CN 113092784A
Authority
CN
China
Prior art keywords
magnetic
solution
magnetic bead
magnetic beads
aqueous solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110376388.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113092784B (zh
Inventor
李楠
王蕾
王维杰
赵文娟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Original Assignee
Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS filed Critical Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority to CN202110376388.5A priority Critical patent/CN113092784B/zh
Publication of CN113092784A publication Critical patent/CN113092784A/zh
Priority to PCT/CN2021/138134 priority patent/WO2022213656A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113092784B publication Critical patent/CN113092784B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明提供一种功能化磁珠及采用其的生物正交化学的大分子一步捕获方法，该功能化磁珠为非偶联抗体小分子修饰的磁珠，利用该磁珠捕获大分子的方法不涉及抗原抗体反应，采用点击化学中的叠氮炔环加成反应原理，避免了非特异性结合蛋白的产生，一步法捕获蛋白质生物大分子，更加直接、高效、背景更低，且适用于变性条件下的蛋白捕获，适用性更广泛。

Description

功能化磁珠及采用其的生物正交化学的大分子一步捕获方法
技术领域
本发明涉及生物大分子捕获技术领域，具体涉及一种功能化磁珠及采用其的生物正交化学的大分子一步捕获方法。
背景技术
每个细胞的细胞内信号传递和细胞间通信主要依赖于蛋白质的功能及其特定的相互作用，因此，研究蛋白质相互作用是破译细胞生命活动的关键。然而一个哺乳动物细胞约有一万种不同的蛋白质，发生相互作用的蛋白质通常是低丰度的，含量只有不到1％，对于深入鉴定细胞的整个蛋白质组来说将会是巨大的挑战，即使是当今最先进的质谱仪，由于有限的检测速度和动态检测范围，也无法做到低丰度蛋白质的完全鉴定。如果要鉴定时间和空间方面特征的亚蛋白质组，那么这将会是一项更加困难的任务，关键之处在于亚蛋白质组的分离和富集。为了对新合成的蛋白质进行分离，已有研究者开发了一种生物正交非天然氨基酸标记技术(BONCAT，bioorthogonal noncanonical amino acid tagging)，这种技术是利用细胞自身翻译机制，使人们能够用生物正交非天然氨基酸来标记、识别和富集新合成的蛋白质亚群，也能结合亚细胞分离技术获得蛋白质在空间分布上的新合成蛋白质及其互作蛋白信息。
在调控生命活动的过程中，除了蛋白质之间的相互作用，RNA和蛋白质之间也会发生互作，从而调节彼此的功能，RNA与蛋白质的相互作用对于维持细胞稳态是非常重要的，而干扰两者的相互作用会造成细胞功能失调和相关疾病的发生。因此研究和鉴定RNA的相互作用网络，有助于科学家解决特定研究问题。而最新的研究方法也应用到生物正交非天然核苷酸标记技术，是利用非天然核苷酸在DNA转录时嵌入到新转录的RNA中，可以对新转录的 RNA或新转录的RNA-蛋白质复合物进行标记、识别和富集，后续进行RNA 测序以及质谱分析，可以鉴定并得到RNA及其互作蛋白的信息。
上述两种生物大分子标记技术涉及了点击化学(click chemistry)反应和亲和纯化技术。
点击化学(click chemistry)反应是由化学家K.B.Sharpless在2001 年引入的一种化学合成概念，其代表反应是叠氮炔环加成反应，在亚铜离子的催化下，叠氮(azide)基团和炔基(alkyne)反应生成三唑环(triazole)，从而把想要的官能团链接起来。亲和纯化技术：通过给蛋白质添加标签，例如：His、GST、HA及FLAG等，利用标签与其特异性配体之间的特异亲和力，使用特异性配体修饰的固相载体对标签化蛋白进行捕获，从而达到分离纯化的目的。
文献1“BONCAT：Metabolic Labeling，Click Chemistry，and AffinityPurification of Newly Synthesized Proteomes”(DOI： org/10.1007/978-1-4939-2272-7_14)公开了生物正交非天然氨基酸标记的蛋白质相互作用的捕获方法，如图1所示，细胞在培养时添加叠氮化非天然氨基酸，新合成的蛋白质(橙色)会含有叠氮基团，可通过点击化学反应将带有炔基的生物素亲和标签进行标记。生物素和链霉亲和素可以发生特异性结合，标记的新合成蛋白可以通过Western blot分析或使用含有链霉亲和素的固相载体进行亲和纯化、质谱鉴定蛋白质信息。
