CN106814124A - 一种糖蛋白固相富集耦合质谱检测的系统及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种糖蛋白固相富集耦合质谱检测的系统及方法，包括酰肼修饰的多孔酶反应器及质谱仪；所述酰肼修饰的多孔酶反应器采用酰肼处理的多孔氧化硅材料为吸附剂，对糖蛋白进行选择性富集和快速原位酶解，酶解产物由所述质谱仪进行质谱分析。本发明通过利用多孔氧化硅材料的孔道限定作用以及酰肼修饰表面与糖蛋白的化学亲合作用，实现糖蛋白的选择性富集和原位快速酶解，进一步完成质谱直接分析。该发明步骤简单、操作方便、快速高效，可以实现对糖蛋白的高灵敏、高准确、高通量的质谱分析。
Description
技术领域
本发明属于生化分析技术领域，涉及固相富集糖蛋白的方法及糖蛋白的质谱检测分析。
背景技术
研究公开了糖基化是生物体内组普遍存在的一种翻译后修饰，并执行着重要的生物学功能。糖基化修饰在各种生命现象中起着重要的作用，如，参与细胞粘附及信号传导，影响蛋白质的分泌和稳定性，免疫及炎症反应以及影响蛋白质在细胞内的转送方向等。研究报道，约有生物体内1/2以上的蛋白质会发生糖基化。更重要的是，有些糖蛋白通常被认为是重要的生物标志物，因此它们的检测往往和相关病理或生理过程有着非常紧密的联系。例如，乳腺癌中的Her2/neu、前列腺癌中的前列腺特异性抗原、卵巢癌中的CA125等都是糖蛋白，而且都被认为是诊断标志物及治疗的标靶。然而，糖蛋白的研究还面临以下两方面困难。首先，含有糖基化修饰的蛋白质种类虽然很多，但其丰度却通常较低，而且其酶解成肽段后占全部肽段的比例更低，通常只有1-3％左右的肽段带有糖基化修饰；第二，带有糖基化修饰的肽段在质谱中的离子化效率往往比非修饰肽段低，因而不易被质谱鉴定；第三，尽管已经有较多的方法实现了糖蛋白的富集，但用传统的方法，如抗原抗体免疫反应和蛋白质印记法，只能单独研究很少量的蛋白，而且比较耗时。因此，一种高通量、高灵敏、高选择的糖蛋白检测系统和方法亟待开发。
发明内容
本发明目的在于提供一种步骤简单、操作方便、快速高效、能实现固相富集糖蛋白并联用质谱检测的系统及检测方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种糖蛋白固相富集耦合质谱检测的系统，包括酰肼修饰的多孔酶反应器及质谱仪；所述酰肼修饰的多孔酶反应器采用酰肼基团修饰的多孔氧化硅材料为吸附剂，对糖蛋白进行选择性富集和快速原位酶解，酶解产物由所述质谱仪进行质谱分析。
进一步地，所述多孔氧化硅材料采用酰肼修饰。氧化硅为SiO2。
进一步地，经酰肼基团修饰的所述多孔氧化硅材料的孔径小于等于10μm，优选为100nm左右。
进一步地，经酰肼基团修饰的所述多孔氧化硅材料的水滴接触角大于等于20度。
进一步地，所述质谱仪包括电喷雾型质谱仪或激光解析电离型质谱仪。
一种糖蛋白固相富集耦合质谱检测的方法，包括以下步骤：
步骤1：合成酰肼基团修饰的多孔氧化硅材料；
步骤2：在生物样品中，加入步骤1中经酰肼基团修饰的多孔氧化硅材料；
步骤3：收集下层固体相，即所述经酰肼基团修饰的多孔氧化硅材料；
步骤4：清洗步骤3中收集到的所述下层固体相，加入蛋白酶进行酶解；
步骤5：进行质谱分析。
进一步地，所述步骤1中采用后嫁接法合成酰肼修饰的多孔氧化硅材料。
进一步地，所述步骤2中所述生物样品的浓度为0.001mg/mL～100mg/mL，体积小于100mL。
进一步地，所述步骤4中酶解溶液的pH值范围为4～11，温度范围为20～50℃。
进一步地，所述步骤4中的蛋白酶为胰蛋白酶。
本发明利用酰肼修饰的材料表面与糖蛋白的化学结合作用以及多孔氧化硅材料的孔容限定作用，实现糖蛋白在众多蛋白中的选择性富集，对富集有糖蛋白的氧化硅纳米材料进行原位酶解，分别收集富集有糖基化肽的氧化硅纳米材料和上清溶液，对富集有糖基化肽的氧化硅纳米材料进行洗脱，洗脱液和上清溶液混合后进行质谱检测，根据谱图数据分析，可实现对糖蛋白有效精确的分析。本发明选用的功能化的多孔氧化硅材料具有巨大的比表面积和孔容体积，蛋白的选择性富集和快速原位酶解，可以有效检测低丰度糖蛋白，同时免去传统酶解耗时长等缺点。利用多孔材料的预处理富集有利于低丰度糖蛋白的检测，而质谱技术又提供高通量分析糖蛋白的方法。这种酰肼修饰的多孔氧化硅材料固相富集糖蛋白与质谱联用系统可以实现对糖蛋白快速、高效、灵敏、选择性的检测。
以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。
附图说明
图1是本发明糖蛋白固相富集耦合质谱检测的流程图；
图2是本发明较优实施例中得到的材料的扫描电子显微镜图片和透射电子显微镜图片，图2a是透射电子显微镜图片(TEM)，图2b是扫描电子显微镜图片(SEM)。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明进行进一步描述。
