CN104090050A - 一种基于磁性材料的膜蛋白共价固定方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物分析与检测技术领域，具体为一种基于磁性材料的膜蛋白共价固定方法。本发明利用一锅法合成包有长链聚乙二醇的磁球Fe₃O₄PEG，再在PEG的末端羟基上接上三氟乙磺酰基或者将其氧化为醛基。这些活性基团稀疏地分布在磁性材料的表面，与膜蛋白上不同位点的游离氨基发生高效反应，从而将膜蛋白牢固地键合到材料表面。因此，膜蛋白的增溶剂以及磷脂等干扰物便可通过洗涤以及磁性分离的方法被轻松除去，从而达到理想的鉴定效果。实验表明，利用该磁性材料固定膜蛋白具有反应效率高、非特异性吸附小等优点，并成功运用到膜蛋白组的鉴定上。本发明新颖便捷，实用高效，重复性好，稳定性高，具有巨大的推广应用潜力。

Description

一种基于磁性材料的膜蛋白共价固定方法

技术领域

本发明属于生物分析与检测技术领域，具体为一种膜蛋白共价固定方法。 

技术背景

膜蛋白是一类具有特殊结构的蛋白质，执行着细胞内外物质交换、细胞识别与免疫应答、信号传导和调控，以及能量传递等重要功能。人类基因组编码的蛋白质中有30%以上为膜蛋白，而且在已经发现的药物靶标中，大约有70%为膜蛋白。然而，到目前为止，被成功鉴定的膜蛋白数量还很有限。

膜蛋白组的研究面临的挑战主要是膜蛋白中低丰度蛋白以及疏水性蛋白的提取、酶解以及分离等方面。目前广泛利用基于shot-gun方法的电泳技术来解决膜蛋白分离与酶解的问题。但是，众所周知电泳技术存在通量小、样品损失大以及耗时耗力等弱点，这对于体系复杂的膜蛋白来说是远远不够的。因此，目前膜蛋白组学的研究真正需要的是一种操作简便，样品损失率低，酶解效果好的方法。

结合这一目标，本发明设计了一种利用新型磁性材料来共价固定膜蛋白，从而鉴定膜蛋白的方法。这种方法，不仅能够在不损失样品的前提下，有效去除增溶剂等干扰物，而且能够增强膜蛋白的酶解效率，对于人Hela细胞膜蛋白得到了令人满意的鉴定结果。

发明内容

本发明的目的在于提出一种操作简便，样品损失率低，酶解效果好的膜蛋白共价固定方法。

本发明提出的膜蛋白共价固定方法，是基于磁性材料的膜蛋白共价固定方法。本发明利用长链PEG末端羟基数目少的特点，通过一锅法合成新型磁核材料Fe₃O₄PEG，作为核心，在磁核表面稀疏地修饰上能够与蛋白游离氨基、羧基或巯基反应的活性基团。该新型磁性材料可以随机地与膜蛋白上不同位点的氨基、羧基或巯基反应，从而将膜蛋白牢固捕获在磁性材料表面。由于PEG具有很好的亲水性和迁移性，磁球表面的长链PEG犹如章鱼触须般能够与膜蛋白表面甚至内部的氨基接触，从而增加了末端活性基团与膜蛋白的反应机会。同样的，在酶解过程中，PEG的亲水性可以增加其末端键合上的膜蛋白与蛋白水解酶的碰撞几率。

本发明提出的基于磁性材料的膜蛋白共价固定方法，具体步骤如下：

（1）磁性材料的合成： 把二茂铁和PEG-20000按照1:6-1:5的质量比均匀溶解在丙酮中；逐滴加入30%过氧化氢（2%-4%（v/v）），然后转移到不锈钢反应釜中200-230°C 反应24-48 h，得到Fe₃O₄PEG；分别用丙酮和乙醇洗涤以去除多余的原料和未包裹的Fe₃O₄；