文献2“Capturing the interactome of newly transcribed RNA”(DOI：10.1038/nmeth.4595)公开了生物正交非天然核苷酸标记的新转录RNA相互作用组的捕获方法，如图2所示，使用含有炔基的尿嘧啶类似物EU (5-ethynyluridine)在细胞培养时对新转录的RNA进行标记，利用点击化学反应(click reaction)对EU标记的RNA进行生物素化，通过链霉亲和素固相载体(Streptavidin-coated beads)对生物素化的RNA进行亲和纯化，对RNA 测序和蛋白质组质谱鉴定，即可得到RNA及其相互作用组信息。
如上述两篇文献所介绍，在现阶段生物大分子，如蛋白质组、RNA组学研究中，在细胞培养阶段的某一时间节点下，用一种非天然氨基酸替代对应的天然氨基酸，非天然氨基酸带有炔基或叠氮基团，是天然氨基酸的类似物，在蛋白质合成的过程中会被当作天然氨基酸，嵌入到新生成的蛋白质中，从而使新生蛋白带有炔基或叠氮基团，通过点击化学反应，可以将带有叠氮基团或炔基的分子探针链接在这些蛋白质上，分子探针末端的报告基团含有生物素，能够特异性地与对应链霉亲和素磁珠结合，形成蛋白质-探针-磁珠的复合体，对复合体进行磁性分离、洗去杂质和蛋白洗脱，即可实现新生蛋白的富集与纯化，最后进行LC-MS分析获得新生蛋白质组信息。
但是，现有的这种生物大分子捕获研究中，蛋白质需要先与探针结合，再利用探针与磁珠的特异性反应，通过两步法将蛋白连接到磁珠上。其主要有以下缺点：1、所使用的磁珠一般是偶联抗体的磁珠，大部分抗体无法耐受变性条件，从而限制了磁珠的使用范围，且抗原抗体的反应偶有非特异性结合的发生；2、所采用的两步法中涉及的分子探针、磁珠，价格均较为昂贵，同时实验需要投入的时间也更久。
文献3“Selective enrichment of newly synthesized proteins forquantitative secretome analysis”(DOI：10.1038/nbt.2356)公开了一种含有炔基的树脂，通过在生物大分子添加上叠氮化非天然氨基酸，叠氮基团与树脂的炔基基团发生反应，不涉及抗原抗体反应，避免了非特异性结合蛋白的产生，采用一步法即可实现生物大分子的捕获，但是采用这种方法反应时间长达十几个小时。
发明内容
本发明的目的提供一种功能化磁珠的合成方法及蛋白质生物正交化学的大分子一步捕获方法，用于蛋白质组学研究，其所使用的功能化磁珠为非偶联抗体小分子修饰的磁珠，方法不涉及抗原抗体反应，采用点击化学中的叠氮炔环加成反应原理，避免了非特异性结合蛋白的产生，采用一步法捕获蛋白质生物大分子，更加直接、高效、背景更低，且适用于变性条件下的蛋白捕获，适用性更广泛。
为解决上述技术问题，本发明提供一种炔基化磁珠，其采用 NH3-PEG4-Alkyne与羧基磁珠偶联合成。
该炔基化磁珠的制备方法如下：
第一步，羧基磁珠悬液进行磁性分离，除去上清液；
第二步，在分离产物中加入有机溶剂，使用移液器缓慢吹打多次，以重悬磁珠，再次磁性分离，去除上清液，重复洗涤多次分离产物，重悬磁珠在有机溶剂中，获得磁珠悬液；
第三步，配置(N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐)第一溶液，用于活化羧基；
第四步，配置(NH3-PEG4-Alkyne)第二溶液；
第五步，将第三步获得的第一溶液加入第二步获得的磁珠悬液中；
第六步，将第二溶液加入第五步获得的磁珠悬液中；
第七步，将第六步获得的混合液置于37℃摇床中，摇晃孵育；
第八步，磁性分离，去除上清液；
第九步，加入乙醇进行吹打重悬，磁性分离，去除上清液，对分离产物重复洗涤，最后重悬磁珠在乙醇水溶液中；
第十步，在4℃的条件下保存。
本发明提供一种叠氮化磁珠，其采用叠氮基丙胺与羧基磁珠偶联合成。
该叠氮化磁珠的制备方法如下：
第一步，羧基磁珠悬液进行磁性分离，除去上清液；
第二步，在分离产物中加入有机溶剂，使用移液器缓慢吹打多次，以重悬磁珠，再次磁性分离，去除上清液，重复洗涤多次分离产物，重悬磁珠在有机溶剂中，获得磁珠悬液；
第三步，配置(N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐)第一溶液，用于活化羧基；
第四步，配置叠氮基丙胺第二溶液；
第五步，将第三步获得的第一溶液加入第二步获得的磁珠悬液中；
第六步，将第二溶液加入第五步获得的磁珠悬液中；
第七步，将第六步获得的混合液置于37℃摇床中，摇晃孵育；
第八步，磁性分离，去除上清液；
第九步，加入乙醇进行吹打重悬，磁性分离，去除上清液，对分离产物重复洗涤，最后重悬磁珠在乙醇水溶液中；
第十步，在4℃的条件下保存。
本发明还提供一种生物正交化学的大分子一步捕获方法，其采用功能化磁珠与生物大分子通过点击化学反应获得。
所述功能化磁珠可以为上述制备的叠氮化磁珠或炔基化磁珠。
所述生物大分子可以为嵌入了炔基或叠氮非天然氨基酸的蛋白质，以及嵌入了炔基或叠氮非天然核苷酸的核酸。
所述点击化学反应为叠氮炔环加成反应。
该方法具体包括：
第一步，配置硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液、(三(3-羟丙基三氮基甲基)胺)水溶液、十二烷基硫酸钠水溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液、尿素水溶液、乙腈水溶液；
第二步，取上面制备的磁珠悬液，使用蛋白或核酸缓冲液置换，重悬于蛋白缓冲液中；
第三步，按顺序依次加入硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液、(三(3-羟丙基三氮基甲基)胺)水溶液、待捕获的蛋白样品、第二步制备的磁珠悬液和超纯水；
第四步，配置好反应混合液后，放在恒温混匀仪上，孵育；
第五步，磁性分离；
第六步，还原烷基化；
第七步，洗涤磁珠；
第八步，磁珠上的蛋白经胰蛋白酶消化，用于LC-MS分析。
本发明的有益效果
