CN114280132B - MOFs用于地龙多肽富集的用途及地龙多肽的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于多肽物质检测技术领域，具体涉及一种检测地龙多肽的试剂盒、MOFs用于地龙多肽富集的用途及地龙多肽的检测方法。本发明中检测的两种地龙多肽为F‑1和/或AQ‑5，所述试剂盒中包括MOFs材料NU‑1000。本发明对两种地龙多肽F‑1和AQ‑5检测方法的检测具有很好的精密度和特异性，且经过NU‑1000的萃取后两种地龙多肽的稳定性提高，这有利于对两种地龙多肽的准确检测，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于多肽物质检测技术领域，具体涉及一种MOFs用于地龙多肽富集的用途及地龙多肽的检测方法。
背景技术
肽是α－氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，是蛋白质水解的中间产物。由三个或三个以上氨基酸分子组成的肽叫多肽。多肽类物质广泛地存在于生物体中，其在医药、化妆品等领域具有重要的应用。例如在中药材地龙中，其主要有效成分包括F-1(Ac-AMVSS)和AQ-5(AMADQ)在内的多种多肽。因而，为了对药物或化妆品等进行质量检测，这些领域中通常都有检测样品中多肽类物质含量的需求。
毛细管电泳是通过电泳的原理分离和检测目标物质的方法，其在药物制剂分析、中药分析等领域中具有重要的应用，也是多肽检测常用的方法之一。然而，毛细管电泳具有灵敏度不足的缺陷，且对于复杂样品其容易受到干扰。因此，毛细管电泳常与前处理技术联用，以提高其检测的灵敏度，消除复杂样品中杂质的干扰。这些前处理技术包括氮吹、萃取、蛋白沉淀浓缩、基质固相分散萃取等方法。
今年来，人们发现新型吸附材料(如金属有机骨架材料等)有良好的选择吸附性，能实现快速大量富集且操作简单，在针对复杂样品的前处理方面有巨大的应用潜力。金属有机骨架材料Metal-Organic Frameworks)，简称MOFs，是由有机配体和金属离子或团簇通过配位键自组装形成的具有分子内孔隙的有机-无机杂化材料。金属有机骨架材料早期主要用于气体吸附，近十年随着在水相中稳定的MOFs材料的合成，MOFs材料在溶液中的应用研究才慢慢发展起来。
在应用MOFs富集多肽类化合物方面，中国发明专利申请“CN201910161974.0一种氨基酸官能化Zn-MOFs功能材料及其制备方法与应用”公开了一种氨基酸官能化的Zn-MOFs，其能够吸附并富集ACE抑制多肽。MOFs对多肽的吸附作用的强弱和特异性通常与MOFs材料的结构与多肽的种类有关联，然而，目前本领域对于这种关联的原理还缺乏统一的认识。已发现的能够用MOFs材料富集的多肽种类，以及能够用于富集多肽的MOFs材料都还很少。因此，有必要提供更多的能够用于多肽富集的MOFs材料。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供一种检测地龙多肽的试剂盒、MOFs用于地龙多肽富集的用途及地龙多肽的检测方法，目的在于利用MOFs材料NU-1000实现对多肽F-1和/或多肽AQ-5的富集，进而利用毛细管电泳法对这
一种用于地龙多肽检测的试剂盒，所述多肽为F-1和/或AQ-5，所述试剂盒中包括MOFs材料NU-1000。
优选的，所述MOFs材料NU-1000由1,3,6,8-四苯甲酸-芘和Zr6(μ3-OH)8(OH)8配位得到的三维多孔金属有机骨架材料。
优选的，所述试剂盒中还包括碱，所述试剂盒中MOFs材料NU-1000与碱的比例为1-3mg:0.002-0.008mmol。
本发明还提供MOFs材料NU-1000用于富集地龙中多肽F-1和/或多肽AQ-5的用途。
本发明还提供一种多肽的检测方法，它是采用MOFs材料NU-1000对样品中的多肽进行富集后进行检测的方法，所述多肽为F-1和/或AQ-5。
优选的，所述检测的方法为毛细管电泳法。
优选的，所述样品为地龙。
优选的，包括如下步骤：