（2）将合成好的 Fe₃O₄PEG分散在二氯甲烷与吡啶中，逐滴加入三氟乙磺酰氯（100-200 μL/50 mg 模板材料），在室温下氮气氛围中不断搅拌18-24 h，制得Fe₃O₄PEG-Tresyl材料；或者将Fe₃O₄PEG分散在醋酐与二甲基亚枫的混合液中，在室温下氩气氛围中30-36 h，制得Fe₃O₄PEG-Formyl 材料；

（3）磁性材料共价固定膜蛋白并除去表面活性剂：使用4%（w/v） SDS溶液（pH 7.0-9.0）提取膜蛋白；将膜蛋白通过共价键合反应固定在步骤（1）制得的Fe₃O₄PEG-Tresyl 或者Fe₃O₄PEG-Formyl 材料表面上；然后通过水洗以或磁性分离的方法，去除高浓度的SDS以及其他干扰物。 

本发明提出的基于磁性材料的膜蛋白共价固定方法，可用于人Hela细胞膜蛋白鉴定，具体地是使用4% SDS提取Hela细胞膜组分中的膜蛋白；随即在膜蛋白溶液中加入“类似章鱼触须”磁性材料以及反应所需缓冲溶液，反应2小时后，95%以上的膜蛋白被固定在材料表面，并且每个膜蛋白上都有尽可能少的氨基参与反应。通过水洗以及磁性分离后，高浓度的SDS、缓冲盐以及磷脂等干扰物则可被彻底清除。未反应的三氟乙磺酰基团则通过加入含有氨基的物质进行封闭，避免其捕获酶解产生的肽段。

使用Lys-C与Trypsin先后在10% 的乙腈溶液中对被“章鱼触须”磁性材料捕获的膜蛋白进行酶解。由于膜蛋白的疏水部分在乙腈溶液中更容易舒展开，暴露出更多的酶切位点，因此可以达到更好的酶解效果。然而乙腈浓度太高则会影响蛋白水解酶的酶解活性，因此选择10% 浓度的乙腈可以平衡上述两个因素。

如图2所示，通过本发明方法（即SDS-PAGE方法），比较反应前后膜蛋白量的变化，以及与标准蛋白BSA的条带进行比较，可以证明本发明中所设计的“类似章鱼触须”磁性材料共价固定膜蛋白的反应效率达到95%以上。不仅如此，该反应柱对膜蛋白的负载量也很大，通过固定膜蛋白的量而改变材料的用量，可以得出负载量约为15 μg/mg。另外，如图3所示，在高浓度SDS去除前的上清溶液中标准肽段pK-10的质谱峰很弱，背景信号也很复杂，而经过三次水洗后，其上清溶液中可以看到明显的质谱峰，并且背景信号非常干净，由此可以证明通过水洗以及磁性分离的方法能够有效地去除高浓度SDS。利用该方法对人Hela细胞中提取的膜蛋白进行固定，通过一维分离鉴定出822种膜蛋白，其中350种膜蛋白含有跨膜结构。实验结果充分证明，本发明制得的膜蛋白在线鉴定系统达到了实际应用的要求，因而具有广阔的应用前景。

附图说明

图1 “类似章鱼触须”磁性材料的合成流程图。

图2 “类似章鱼触须”磁性材料固定膜蛋白反应效率的SDS-PAGE胶照片。

图3  标准肽段pK-10在高浓度SDS去除前（A）与三次水洗后（B）上清溶液中的质谱图。

具体实施方式

实施例1：表面修饰三氟乙磺酰基的“类似章鱼触须”磁性材料合成

二茂铁和PEG-20000均匀溶解在丙酮中。逐滴加入过氧化氢后,转移到不锈钢反应釜中230°C 反应36 h。得到的Fe₃O₄PEG模板分别用丙酮和乙醇洗涤以去除多余的原料和未包裹的Fe₃O₄。将合成好的 Fe₃O₄PEG分散在二氯甲烷与吡啶中，逐滴加入三氟乙磺酰氯，在室温下氮气氛围中不断搅拌18 h。最后，用酸化乙醇洗涤材料并在真空干燥箱中干燥备用。