1、现有两步法技术是通过抗原抗体反应来富集蛋白质，为了保证抗体的反应性，磁珠需要在温和的条件下使用，本发明合成的磁珠是小分子修饰的磁珠，不涉及抗原抗体反应，在蛋白质捕获过程中以及捕获后的除杂过程都能够在强变性条件(如含SDS、尿素、盐酸胍等)下进行，适用范围更广，同时能够更好地去除非特异性结合，背景信号更低；
2、现有技术通过两步法富集蛋白质，本发明只需要一步法，操作简便高效，节省实验时间；
3、现有两步法技术使用的抗体修饰磁珠、分子探针价格较为昂贵，本发明所需的磁珠与反应物价格低廉，一次大量合成可以长期保存和使用，降低了实验成本；
4、现有参考文献3采用了一步法，但是其提供的炔基化树脂，操作性差，体现在固液分离时需要进行离心，并且容易粘附在离心管壁，进行移液操作时树脂丢失率高，固液分离不完全，无法完全移除液体，因此在洗涤树脂时需要进行更多的洗涤步骤，本发明的炔基化磁珠可利用磁性进行固液分离，无需繁琐的离心，分离效率高，节省时间及试剂；
5、现有一步法要求点击化学反应时间较长(18小时)，而本发明只需反应1-2小时，大大节省实验时间。
附图说明
图1炔基化磁珠与Azide-488反应流程；
图2荧光结合效率的检测结果。
具体实施方式
本发明提供一种炔基化磁珠，其采用NH3-PEG4-Alkyne与羧基磁珠偶联合成。
本发明还提供一种叠氮化磁珠，其采用叠氮基丙胺与羧基磁珠偶联合成。
所述羧基磁珠的核心部分为四氧化三铁，外部包覆含有羧基的树脂，优选市售的羧基磁珠。
该炔基化磁珠的制备方法如下：
第一步，羧基磁珠悬液进行磁性分离，除去上清液；
第二步，在分离产物中加入有机溶剂，使用移液器缓慢吹打多次，以重悬磁珠，再次磁性分离，去除上清液，重复洗涤多次分离产物，重悬磁珠在有机溶剂中，获得磁珠悬液；
第三步，配置(N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐)第一溶液，用于活化羧基；
第四步，配置(NH3-PEG4-Alkyne)第二溶液；
第五步，将第三步获得的第一溶液加入第二步获得的磁珠悬液中；
第六步，将第二溶液加入第五步获得的磁珠悬液中；
第七步，将第六步获得的混合液置于37℃摇床中，摇晃孵育；
第八步，磁性分离，去除上清液；
第九步，加入乙醇进行吹打重悬，磁性分离，去除上清液，对分离产物重复洗涤，最后重悬磁珠在乙醇水溶液中；
第十步，在4℃的条件下保存。
该制备方法进一步具体为：
第一步，羧基磁珠悬液置于离心管中，放在磁力架上等待1-3min，进一步优选2min，进行磁性分离，用移液器吸走并丢弃上清液；
第二步，在分离产物中加入有机溶剂，有机溶剂优选DMF，每1ml第一步使用的羧基磁珠悬液使用1ml有机溶剂，使用移液器缓慢吹打8-12次，优选10次，以重悬磁珠，再次磁性分离1-3min，优选2min，去除上清液，重复洗涤3-5次分离产物，重悬磁珠在有机溶剂中，有机溶剂优选DMF，获得磁珠悬液；
第三步，配置(N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐)第一溶液，浓度为5-15mg/mL，进一步优选为10mg/mL；
第四步，配置(NH3-PEG4-Alkyne)第二溶液，浓度为150mg/mL-250mg/mL，进一步优选200mg/mL；
第五步，将第三步获得的第一溶液加入第二步获得的磁珠悬液中，添加量为1ml磁珠悬液对应5ml第一溶液；
第六步，将第二溶液加入第五步获得的磁珠悬液中，添加量为1ml磁珠悬液对应10μl第二溶液；
第七步，将第六步获得的混合液置于37℃摇床中，摇晃孵育1-3小时，优选2小时；
第八步，磁性分离1-3min，优选2min，去除上清液；
第九步，加入乙醇浓度10％-30％，优选20％的乙醇溶液，进行吹打重悬，磁性分离1-3min，进一步优选2min，去除上清液，对分离产物重复洗涤4-6 次，最后重悬磁珠在醇浓度10％-30％，优选20％的乙醇水溶液中；
第十步，该磁珠悬液保存于4℃，避免冻结。
该炔基化磁珠的制备方法如下：
第一步，羧基磁珠悬液进行磁性分离，除去上清液；
第二步，在分离产物中加入有机溶剂，使用移液器缓慢吹打多次，以重悬磁珠，再次磁性分离，去除上清液，重复洗涤多次分离产物，重悬磁珠在有机溶剂中，获得磁珠悬液；
第三步，配置(N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐)第一溶液，用于活化羧基；
第四步，配置叠氮基丙胺第二溶液；
第五步，将第三步获得的第一溶液加入第二步获得的磁珠悬液中；
第六步，将第二溶液加入第五步获得的磁珠悬液中；
第七步，将第六步获得的混合液置于37℃摇床中，摇晃孵育；
第八步，磁性分离，去除上清液；
第九步，加入乙醇进行吹打重悬，磁性分离，去除上清液，对分离产物重复洗涤，最后重悬磁珠在乙醇水溶液中；
第十步，在4℃的条件下保存。
该制备方法进一步具体为：
第一步，羧基磁珠悬液置于离心管中，放在磁力架上等待1-3min，进一步优选2min，进行磁性分离，用移液器吸走并丢弃上清液；
第二步，在分离产物中加入有机溶剂，有机溶剂优选DMF，每1ml第一步使用的羧基磁珠悬液使用1ml有机溶剂，使用移液器缓慢吹打8-12次，优选10次，以重悬磁珠，再次磁性分离1-3min，优选2min，去除上清液，重复洗涤3-5次分离产物，重悬磁珠在有机溶剂中，有机溶剂优选DMF，获得磁珠悬液；
第三步，配置(N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐)第一溶液，浓度为5-15mg/mL，进一步优选为10mg/mL；
第四步，配置叠氮基丙胺第二溶液，浓度为150mg/mL-250mg/mL，进一步优选200mg/mL；
第五步，将第三步获得的第一溶液加入第二步获得的磁珠悬液中，添加量为1ml磁珠悬液对应5ml第一溶液；
第六步，将第二溶液加入第五步获得的磁珠悬液中，添加量为1ml磁珠悬液对应10μl第二溶液；
第七步，将第六步获得的混合液置于37℃摇床中，摇晃孵育1-3小时，优选2小时；