(1)将样品制备成供试品溶液；
(2)向供试品溶液中加入MOFs材料NU-1000对所述多肽进行富集；
(3)分离所述MOFs材料NU-1000，加入解吸剂溶液解吸，得到解吸溶液；
(4)检测所述解吸溶液中所述多肽的含量。
优选的，步骤(1)中，所述供试品溶液的溶剂为水，所述供试品溶液的pH为4；
和/或，步骤(2)中，所述富集的过程为超声处理至少10min。
优选的，步骤(3)中，所述解吸剂溶液为pH＝11.56的碱溶液。
本发明中，所述“F-1”为地龙药材中的活性成分Ac-AMVSS，所述“AQ-5”为地龙药材中的活性成分AMADQ。
所述“NU-1000”为由1,3,6,8-四苯甲酸-芘和Zr6(μ3-OH)8(OH)8配位得到的三维多孔金属有机骨架材料，其金属节点和八个羧基配位，留出的Zr配位点被-OH占据，其中一半的-OH伸向介孔六面体通道中。其比表面积和孔体积分别高达2320m2/g和1.40cm3/g，同时具有三角形(1.2mm)和六边形(3.0nm)孔。NU-1000热稳定性高达500℃。NU-1000的制备方法可参考Inorganic Chemistry,2017,56(22):14178-14188。
本发明采用MOFs材料NU-1000，对两种多肽F-1和AQ-5实现了特异性吸附，因而能够对这两种多肽进行富集，进一步地联用毛细管电泳法可对这两种多肽进行检测。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为实施例1制备的NU-1000N2吸附等温线(77K)及孔径分布；
图2为实施例1制备的NU-1000与模拟样品的PXRD曲线对比；
图3为实施例1测试的多肽地龙蛋白样品的CZE电泳图；
图4为：(a)实验例1中加入NU-1000前六种多肽CZE电泳图(样品浓度80μg·mL-1)；(b)实验例1中加入NU-1000后，上清液中六种多肽CZE电泳图；
图5为实验例1中加入NU-1000吸附六种多肽，然后用NaOH解吸后得到的样品溶液的CZE电泳图；
图6为实验例2中超声时间对吸附率η的影响的实验结果；
图7为实验例2中不同pH下NU-1000对两种多肽的吸附率的实验结果；
图8为实验例3中不同浓度的NaOH溶液对回收率η1的影响；
图9为实验例6中两种多肽溶液室温放置浓度变化；
图10为实验例6中两种多肽经NU-1000萃取后室温放置浓度变化。
具体实施方式
以下实施例和实验例中所用的试剂和材料均采用市售品。
所用试剂和材料包括：
六种多肽Annectocin(CFVRNCPYG-NH2)、PTP(GFRDGSADRISHGF-amide)、VQ-5(VSSVQ)、OEP3121(ACSAG)、F-1(Ac-AMVSS)和AQ-5(AMADQ)对照品均购自上海吉尔生化有限公司(纯度98％)；乙酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，乙酸铵(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，甘氨酸(分析纯，上海麦克林生化科技有限公司)，三(羟甲基)氨基甲烷(分析纯，上海麦克林生化科技有限公司)，氢氧化钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，盐酸(分析纯，西陇科学股份有限公司)。
实施例1多肽F-1和多肽AQ-5的检测
针对多肽地龙蛋白样品，检测其中的多肽F-1和多肽AQ-5，具体步骤如下：