酰肼修饰的多孔氧化硅纳米材料可按下述步骤以有机硅为修饰剂通过后嫁接法合成：
将1.2～1.5克聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物和1.5～1.8克无水硫酸钠溶解在30～40克pH为5～6的醋酸-醋酸钠缓冲液中，在室温下机械搅拌24～36小时，再加入1.3～1.8克四甲氧基硅烷并搅拌24～36小时，然后置于不锈钢高压反应釜中，将反应釜置于100～130摄氏度的烘箱中24～36小时，取出，用去离子水洗涤除去未反应的反应物，最后将产物真空干燥并保存，取0.1～0.3克产物，加入0.2～0.3克(3-环氧丙氧基丙基)甲基二乙氧基硅烷，最后加入1.0～4.0克肼-水合物反应24小时，收集备用。
配制1mg/mL的酰肼修饰的的多孔氧化硅材料，超声震荡10分钟，在铜网和铝箔上制样，电子显微镜图像采用JEOL2011显微镜。扫描电子显微镜图像采用JEOL飞利浦XL30显微镜。其扫描电子显微镜图片和透射电子显微镜图片如图2所示。
在较优的实施例中，多孔氧化硅纳米材料的孔径为70～120nm，选用酰肼修饰的多孔氧化硅材料，与样品溶液在35～40摄氏度下混合20～30分钟，以使样品中的糖蛋白充分吸附；样品溶液浓度为0.1mg/mL～1mg/mL,体积为～1mL；所述的样品溶液溶于0.2％氯化铵的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液中。
本发明中，对于步骤3中得到的下层固体相，用25mM,pH～8.0的碳酸氢铵缓冲液清洗材料1～3次，去除材料上非特异性吸附的蛋白质，再把材料重新溶于100mM,pH～8.0的缓冲液中，然后加10mg/mL胰蛋白酶溶液在纳米材料孔中原位快速酶解。收集在上清中的酶解产物，进行质谱分析。
实施例1：酰肼修饰的大孔氧化硅纳米材料对细胞裂解液富集能力的试验。
配制细胞裂解液溶液(溶于乙腈水溶液中)，将材料在该溶液中孵育15～30分钟，在离心作用下将材料从溶液中分离出来。弃除上清液，加入胰蛋白酶快速原位酶解。冷冻旋干酶解产物后，加入三氟乙酸的乙腈水溶液，进入电喷雾型质谱进行分析，可一次性分析检测数百种蛋白，并且富集效率很高，具体鉴定的部分糖蛋白见表1。
表1.细胞裂解液中糖蛋白的富集实验后检测到的部分糖蛋白。
实施例2：酰肼修饰的多孔氧化硅纳米材料对血清溶液中糖蛋白富集能力的试验。
配制血清溶液(溶于乙腈水溶液中)，将材料在该溶液中孵育15～30分钟，在离心作用下将材料从溶液中分离出来。弃除上清液，加入胰蛋白酶快速原位酶解。冷冻旋干酶解产物后，加入三氟乙酸的乙腈水溶液，进入电喷雾型质谱进行分析，可一次性分析检测数百种蛋白，并且富集效率很高，具体鉴定的部分糖蛋白见表2。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种糖蛋白固相富集耦合质谱检测的系统，其特征在于，包括酰肼修饰的多孔酶反应器及质谱仪；所述酰肼修饰的多孔酶反应器采用酰肼基团修饰的多孔氧化硅材料为吸附剂，对糖蛋白进行选择性富集和快速原位酶解，酶解产物由所述质谱仪进行质谱分析。
2.根据权利要求1所述的一种糖蛋白固相富集耦合质谱检测的系统，其特征在于，所述多孔氧化硅材料采用酰肼基团修饰。
3.根据权利要求1或2所述的一种糖蛋白固相富集耦合质谱检测的系统，其特征在于，经酰肼基团修饰的所述多孔氧化硅材料的孔径小于等于10μm。
4.根据权利要求1或2所述的一种糖蛋白固相富集耦合质谱检测的系统，其特征在于，经酰肼基团修饰的所述多孔氧化硅材料的水滴接触角大于等于20度。
5.根据权利要求1所述的一种糖蛋白固相富集耦合质谱检测的系统，其特征在于，所述质谱仪包括电喷雾型质谱仪或激光解析电离型质谱仪。
6.一种糖蛋白固相富集耦合质谱检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：合成酰肼基团修饰的多孔氧化硅材料；
步骤2：在生物样品中，加入所述步骤1中经酰肼基团修饰的多孔氧化硅材料；
步骤3：收集下层固体相，即所述经酰肼基团修饰的多孔氧化硅材料；
步骤4：清洗所述步骤3中收集到的所述下层固体相，加入蛋白酶进行酶解；
步骤5：进行质谱分析。
7.根据权利要求6所述的一种糖蛋白固相富集耦合质谱检测的方法，其特征在于，所述步骤1中采用后嫁接法合成酰肼修饰的所述多孔氧化硅材料。
8.根据权利要求6所述的一种糖蛋白固相富集耦合质谱检测的方法，其特征在于，所述步骤2中所述生物样品的浓度为0.001mg/mL～100mg/mL，体积小于100mL。
9.根据权利要求6所述的一种糖蛋白固相富集耦合质谱检测的方法，其特征在于，所述步骤4中酶解溶液的pH值范围为4～11，温度范围为20～50℃。
10.根据权利要求6所述的一种糖蛋白固相富集耦合质谱检测的方法，其特征在于，所述步骤4中的蛋白酶为胰蛋白酶。
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