第八步，磁性分离1-3min，优选2min，去除上清液；
第九步，加入乙醇浓度10％-30％，优选20％的乙醇溶液，进行吹打重悬，磁性分离1-3min，进一步优选2min，去除上清液，对分离产物重复洗涤4-6 次，最后重悬磁珠在醇浓度10％-30％，优选20％的乙醇水溶液中；
第十步，该磁珠悬液保存于4℃，避免冻结。
本发明还提供一种生物正交化学的大分子一步捕获方法，其采用功能化磁珠与生物大分子通过点击化学反应获得。
所述功能化磁珠可以为上述制备的叠氮化磁珠或炔基化磁珠。
所述生物大分子可以为嵌入了炔基或叠氮非天然氨基酸的蛋白质，以及嵌入了炔基或叠氮非天然核苷酸的核酸。
所述点击化学反应为叠氮炔环加成反应。
所述一步捕获方法具体包括：
第一步，配置硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液、(三(3-羟丙基三氮基甲基)胺)水溶液、十二烷基硫酸钠水溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液、尿素水溶液、乙腈水溶液；
第二步，取上面制备的炔基磁珠悬液或叠氮磁珠悬液，使用蛋白或核酸缓冲液置换，重悬于蛋白缓冲液中；
第三步，按顺序依次加入硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液、(三(3-羟丙基三氮基甲基)胺)水溶液、待捕获的蛋白样品、第二步制备的磁珠悬液和超纯水；
第四步，配置好反应混合液后，放在恒温混匀仪上，孵育；
第五步，磁性分离；
第六步，还原烷基化；
第七步，洗涤磁珠；
第八步，磁珠上的蛋白经胰蛋白酶消化，用于LC-MS分析。
本发明提供的上述捕获方法，进一步具体包括：
第一步，配置300-600mmol/L，进一步优选500mmol/L硫酸铜水溶液、 0.5mol/L-1.5mol/L，进一步优选1mol/L抗坏血酸钠水溶液、 50mmol/L-150mmol/L优选100mmol/L(三(3-羟丙基三氮基甲基)胺)水溶液、 0.5％-1.5％，进一步优选1％的十二烷基硫酸钠水溶液、30mmol/L-60mmol/L，进一步优选50mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液(pH值为8)、6mol/L-10mol/L，进一步优选8mol/L尿素溶液、20％-40％，进一步优选30％的乙腈水溶液；
第二步，取上面制备的炔基磁珠悬液或叠氮磁珠悬液，使用蛋白或核酸缓冲液置换3-5次，重悬于蛋白缓冲液中；
第三步，按顺序依次加入硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液、(三(3-羟丙基三氮基甲基)胺)水溶液、待捕获的蛋白样品、第二步制备的磁珠悬液和超纯水，体积比优选为0.1-0.3∶1∶0.3-0.5∶1-1.5∶15-25∶20-25，进一步优选0.2∶1∶0.5∶1.25∶20∶23.8；
第四步，配置好反应混合液后，放在恒温混匀仪上，温度设置为25℃，转速1200rpm-2000rpm，优选1600rpm，孵育0.5-1.5小时，优选1小时；
第五步，将反应混合液置于磁力架上进行磁性分离，1-3min，优选2min，去除上清液；
第六步，向样品中加入还原烷基化试剂，包括：500mM三(2-羧乙基)膦， 1M氯乙酰胺，10％SDS，50mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，在37℃孵育30min，随后磁性分离去除上清液；
第七步，依次采用十二烷基硫酸钠水溶液洗涤3-5次，尿素溶液洗涤3-5 次，乙腈洗涤3-5次，4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液洗涤3-5次磁珠；
第八步，磁珠上的蛋白经过胰蛋白酶消化，用于LC-MS分析。
所述第一步中，尿素溶液是采用50mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液 (pH值为8)作为缓冲液，溶解尿素获得的。
所述第二步中，蛋白缓冲液优选为RIPA蛋白缓冲液：25mM Tris·HCl pH＝7.6，150mM NaCl，1％NP-40，1％sodium deoxycholate，0.1％SDS。
核酸缓冲液优选为10mM Tris-HCl pH＝7.5，1mM EDTA，1M NaCl， 0.1％SDS。
炔基化磁珠的合成与蛋白质的捕获流程如下所示：
Figure BDA0003008600970000101
叠氮化磁珠的合成与蛋白质的捕获流程如下所示：
Figure BDA0003008600970000111
以下采用实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1炔基化磁珠
第一步，取1mL BeaverbeadsTM公司生产的羧基磁珠，型号70102-5 悬液于2.0mL离心管，放在磁力架上等待2min，磁性分离后去除上清液；第二步，加入1mL DMF(N，N-二甲基甲酰胺)，使用移液器缓慢反复吹吸10 次，使磁珠悬浮并均匀分散于溶剂中(重悬)，磁性分离2min后去除上清液，重复洗涤3次，最后使磁珠重悬在1mL DMF中；第三步，配制第一溶液：10mg/mL EDC(N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐)的DMF溶液；第四步，配制第二溶液：200mg/mL NPA(NH3-PEG4-Alkyne)的DMF溶液；第五步，向第二步的1mL磁珠悬液中加入5mL第一溶液；第六步，向第五步的6mL 混合液中加入10μL第二溶液；加入第二溶液后颠倒混匀，置于37℃摇床中，摇晃孵育2小时；反应时间结束后，磁性分离2min，去除上清液；加入1mL 20％乙醇水溶液进行吹打重悬，磁性分离2min后去除上清液，重复洗涤4次，最后重悬磁珠在1mL 20％乙醇水溶液中；该磁珠悬液保存于4℃。