实施例2：表面修饰三氟乙磺酰基的“类似章鱼触须”磁性材料在人Hela细胞膜蛋白鉴定实验中的应用

按照密度梯度离心的方法提取Hela细胞膜组分，并用4% SDS溶液（pH 8.0）提取膜组分中的膜蛋白。使用BCA的蛋白定量方法对膜蛋白溶液进行定量。用反应缓冲液（1 M PBS与 4 % SDS的混合溶液，pH 9.0）将膜蛋白稀释至0.5 μg/μL，加入8 mg 合成好的材料，在37 ℃酶解仪中反应2 h。通过水洗以及磁性分离的方法将高浓度的SDS以及其他干扰物完全去除。 再加入 Tris-HCl 和 NaCl 的混合溶液（pH 8.0）来封闭未反应的三氟乙磺酸基团。经过水洗后，先后加入10 mM二硫苏糖醇（DTT）以及25 mM 吲哚-3-乙酸（IAA）进行固定蛋白的还原烷基化。最后将固定有膜蛋白的“类似章鱼触须”磁性材料分散在含有10% 乙腈的25 mM 碳酸氢胺溶液中，先后加入Lys-C和Trypsin两种蛋白水解酶在37 ℃酶解仪中过夜酶解。

实施例3：表面修饰醛基的“类似章鱼触须”磁性材料合成

将合成好的 Fe₃O₄PEG分散在醋酐与二甲基亚枫的混合液中，在室温下氩气氛围中30h。最后，在冷冻的无水乙醚中沉析2 次，取出抽滤，真空干燥，并保存在1%的戊二醛中。

实施例4：表面修饰醛基的“类似章鱼触须”磁性材料在人Hela细胞膜蛋白鉴定实验中的应用

用反应缓冲液（0.1 M PBS与 4 % SDS的混合溶液，pH 8.0）将膜蛋白稀释至0.5 μg/μL，加入10 mg 合成好的材料以及氰基硼氢化钠，过夜反应。通过水洗以及磁性分离的方法将高浓度的SDS以及其他干扰物完全去除。 再加入 Tris-HCl 与氰基硼氢化钠的混合溶液（pH 8.0）来封闭未反应的醛基。经过水洗后，先后加入DTT）以及IAA进行固定蛋白的还原烷基化。最后将固定有膜蛋白的“类似章鱼触须”磁性材料分散在含有10% 乙腈的25 mM 碳酸氢胺溶液中，先后加入Lys-C和Trypsin两种蛋白水解酶在37 ℃酶解仪中过夜酶解。

Claims (2)

1. 一种基于磁性材料的膜蛋白共价固定方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）磁性材料的合成： 把二茂铁和PEG-20000按照1:6-1:5的质量比均匀溶解在丙酮中；逐滴加入30%的体积浓度为2%-4%（v/v）的过氧化氢，然后转移到不锈钢反应釜中200-230°C 反应24-48 h，得到Fe₃O₄PEG；分别用丙酮和乙醇洗涤以去除多余的原料和未包裹的Fe₃O₄；

（2）将合成好的 Fe₃O₄PEG分散在二氯甲烷与吡啶中，逐滴加入100-200 μL/50 mg 模板材料三氟乙磺酰氯，在室温下氮气氛围中不断搅拌18-24 h，制得Fe₃O₄PEG-Tresyl材料；或者将Fe₃O₄PEG分散在醋酐与二甲基亚枫的混合液中，在室温下氩气氛围中30-36 h，制得Fe₃O₄PEG-Formyl 材料；

（3）磁性材料共价固定膜蛋白并除去表面活性剂：使用pH为 7.0-9.0的4%（w/v） SDS溶液提取膜蛋白；将膜蛋白通过共价键合反应固定在步骤（1）制得的Fe₃O₄PEG-Tresyl 或者Fe₃O₄PEG-Formyl 材料表面上；然后通过水洗以或磁性分离的方法，去除高浓度的SDS以及其他干扰物。

2. 如权利要求1所述方法在各种细胞或组织膜蛋白鉴定中的应用。