1、NU-1000合成：按照文献(Inorganic Chemistry,2017,56(22):14178-14188)的方法合成。具体步骤为：将70.00mg ZrCl4(0.30mmol)，2.7g(22mmol)苯甲酸，8mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)混合，超声溶解。将澄清溶液在80℃的烘箱中温育1h，向该溶液中加入40.00mg(0.06mmol)1,3,6,8-四(对苯甲酸)芘，并将混合物超声处理20min。将黄色悬浮液在120℃的烘箱中加热72h。通过过滤分离黄色物质，然后在甲醇中利用索氏提取器提取过夜，并在80℃下真空干燥过夜，得到合成后的样品(表示为NU-1000B)。将NU-1000B(400mg)浸泡在120mL DMF中，然后加入3.3mL浓HCl，将样品放在烘箱中于100℃下加热24h。待温度降至室温后，将样品混合物进行过滤，并利用索氏提取器在甲醇中萃取固体过夜。然后将固体在80℃下真空干燥，得到活性NU-1000样品(为方便起见，表示为NU-1000)。
2、NU-1000表征：粉末X射线衍射(PXRD)在Rigaku MiniFlex2衍射仪上进行使用的为CuKα射线。N2吸附等温线是使用Micrometrics ASAP 2460表面积和孔径分析仪测定的。结果如图1和图2所示。
3、将多肽地龙蛋白(购自广州市好孝心医疗器械有限公司)压片研磨成粉末状，称取1g粉末并加入5ml水摇床提取，摇床时间30min*200rpm，然后放入冰箱静置。取上层水提液于离心管，离心10min*10000rpm，取上清液为多肽地龙蛋白压片水提液。
4、在1ml水提取液中加入2mg NU-1000，超声10min，离心10000rpm*10min，弃去上清液。加入1ml水，离心10000rpm*10min，尽量弃去上清液，洗涤两次。抽滤，连同滤纸一起置于离心管，加入0.5mL，0.01mol·L-1NaOH溶液，超声10min，得到的溶液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，得到解吸溶液；
5、采用毛细管区带电泳法分离测定F-1、AQ-5两种地龙多肽。用标准加入法对多肽进行定性。按样品处理方法对样品多肽地龙蛋白压片进行处理，用标准加入法定性检测出多肽地龙蛋白压片中含目标多肽AQ-5。
实验条件：60mmol·L-1乙酸铵-50mmol·L-1氢氧化钠(pH＝8)，运行电压是20kV，检测波长是215nm，压力进样3.45kPa×10s，操作温度为25℃。
CZE电泳图如图3所示，其中，a.多肽地龙蛋白压片水提液经NU-1000吸附后再用NaOH解吸的溶液；b.在多肽地龙蛋白压片水提液样品的基础上加入多肽F-1和AQ-5混合对照品溶液后按照a的方法得到的解吸溶液。按AQ-5的标准曲线方程计算，1ml的多肽地龙蛋白压片水提液含有7μg·mL-1的AQ-5，按含量计算方法进行含量计算，片剂多肽地龙蛋白压片中多肽AQ-5含量为0.0018％。
以下通过实验例进一步说明本发明的有益效果，未进一步说明的检测条件均采用实施例1中公开的条件进行。
实验例1吸附选择性
本实验例评价NU-1000对地龙中主要所含有的六种多肽的吸附的选择性，所述六种多肽为：Annectocin(CFVRNCPYG-NH2)、PTP(GFRDGSADRISHGF-amide)、VQ-5(VSSVQ)、OEP3121(ACSAG)、F-1(Ac-AMVSS)和AQ-5(AMADQ)。
取3mg NU-1000于10mL小烧杯，加入3mL六种多肽浓度均为80μg·mL-1(即各分析物的质量为240μg)的溶液，摇床速度200rpm，30min，转移至5mL离心管中，离心15min(9000rpm)，得沉淀与上清液，取上清液进行高效毛细管电泳测试得图4b。再按照实施例1的方法制备得到解吸液，进行高效毛细管电泳测试得图5。采用高效毛细管电泳测试六种多肽浓度均为80μg·mL-1的溶液得图4a。高效毛细管电泳条件：压力进样3.45kPa×10s；检测波长215nm；分离电压20kV。
对比加入NU-1000吸附前后的图谱，多肽的迁移时间变化明显，表明多肽的电泳迁移速度发生变化。实验以标准加入法对谱峰进行定性。可知，各峰对应的多肽如下：1:Annectocin；2:PTP；3:VQ-5；4:OEP3121；5:F-1；6:AQ-5。
对比图4a和4b，发现NU-1000吸附后，溶液的峰5与峰6的峰面积明显有大幅度的减少，说明NU-1000对F-1及AQ-5有较强的吸附；峰1，3和4的峰面积几乎不变，说明NU-1000对这些峰对应的多肽几乎没有吸附；其中峰2由于受系统峰影响，无法评估吸附情况。
对比图5和图4b，发现解吸液中检测到峰5和峰6，而其他峰则不明显，表明NU-1000主要从6种多肽的混合溶液中吸附了F-1和AQ-5，并且能够在后续的解吸附步骤中释放出来。
结果表明，本发明提供的NU-1000对F-1及AQ-5具有特异性吸附，且能够在解吸附过程中将二者释放出来，从而实现了F-1及AQ-5的特异性检测。
实验例2吸附条件筛选
一、超声时间
向7份4mL含有75μg·mL-1多肽F-1和75μg·mL-1多肽AQ-5的混合溶液中加入2mg的NU-1000，分别超声0.33、0.67、1、3、5、10、15min，然后离心15min(9000rpm)，取上清液测定浓度，计算吸附率η。结果如表1及图6所示，吸附率η在一分钟之内快速上升，一分钟之后吸附率趋于稳定，尤其是到了十分钟之后，吸附率η几乎没有变化。因此为保证吸附率达到最大，选择超声时间为10min。
表1不同超声时间下NU-1000对两种多肽的吸附率
二、背景溶剂
使用60mmol·L-1CH3COONH4-0.1mol·L-1HCl调节多肽标准溶液的pH，分别向不同pH的4mL含有75μg·mL-1多肽F-1和75μg·mL-1多肽AQ-5的多肽标准溶液中加入2mg的NU-1000，超声10min，离心15min(9000rpm)，取上清液测定浓度，计算吸附率η。由表2及图7可得，当pH值为4时，NU-1000对两种多肽的吸附率最高。
表2不同pH下NU-1000对两种多肽的吸附率
实验例3解吸条件筛选
取两种多肽F-1，AQ-5的浓度均为10μg·mL-1混合多肽溶液4mL于离心管，加入2mgNU-1000，超声10min，离心15min(9000rpm)，弃去上清液，向沉淀中加入2mL超纯水，超声2min，抽滤，连同滤纸一起置于离心管，加入0.5mL不同解吸剂(如表3所示)，超声10min，所得溶液过0.22μm的微孔滤膜，为解吸液，使用高效毛细管电泳测定浓度，计算回收率。由表3可知，当解吸剂为NaOH时，所得到的回收率大幅度增加。考察NaOH浓度不同时的回收率，结果如图8所示，当NaOH溶液的浓度为0.01mol·L-1时(pH＝11.56)，回收率达到最大且大于100％，说明两种多肽几乎完全洗脱出来。
表3不同解吸剂及酸碱度对回收率的影响
实验例4线性方程、定量限、检出限及精密度
配制F-1、AQ-5浓度分别为5μg·mL-1、10μg·mL-1、20μg·mL-1、40μg·mL-1、80μg·mL-1、160μg·mL-1的多肽混合溶液，按照实施例1的方法测试系列浓度对照品溶液，以电泳谱图的峰面积(Y)与相应的化合物浓度X(μg·mL-1)进行线性回归，结果显示两种地龙多肽的峰面积和浓度呈现良好的线性关系。
将浓度为80μg·mL-1的F-1、AQ-5多肽混合溶液连续进样5次，结果显示各分析物迁移时间的相对标准偏差(RSD)小于1.3％，峰面积的RSD小于8.4％，表明该方法精密度良好。
在线性回归的前提下，根据三倍信噪比确定2种分析物的检测限和定量限。线性关系、精密度、检测限(LOD)及定量限(LOQ)的结果见表4。
表4 2种多肽的线性方程、定量限、检出限及精密度
结果表明，本发明方法的线性关系和精密度良好。
实验例5重复性实验
分别取两种多肽F-1，AQ-5的浓度均为10μg·mL-1混合多肽溶液4mL于6个离心管中，分别加入2mg NU-1000，超声10min，离心15min(9000rpm)，尽量弃去上清液，向沉淀中加入2mL超纯水，超声2min，抽滤，连同滤纸一起置于离心管，加入0.5mL，0.01mol·L-1NaOH溶液，超声10min，得到的溶液过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，使用高效毛细管电泳测定，结果如表5所示，重复性良好。
表5两种多肽回收率重复性
实验例6稳定性实验
一、多肽溶液的稳定性
配制浓度为10μg·mL-1的F-1及AQ-5的地龙多肽混合溶液，室温放置分别于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、10、24h进样，使用毛细管区带电泳法测定，记录F-1和AQ-5六种多肽的峰面积，并计算其RSD。结果如表6和图9所示，随着时间的推移，多肽的峰面积逐渐变小，多肽F-1及AQ-5在1.5h内峰面积的RSD分别为16％和20％，且在24h时已无法检测，说明浓度为10μg·mL-1的F-1及AQ-5的地龙多肽混合溶液在室温中不能稳定存在1.5h，室温存放24h后多肽几乎完全分解。
表6两种多肽溶液室温放置稳定性试验
二、经NU-1000萃取后多肽的稳定性
分别取多肽F-1，AQ-5的浓度均为10μg·mL-1混合多肽溶液4mL于6个离心管中，分别加入2mg NU-1000，超声10min，离心15min(9000rpm)，弃去上清液，向沉淀中加入2mL超纯水，超声2min，抽滤，连同滤纸一起置于离心管，得六份样品。将六份样品室温放置，分别于1、3、6、21、35、180d进行解吸处理，即加入0.5mL，0.01mol·L-1NaOH溶液，超声10min，得到的溶液过0.22μm微孔滤膜。取续滤液，使用毛细管区带电泳法测定。记录多肽F-1和AQ-5的峰面积，并计算其RSD。结果如图10所示，室温放置180天，多肽F-1峰面积的RSD为8.5％，室温放置21天，AQ-5的峰面积的RSD为8.0％，结果说明，经NU-1000萃取，多肽F-1和AQ-5分别能在180天和21天内能够相对稳定。这表明相比于游离的多肽F-1和AQ-5，他们被NU-1000萃取后稳定性有所提高。
表7两种多肽经NU-1000萃取后室温放置稳定性试验
通过上述实施例和实验例可以看到，本发明提供了利用NU-1000对多肽F-1和多肽AQ-5的选择性吸附对这两种多肽进行富集和利用毛细管电泳进行检测的方法。本发明的检测方法检测限和定量限低，精密度高，线性范围大，有利于两种多肽的准确检测。此外，经过NU-1000萃取的多肽F-1和多肽AQ-5稳定性提高，更有利于这两种多肽的准确检测。
Claims (5)
1.MOFs材料NU-1000用于富集地龙中多肽F-1和/或多肽AQ-5的用途，其特征在于：所述用途中包括MOFs材料NU-1000和碱，所述用途中MOFs材料NU-1000与碱的比例为1-3mg:0.002-0.008mmol；所述MOFs材料NU-1000是由1,3,6,8-四苯甲酸-芘和Zr6(μ3-OH)8(OH)8配位得到的三维多孔金属有机骨架材料。
2.一种多肽的检测方法，其特征在于：所述检测方法是采用MOFs材料NU-1000对样品中的多肽进行富集后进行检测的方法，所述多肽为F-1和/或AQ-5，所述MOFs材料NU-1000是由1,3,6,8-四苯甲酸-芘和Zr6(μ3-OH)8(OH)8配位得到的三维多孔金属有机骨架材料；
包括如下步骤：
(1)将样品制备成供试品溶液；
(2)向供试品溶液中加入MOFs材料NU-1000对所述多肽进行富集；
(3)分离所述MOFs材料NU-1000，加入解吸剂溶液解吸，得到解吸溶液；
(4)检测所述解吸溶液中多肽的含量；
步骤(3)中，所述解吸剂溶液为pH＝11.56的碱溶液；所述MOFs材料NU-1000与碱溶液的比例为1-3mg:0.002-0.008mmol。
3.按照权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述检测的方法为毛细管电泳法。
4.按照权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述样品为地龙。
5.按照权利要求2所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述供试品溶液的溶剂为水，所述供试品溶液的pH为4；
和/或，步骤(2)中，所述富集的过程为超声处理至少10min。
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