实施例2叠氮化磁珠
采用与实施例1相同的制备方法，区别在于采用200mg/mL叠氮基丙胺的 DMF溶液替代200mg/mL NPA(NH3-PEG4-Alkyne)的DMF溶液。
实施例3叠氮修饰的蛋白质
培养细胞至覆盖率到达80％；去除细胞中旧的培养基，加入5mL PBS缓冲液(来自biological industries，货号02-023-1A)，轻轻摇晃，去除上清液，重复清洗2次；加入10mL无甲硫氨酸的培养基，放入37℃的细胞培养箱，培养30min；去除前面的细胞培养基，加入10mL无甲硫氨酸的培养基；向实验细胞中加入10μL的100mM L-叠氮基高丙氨酸的DMSO溶液(叠氮化甲硫氨酸，来自thermo scientific，货号C10102)对蛋白质进行叠氮化标记；轻摇均匀，放入37℃的细胞培养箱，培养6小时；对培养皿中的细胞用5mL PBS缓冲液洗涤一次；用细胞刮刀轻轻地把细胞刮下，收集于1.5 ml离心管中，通过200rcf离心5min去除上清液；向细胞沉淀加入200μL RIPA细胞裂解液(来自thermo scientific，货号89900)，重悬细胞，冰浴30min；将细胞悬液放在冰水浴中，使用超声破碎仪，破碎细胞；将样品，在4℃下，用20000rcf离心10min；转移上清液至新的离心管，此为提取的细胞蛋白溶液，含有叠氮修饰的蛋白；使用BCA蛋白检测试剂盒(来自thermo scientific，货号23227)测定总蛋白浓度；取1mg的蛋白溶液，进行下面的点击化学反应。
比较例1
采用文献3中的方法制备炔基化树脂悬液。
采用本发明实施例1制备的炔基化磁珠和比较例1提供的炔基化树脂进行生物正交化学的大分子一步捕获，如下表1所示。
表1蛋白捕获方法。
Figure BDA0003008600970000121
Figure BDA0003008600970000131
Figure BDA0003008600970000141
反应后的磁珠用流式细胞技术(FCM)对磁珠上的荧光进行定量分析，实验流程如图1。检测结果如图2，图2A和2B表示了炔基化磁珠(红)与结合了488nm荧光基团的炔基化磁珠(绿)在分别在荧光通道(FITC)响应情况，图2C表明超过99％的磁珠都结合了荧光。说明完成了捕获。
所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本发明新产品属于保留的权利。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (8)

1.一种功能化磁珠，其特征在于：所述功能化磁珠为炔基化磁珠，其采用NH3-PEG4-Alkyne与羧基磁珠偶联合成。
2.权利要求1所述功能化磁珠的制备方法，其特征在于，包括：
第一步，羧基磁珠悬液进行磁性分离，除去上清液；
第二步，在分离产物中加入有机溶剂，使用移液器缓慢吹打多次，以重悬磁珠，再次磁性分离，去除上清液，重复洗涤多次分离产物，重悬磁珠在有机溶剂中，获得磁珠悬液；
第三步，配置(N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐)第一溶液，用于活化羧基；
第四步，配置(NH3-PEG4-Alkyne)第二溶液；
第五步，将第三步获得的第一溶液加入第二步获得的磁珠悬液中；
第六步，将第二溶液加入第五步获得的磁珠悬液中；
第七步，将第六步获得的混合液置于37℃摇床中，摇晃孵育；
第八步，磁性分离，去除上清液；
第九步，加入乙醇进行吹打重悬，磁性分离，去除上清液，对分离产物重复洗涤，最后重悬磁珠在乙醇水溶液中；
第十步，在4℃的条件下保存。
3.一种功能化磁珠，其特征在于：所述功能化磁珠为叠氮化磁珠，其采用叠氮基丙胺与羧基磁珠偶联合成。
4.如权利要求3所述功能化磁珠的制备方法，其特征在于，包括：
第一步，羧基磁珠悬液进行磁性分离，除去上清液；
第二步，在分离产物中加入有机溶剂，使用移液器缓慢吹打多次，以重悬磁珠，再次磁性分离，去除上清液，重复洗涤多次分离产物，重悬磁珠在有机溶剂中，获得磁珠悬液；
第三步，配置(N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐)第一溶液，用于活化羧基；
第四步，配置叠氮基丙胺第二溶液；
第五步，将第三步获得的第一溶液加入第二步获得的磁珠悬液中；
第六步，将第二溶液加入第五步获得的磁珠悬液中；
第七步，将第六步获得的混合液置于37℃摇床中，摇晃孵育；
第八步，磁性分离，去除上清液；
第九步，加入乙醇进行吹打重悬，磁性分离，去除上清液，对分离产物重复洗涤，最后重悬磁珠在乙醇水溶液中；
第十步，在4℃的条件下保存。
5.一种生物正交化学的大分子一步捕获方法，其特征在于：采用功能化磁珠与生物大分子通过点击化学反应获得，所述功能化磁珠为权利要求1所述的炔基化磁珠或权利要求3所述的叠氮化磁珠。
6.如权利要求5所述的生物正交化学的大分子一步捕获方法，其特征在于：所述生物大分子可以为进行了炔基化或叠氮化的蛋白质或核酸。
7.如权利要求5或6所述的生物正交化学的大分子一步捕获方法，其特征在于：所述点击化学反应为叠氮炔环加成反应。
8.权利要求5-7任一项所述的生物正交化学的大分子一步捕获方法，其特征在于，包括：
第一步，配置硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液、(三(3-羟丙基三氮基甲基)胺)水溶液、十二烷基硫酸钠水溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸水溶液、尿素水溶液、乙腈水溶液；
第二步，取权利要求1或2制备的磁珠悬液，使用蛋白或核酸缓冲液置换，重悬于蛋白缓冲液中；
第三步，按顺序依次加入硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液、(三(3-羟丙基三氮基甲基)胺)水溶液、待捕获的蛋白样品、第二步制备的磁珠悬液和超纯水；
第四步，配置好反应混合液后，放在恒温混匀仪上，孵育；
第五步，磁性分离；
第六步，还原烷基化；
第七步，洗涤磁珠；
第八步，磁珠上的蛋白经胰蛋白酶消化，用于LC-MS分析。
CN202110376388.5A 2021-04-06 2021-04-06 采用功能化磁珠进行生物正交化学的大分子一步捕获方法及应用 Active CN113092784B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110376388.5A CN113092784B (zh) 2021-04-06 2021-04-06 采用功能化磁珠进行生物正交化学的大分子一步捕获方法及应用
PCT/CN2021/138134 WO2022213656A1 (zh) 2021-04-06 2021-12-15 功能化磁珠及采用其的生物正交化学的大分子一步捕获方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110376388.5A CN113092784B (zh) 2021-04-06 2021-04-06 采用功能化磁珠进行生物正交化学的大分子一步捕获方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113092784A true CN113092784A (zh) 2021-07-09
CN113092784B CN113092784B (zh) 2023-09-08

Family

ID=76675211

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110376388.5A Active CN113092784B (zh) 2021-04-06 2021-04-06 采用功能化磁珠进行生物正交化学的大分子一步捕获方法及应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN113092784B (zh)
WO (1) WO2022213656A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114034865A (zh) * 2021-11-09 2022-02-11 石家庄斯巴克生物科技有限公司 甲胎蛋白抗体包被磁珠的方法、偶联磁珠及试剂盒
WO2022213656A1 (zh) * 2021-04-06 2022-10-13 中国科学院深圳先进技术研究院 功能化磁珠及采用其的生物正交化学的大分子一步捕获方法

Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101042374A (zh) * 2006-03-20 2007-09-26 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种用于蛋白质末端肽段富集与测序的方法和试剂盒
CN101819838A (zh) * 2010-03-02 2010-09-01 中国科学院上海应用物理研究所 炔基修饰磁纳米粒子模块、氨基酸类化合物修饰的磁纳米粒子，及制备方法和用途
CN102412046A (zh) * 2011-08-17 2012-04-11 上海交通大学 富集叠氮标记生物大分子的磁性纳米材料及其制备与应用
CN102590413A (zh) * 2012-01-18 2012-07-18 浙江省疾病预防控制中心 一种牛α-乳白蛋白的定量检测方法
CN104987513A (zh) * 2015-06-09 2015-10-21 同济大学 一种糖响应的磁性杂化纳米粒子的制备方法
CN105741993A (zh) * 2016-02-03 2016-07-06 上海师范大学 叠氮多巴胺和羧基聚乙二醇修饰的Fe/Fe3O4纳米粒子及制备和应用
CN106399251A (zh) * 2016-07-08 2017-02-15 北京理工大学 一种偶联抗体的仿生免疫磁球及其制备方法
CN106468632A (zh) * 2015-08-16 2017-03-01 复旦大学 一种磁性纳米材料及其制备方法和用途
CN106692996A (zh) * 2017-04-01 2017-05-24 四川农业大学 核磁共振及光声显影的靶向性磁性纳米探针及制法和应用
US20170234862A1 (en) * 2014-08-01 2017-08-17 Vukic Soskic Methods for binding biologically active molecules to surfaces
CN108427000A (zh) * 2017-02-15 2018-08-21 广州市锐博生物科技有限公司 一种捕获核酸结合蛋白的方法和试剂盒
US20190062788A1 (en) * 2017-08-22 2019-02-28 Rubius Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle methods and compositions for producing engineered erythroid cells
CN110152571A (zh) * 2019-05-13 2019-08-23 中山大学 一种用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球及其制备方法和应用
CN110470688A (zh) * 2019-07-29 2019-11-19 华中农业大学 一种纳米螯合筛介导的低场核磁共振免疫传感器及其应用
CN111007252A (zh) * 2019-12-30 2020-04-14 武汉市农业科学院 一种基于纳米磁颗粒数量和状态变化的磁弛豫时间传感器检测农药残留的方法
CN111374960A (zh) * 2018-12-29 2020-07-07 上海原子科兴药业有限公司 一种egfr受体靶向肿瘤诊治放射性纳米颗粒及其制备方法
CN111777696A (zh) * 2020-06-22 2020-10-16 复旦大学 一种特异性可逆富集新生蛋白质的方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011066330A2 (en) * 2009-11-24 2011-06-03 Life Technologies Corporation Selective amplification of polynucleotide sequences
CN104313130B (zh) * 2014-09-23 2017-10-13 华南师范大学 一种高效富集微生物的功能化磁性纳米粒子及制备与应用
US20160237114A1 (en) * 2015-02-16 2016-08-18 Purdue Research Foundation Protein affinity purification resins with tagged protein
CN106039320A (zh) * 2016-05-25 2016-10-26 广州高通生物技术有限公司 一种抗非特异性的捕获磁珠及其制备方法和应用
CN110684075A (zh) * 2019-10-15 2020-01-14 天津锐尔康医药科技有限公司 磁珠沉淀法分离化合物效应蛋白及其方法
CN110726841B (zh) * 2019-10-21 2020-07-31 华中农业大学 一种基于酶促点击反应信号放大磁弛豫时间免疫传感器检测兽药残留的方法
CN113092784B (zh) * 2021-04-06 2023-09-08 中国科学院深圳先进技术研究院 采用功能化磁珠进行生物正交化学的大分子一步捕获方法及应用

Patent Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101042374A (zh) * 2006-03-20 2007-09-26 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种用于蛋白质末端肽段富集与测序的方法和试剂盒
CN101819838A (zh) * 2010-03-02 2010-09-01 中国科学院上海应用物理研究所 炔基修饰磁纳米粒子模块、氨基酸类化合物修饰的磁纳米粒子，及制备方法和用途
CN102412046A (zh) * 2011-08-17 2012-04-11 上海交通大学 富集叠氮标记生物大分子的磁性纳米材料及其制备与应用
CN102590413A (zh) * 2012-01-18 2012-07-18 浙江省疾病预防控制中心 一种牛α-乳白蛋白的定量检测方法
US20170234862A1 (en) * 2014-08-01 2017-08-17 Vukic Soskic Methods for binding biologically active molecules to surfaces
CN104987513A (zh) * 2015-06-09 2015-10-21 同济大学 一种糖响应的磁性杂化纳米粒子的制备方法
CN106468632A (zh) * 2015-08-16 2017-03-01 复旦大学 一种磁性纳米材料及其制备方法和用途
CN105741993A (zh) * 2016-02-03 2016-07-06 上海师范大学 叠氮多巴胺和羧基聚乙二醇修饰的Fe/Fe3O4纳米粒子及制备和应用
CN106399251A (zh) * 2016-07-08 2017-02-15 北京理工大学 一种偶联抗体的仿生免疫磁球及其制备方法
CN108427000A (zh) * 2017-02-15 2018-08-21 广州市锐博生物科技有限公司 一种捕获核酸结合蛋白的方法和试剂盒
CN106692996A (zh) * 2017-04-01 2017-05-24 四川农业大学 核磁共振及光声显影的靶向性磁性纳米探针及制法和应用
US20190062788A1 (en) * 2017-08-22 2019-02-28 Rubius Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle methods and compositions for producing engineered erythroid cells
CN111374960A (zh) * 2018-12-29 2020-07-07 上海原子科兴药业有限公司 一种egfr受体靶向肿瘤诊治放射性纳米颗粒及其制备方法
CN110152571A (zh) * 2019-05-13 2019-08-23 中山大学 一种用于分离纯化标记蛋白的环境敏感型磁性微球及其制备方法和应用
CN110470688A (zh) * 2019-07-29 2019-11-19 华中农业大学 一种纳米螯合筛介导的低场核磁共振免疫传感器及其应用
CN111007252A (zh) * 2019-12-30 2020-04-14 武汉市农业科学院 一种基于纳米磁颗粒数量和状态变化的磁弛豫时间传感器检测农药残留的方法
CN111777696A (zh) * 2020-06-22 2020-10-16 复旦大学 一种特异性可逆富集新生蛋白质的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JASON R.MCCARTHY 等: "Targeted delivery of multifunctional magnetic nanoarticles", 《NANOMEDICINE》, vol. 2, no. 2, 31 December 2007 (2007-12-31), pages 153 - 157 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022213656A1 (zh) * 2021-04-06 2022-10-13 中国科学院深圳先进技术研究院 功能化磁珠及采用其的生物正交化学的大分子一步捕获方法
CN114034865A (zh) * 2021-11-09 2022-02-11 石家庄斯巴克生物科技有限公司 甲胎蛋白抗体包被磁珠的方法、偶联磁珠及试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022213656A1 (zh) 2022-10-13
CN113092784B (zh) 2023-09-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210132078A1 (en) Quantitative massively parallel proteomics
CN113092784A (zh) 功能化磁珠及采用其的生物正交化学的大分子一步捕获方法
Weerapana et al. Tandem orthogonal proteolysis-activity-based protein profiling (TOP-ABPP)—a general method for mapping sites of probe modification in proteomes
Faoro et al. Ribonomic approaches to study the RNA-binding proteome
CN109023535B (zh) 一种用抗体针对无识别标记蛋白或细胞裂解物的dna编码化合物筛选方法
CN101148667B (zh) 一种亲和人白蛋白核酸适配子的制备与用途
US20060099626A1 (en) DNA-templated combinatorial library device and method for use
Reymond et al. A general assay for antibody catalysis using acridone as a fluorescent tag.
US9958437B2 (en) Method of quantifying peptide-derivative libraries using phage display
CN112280829A (zh) 一种试剂盒、样本标记方法、单细胞测序方法
AU2023202668A1 (en) Display of molecules on silently genetically encoded nanoscale carriers for determining synergistic molecular interactions
CN111521774A (zh) 基于糖代谢标记获得O-GlcNAc修饰转录因子结合染色质DNA序列的方法
WO2020264572A1 (en) Fragment-based screening to identify small molecules that selectively bind rna
CN111849964A (zh) 一种提取精液基因组dna的试剂盒及方法
CN112176043A (zh) 基于化学标记的修饰核苷的测序、富集和检测方法
CN109609611A (zh) 一种基于高通量测序技术的基因定量测序方法
CN114621297A (zh) 磁性光亲和标记探针分子及制备方法、天然二氢叶酸合成酶的制备方法和竞争酶联检测方法
EP4215618A1 (en) Method for analyzing cell epigenomics from multiple dimensions
CN114106109A (zh) 一种细胞质靶向的rna结合蛋白富集试剂及其制备方法及应用
Golkowski et al. Proteomic profiling of protein kinase inhibitor targets by mass spectrometry
CN104774923A (zh) 一种测定转录调控复合体的方法
CN111718930A (zh) 一种dna双链标记化合物及其确定化合物结合靶标蛋白的方法
Feng et al. Chemo-versus Immuno-Precipitation of G-Quadruplex-DNA (G4-DNA): A Direct Comparison of the Efficiency of the Antibody BG4 versus the Small-Molecule Ligands TASQs for G4 Affinity Capture
Prakash et al. Chromatin profiling in mouse embryonic germ cells by CUT&RUN
CN113278621B (zh) 一种ssDNA核酸适配体及其在识别、检测哈维氏弧菌中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant