CN106268707B - 一种基于磁性多孔材料的磷酸肽富集新方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于磁性多孔材料的磷酸肽富集新方法，将DOTA共价连接到经过氨基修饰的磁性纳米材料NH2‑MNP表面；随后金属离子Zn2+通过与DOTA的螯合作用固定在材料表面形成Fe3O4@DOTA‑Zn纳米颗粒；将所得到的Fe3O4@DOTA‑Zn颗粒悬浮于含硝酸锌和2‑咪唑甲醛的DMF溶液中；再采用制备的磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA‑ZIF‑90进行标准磷酸化蛋白和Hela细胞全蛋白提取物复杂样本中的磷酸肽富集。该合成的磁性MOF材料金属固载量大、金属复合物稳定、亲水性好；合成的不同金属离子固载的磁性MOF材料在全磷酸肽富集过程中选择性高、灵敏度高、富集效率高。

Description

一种基于磁性多孔材料的磷酸肽富集新方法
技术领域
本发明涉及分析化学领域，具体是一种基于磁性多孔材料的磷酸肽富集新方法。
背景技术
蛋白质磷酸化修饰作为一种重要的蛋白质翻译后修饰方式，广泛参与调控细胞内诸多生命活动。虽然磷酸化蛋白质组学已经取得了很大的进展，但由于磷酸肽丰度低、不易离子化且在质谱鉴定中存在大量非特异性肽段的干扰，使得磷酸肽的直接鉴定存在很多困难。因此，研究快速高效、特异性强的磷酸肽富集分离方法仍然有着十分重要的意义。
目前，应用较为广泛的磷酸肽富集分离方法主要有金属氧化物亲和色谱法(MetalOxide Affinity Chromatography，MOAC)和固相金属离子亲和色谱法(Immobilized metalion affinity chromatography，IMAC)。其中，金属氧化物亲和色谱法中基于TiO2的富集分离方法由于具有较高的特异性和灵敏度而应用最为频繁。但研究证明TiO2更易分离出单磷酸化肽段，由于TiO2对多磷酸化位点肽段具有较强的吸附性而不易将其洗脱。该方法对于鉴定多磷酸肽仍然存在一定困难。因此，基于IMAC的磷酸肽富集分离策略由于对单位点磷酸化肽段和多位点磷酸化肽段的富集不存在偏性而受到了越来越多的关注。IMAC富集磷酸肽的基本原理是Zr4+，Fe3+，Ti4+等金属阳离子与适当的配体(如磷酸基团、氨三乙酸、亚氨乙酸)进行螯合形成金属复合物从而将金属离子固定在材料表面。在酸性环境下，磷酸肽特有的磷酸基团通过与金属离子的螯合作用吸附在材料上，从而与样品中的非磷酸化肽段进行了分离。在碱性环境下，这种特异性吸附作用被破坏，磷酸肽被洗脱下来进而进行鉴定。然而研究表明，基于传统IMAC方法富集磷酸肽的特异性不高。一方面，单一金属离子的应用使材料在富集磷酸肽的同时也吸附了一些非特异性肽段，导致磷酸肽在质谱检测中信号受到抑制而影响检测效果；另一方面，用于固载金属的配体的亲疏水性也直接影响磷酸肽的富集效果。
金属有机骨架(metal-organic frameworks，MOF)材料是一类由金属离子和有机配位体通过自组装形成的材料。由于其具有较大的比表面积和孔隙率、结构和功能的可变性，已广泛应用于氢气储存、催化、生物传感器、气体分离等领域。
为了使MOFs材料有更广泛的应用，目前有两种方法对MOFs材料进行功能基团修饰，即合成前功能化和合成后修饰。合成前功能化策略是指在MOFs材料合成前选择具有功能基团的配体，合成后的MOFs材料带有此目标基团，IRMOFs(Isoreticular Metal–OrganicFramework)和ZIF(Zeolitic Imidazolate Frameworks)系列材料都是利用该方法合成的。合成后修饰方法是指通过与MOFs材料的固有基团的共价连接或与不饱和金属离子的配位作用而引入新的功能基团，该方法已被证明是MOFs材料进行合成后修饰和应用的一种高效而实用的方法。
最近，在蛋白质组学领域研究中，MOFs材料已合成并应用于大分子蛋白的筛除、低丰度肽段富集、磷酸肽/糖肽富集等。Gu等人合成了MIL-53，MIL-100，MIL-101用于肽段富集，由于MOFs材料中的孔径结构，使得在富集肽段的同时，又可以去除分子量较大的蛋白质，实现了蛋白和肽段的分离，然而这几种MOFs材料需要借助离心的手段进行分离，使得操作过程不便而且容易引起材料的丢失；Zhao等合成了Fe3O4@PDA@[Cu3(btc)2]用于不同蛋白酶的固定和蛋白质的酶解，然而由于蛋白酶是通过非特异性吸附作用固定在材料上的，导致在蛋白质酶切的过程中酶会随着温度等变化而从材料上脱落，这极大限制了该类固定化酶反应器的应用。因此，考虑到蛋白酶固定在MOFs材料上的不同方式以及磁性材料易于操作的优势，设计和和合成新型的磁性MOFs材料用于蛋白酶的共价固定仍然是十分必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于磁性多孔材料的磷酸肽富集新方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于磁性多孔材料的磷酸肽富集新方法，包括：
(1)磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90的制备
首先，将DOTA共价连接到经过氨基修饰的磁性纳米材料NH2-MNP表面；随后金属离子Zn2+通过与DOTA的螯合作用固定在材料表面形成Fe3O4@DOTA-Zn纳米颗粒；然后，将所得到的Fe3O4@DOTA-Zn颗粒悬浮于含硝酸锌和2-咪唑甲醛的DMF溶液中；
(2)磷酸肽富集
采用步骤(1)制备的磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90进行标准磷酸化蛋白和Hela细胞全蛋白提取物复杂样本中的磷酸肽富集。
作为本发明进一步的方案：步骤(1)的具体操作步骤为：一、将1mLNH2-MNP置于含有10mgDOTA的乙腈溶液中，反应4h，然后用水和乙醇分别洗涤三次；将磁性纳米颗粒重悬在含有8mMZn(NO3)2·4H2O的乙醇溶液中，70℃条件下反应6h，得到Fe3O4@DOTA-Zn2+颗粒；将得到的Fe3O4@DOTA-Zn2+颗粒用乙醇和去离子水分别洗涤三次，并在4℃条件下储存备用；二、将硝酸锌和2-咪唑甲醛按2：3的摩尔比溶解于DMF溶液，然后从步骤一得到的Fe3O4@DOTA-Zn2+颗粒中取1mL加入到含硝酸锌和2-咪唑甲醛的DMF溶液中，将混合物溶液在100℃条件下加热18h，起始外层ZIF-90的生长，得到磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90；三、通过外加磁场对上述磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90进行分离和收集，并分别用DMF和二氯甲烷进行洗涤，最后将所得磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90在80℃烘箱中烘干备用。
作为本发明再进一步的方案：步骤(2)的具体步骤为：取磁性MOF材料置于1.5mL离心管中，用上样缓冲液清洗三次，上样缓冲液包括50％乙腈和1％TFA；向离心管中加入150μL上样缓冲液重悬磁性MOF材料，加入蛋白酶切产物，室温涡旋15min；在外加磁场作用下，吸去上清液，用上样缓冲液和洗涤缓冲液各漂洗材料三次，洗涤缓冲液包括50％乙腈和0.1％TFA；用1μL 0.1M氨水洗脱结合在材料上的磷酸肽，重复五次。
作为本发明再进一步的方案：所述NH2-MNP通过热溶剂法制备。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
该合成的磁性MOF材料具有较大的金属固载量、稳定的金属复合物以及良好的亲水性；实验结果表明，合成的不同金属离子固载的磁性MOF材料在全磷酸肽富集过程中具有更高的选择性、灵敏度及富集效率；与传统的TiO2方法相比，由于材料具有良好的磁响应能力使得操作过程更加省时、便捷。
附图说明
图1为固载Ti的磁性MOF材料富集磷酸肽后的质谱图。
图2为固载Zr的磁性MOF材料富集磷酸肽后的质谱图。
图3为固载Fe的磁性MOF材料富集磷酸肽后的质谱图。
图4为固载Tb的磁性MOF材料富集磷酸肽后的质谱图。
图5为固载Tm的磁性MOF材料富集磷酸肽后的质谱图。
图6为固载Ho的磁性MOF材料富集磷酸肽后的质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
请参阅图1-6，一种基于磁性多孔材料的磷酸肽富集新方法，包括：
(1)磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90的制备
磁性MOFs材料的合成方法使用热溶剂法、合成前功能化法或合成后修饰法。首先，将DOTA共价连接到经过氨基修饰的磁性纳米材料NH2-MNP表面；随后金属离子Zn2+通过与DOTA的螯合作用固定在材料表面形成Fe3O4@DOTA-Zn纳米颗粒；然后，将所得到的Fe3O4@DOTA-Zn颗粒悬浮于含硝酸锌和2-咪唑甲醛的DMF溶液中，基于DOTA和金属离子Zn2+的金属复合物的稳定存在保证了MOFs材料在磁性纳米颗粒表面的生长；
具体操作步骤如下：一、将1mLNH2-MNP置于含有10mgDOTA的乙腈溶液中，反应4h，然后用水和乙醇分别洗涤三次；将磁性纳米颗粒重悬在含有8mMZn(NO3)2·4H2O的乙醇溶液中，70℃条件下反应6h，得到Fe3O4@DOTA-Zn2+颗粒；将得到的Fe3O4@DOTA-Zn2+颗粒用乙醇和去离子水分别洗涤三次，并在4℃条件下储存备用；二、将硝酸锌和2-咪唑甲醛按2：3的摩尔比溶解于DMF溶液，然后从步骤一得到的Fe3O4@DOTA-Zn2+颗粒中取1mL加入到含硝酸锌和2-咪唑甲醛的DMF溶液中，将混合物溶液在100℃条件下加热18h，起始外层ZIF-90的生长，得到磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90；三、通过外加磁场对上述磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90进行分离和收集，并分别用DMF和二氯甲烷进行洗涤，最后将所得磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90在80℃烘箱中烘干备用。
(2)磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90的表征
使用扫描电镜(HitachiS-4800)观察磁性MOFs材料的形貌、粒径和尺寸；采用能量散射X射线进行元素分析；红外光谱分析由Nicolet傅立叶变换红外光谱仪(Nicolet)完成，样品采用KBr压片法制备；热重分析(TGA)由热重分析仪(SDTQ600)完成，整个实验操作在氮气氛围进行；样品磁学性能用物理性能测量系统(QuantumDesign)在室温下测定；X射线衍射分析使用布鲁克X射线衍射仪(D8Advance)完成。
(3)标准蛋白酶切产物的制备
将500μg标准磷酸化蛋白α-酪蛋白溶解于100μL的50mM碳酸氢铵溶液，放入沸水中变性10min；按蛋白质：胰蛋白酶＝50：1的质量比加入胰蛋白酶，在37℃水浴中孵育16h，收集的酶切肽段分装后在-20℃条件下保存，备用；将1mg牛血清白蛋白(BSA)溶解于50mM碳酸氢铵溶液，经过DTT还原变性和IAA烷基化处理后，按上述步骤进行酶切，收集的肽段分装后在-20℃条件下保存，备用。
(4)Hela细胞蛋白酶切产物的制备
将Hela细胞转移至含有10％胎牛血清的DMEM培养液中，置于培养箱中培养(37℃，5％CO2，饱和湿度)；收集培养的Hela细胞置于细胞裂解液中(8M尿素，50mMTris-HCL缓冲液，1％二硫苏糖醇，1mM氟化钠，0.2mM钒酸钠，2mM焦磷酸钠)，冰上裂解30min后，将样品在4℃以14000g转速离心10min；收集上清液，在沸水中变性5min；变性后的蛋白样品的酶切使用FASP(filteraidedsamplepreparation)方法去除尿素，最后用NanoDrop测量收集的肽段浓度。
(5)磷酸肽富集
取磁性MOF材料置于1.5mL离心管中，用上样缓冲液(50％乙腈，1％TFA)清洗三次；向离心管中加入150μL上样缓冲液重悬磁性MOF材料，加入蛋白酶切产物，室温涡旋15min；在外加磁场作用下，吸去上清液，用上样缓冲液和洗涤缓冲液(50％乙腈，0.1％TFA)各漂洗材料三次；用1μL0.1M氨水洗脱结合在材料上的磷酸肽，重复五次。将洗脱下来的磷酸肽与1μLDHB基质(50％ACN，0.1％H3PO4)混合点于4800MALDI-TOF/TOFMS靶上，自然风干后进行质谱检测，或将洗脱下来的磷酸肽经过脱盐处理后进行液-质联用分析。
作为优选，所述NH2-MNP通过热溶剂法制备；
一、磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90的表征结果：
磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90的粒径明显增大，平均直径约为30um；ZIF-90成功沉积在磁性纳米材料中；磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90具有极良好的热稳定性；磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90可以在外加磁场的作用下实现快速分离；磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90具有较大比表面积。
二、固载不同金属离子的磁性MOF材料富集磷酸肽效果考察
实验组处理：首先，1ugα-酪蛋白酶切后肽段与150uL单一过渡金属离子固载的磁性MOF材料室温混合15mins，通过外加磁场分离后磁性MOF材料经上样缓冲液(50％乙腈，1％TFA)、洗涤缓冲液(50％乙腈，0.1％TFA)和去离子水各洗涤三次，最后用0.1M氨水洗脱富集的磷酸肽进行质谱分析。
对照组处理：未经材料富集的α-酪蛋白酶切后肽段直接进行质谱分析。
实验结果：磷酸化肽段且信号显著提高，非磷酸化肽段几乎检测不到。其中，经Fe3O4@DOTA-ZIF-90-Ti和Fe3O4@DOTA-ZIF-90-Tb富集后可鉴定到15条磷酸化肽段，而基于Zr4+，Fe3+，Tm3+，Ho3+固载的磁性MOF材料可分别鉴定到14，11，11，13条磷酸肽。
实验结果其结果Fe3O4@DOTA-ZIF-90-Ti和Fe3O4@DOTA-ZIF-90-Tb的富集结果较好，而且经Fe3O4@DOTA-ZIF-90-Ti和Fe3O4@DOTA-ZIF-90-Tb富集后鉴定到的磷酸肽中，多磷酸肽占46.67％，其比例高于其他金属离子固载的磁性纳MOF材料富集的多磷酸肽比例，说明在磷酸肽富集过程中，不同金属离子直接影响多磷酸肽的吸附效果。
三、固载不同金属离子的磁性MOF材料富集磷酸肽的灵敏度考察
实验处理：降低富集样品的上样量，当样品上样量为100fmol时，对α-酪蛋白酶切产物进行磷酸肽富集。
实验结果：经过渡金属Ti，Zr，Fe固载的磁性MOF材料富集后仍可检测到5，4，5条磷酸化肽段，而经镧系金属离子Tb，Tm，Ho固载的磁性MOF材料富集后可鉴定到3，2，3条磷酸肽。
实验结果表明：过渡金属对于磷酸肽富集的灵敏度在整体上优于镧系金属对磷酸肽的富集灵敏度。
四、固载不同金属离子的磁性MOF材料富集磷酸肽的使用重复性考察
实验处理：将磁性MOF材料用洗脱液进行充分洗涤，所得材料对α-酪蛋白酶切产物进行磷酸肽富集，实验重复5次。
实验结果：经过5次富集后，固载过渡金属Ti，Zr，Fe的磁性MOF材料仍可鉴定到17，15，16条磷酸肽，而固载镧系金属Tb，Tm，Ho的磁性MOF材料仍可以检测到17，16，17条磷酸肽。
实验结果表明：固载过渡金属Ti，Zr，Fe，Tb，Tm和Ho的磁性MOF材料对于磷酸肽富集具有良好的使用重复性，也说明镧系金属与DOTA之间较强的螯合作用。
五、固载不同金属离子的磁性MOF材料富集磷酸肽的特异性考察
实验处理：将α-酪蛋白酶切产物与非磷酸化蛋白牛血清白蛋白酶切产物按1：50比例混合，经过固载不同金属离子的磁性MOF材料进行磷酸肽富集，然后进行质谱分析。
实验结果：经过渡金属Ti，Zr，Fe固载的磁性MOF材料富集后可以分别检测到14，12，12条信号强度显著增强的磷酸肽对应的质谱峰，而经镧系金属Tb，Tm，Ho固载的磁性MOF材料富集后可以分别检测到15，12，17条磷酸肽。
实验结果表明：镧系金属固载的磁性MOF材料对磷酸肽的特异性富集效果优于过渡金属固载的磁性MOF材料对磷酸肽的特异性富集。
六、固载不同金属离子的磁性MOF材料用于Hela细胞蛋白酶切产物全磷酸肽的富集
实验处理:首先，将1.0mgHela细胞蛋白提取液进行胰蛋白酶酶切、冻干后用上样缓冲液(50％乙腈，1％TFA)进行重溶；然后，重溶的酶切样品经Fe3O4@DOTA-ZIF-90-Ti和Fe3O4@DOTA-ZIF-90-Tb两种材料进行全磷酸肽富集；最后，将收集的磷酸肽样品经除盐处理后进行质谱分析。
实验结果：一共鉴定到13450条磷酸肽，对应2965个磷酸化蛋白，其中13116条是特异性磷酸肽。磷酸肽富集特异性高达94％，说明发展的新方法克服了IMAC材料富集磷酸肽过程中非特异性肽段吸附较多的缺点，在富集特异性方面有了显著提升；在所有富集的磷酸肽中，48.16％是单磷酸肽，35.97％是具有两个磷酸化位点的肽段，11.36％是具有三个磷酸化位点的肽段，4.5％是是具有四个磷酸化位点的肽段。多磷酸肽在鉴定到的特异性肽段中的比例超过了50％，该方法的多磷酸肽富集效果明显优于DHB/TiO2法。
该合成的磁性MOF材料具有较大的金属固载量、稳定的金属复合物以及良好的亲水性；实验结果表明，合成的不同金属离子固载的磁性MOF材料在全磷酸肽富集过程中具有更高的选择性、灵敏度及富集效率；与传统的TiO2方法相比，由于材料具有良好的磁响应能力使得操作过程更加省时、便捷。
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下做出各种变化。

Claims (4)

1.一种基于磁性多孔材料的磷酸肽富集新方法，其特征在于，包括：
(1)磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90的制备
首先，将DOTA共价连接到经过氨基修饰的磁性纳米材料NH2-MNP表面；随后金属离子Zn2 +通过与DOTA的螯合作用固定在材料表面形成Fe3O4@DOTA-Zn纳米颗粒；然后，将所得到的Fe3O4@DOTA-Zn颗粒悬浮于含硝酸锌和2-咪唑甲醛的DMF溶液中；
(2)磷酸肽富集
采用步骤(1)制备的磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90进行标准磷酸化蛋白和Hela细胞全蛋白提取物复杂样本中的磷酸肽富集。
2.根据权利要求1所述的基于磁性多孔材料的磷酸肽富集新方法，其特征在于，步骤(1)的具体操作步骤为：一、将1mLNH2-MNP置于含有10mgDOTA的乙腈溶液中，反应4h，然后用水和乙醇分别洗涤三次；将磁性纳米颗粒重悬在含有8mMZn(NO3)2·4H2O的乙醇溶液中，70℃条件下反应6h，得到Fe3O4@DOTA-Zn2+颗粒；将得到的Fe3O4@DOTA-Zn2+颗粒用乙醇和去离子水分别洗涤三次，并在4℃条件下储存备用；二、将硝酸锌和2-咪唑甲醛按2：3的摩尔比溶解于DMF溶液，然后从步骤一得到的Fe3O4@DOTA-Zn2+ 颗粒中取1mL加入到含硝酸锌和2-咪唑甲醛的DMF溶液中，将混合物溶液在100℃条件下加热18h，起始外层ZIF-90的生长，得到磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90；三、通过外加磁场对上述磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90进行分离和收集，并分别用DMF和二氯甲烷进行洗涤，最后将所得磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90在80℃烘箱中烘干备用。
3.根据权利要求1所述的基于磁性多孔材料的磷酸肽富集新方法，其特征在于，步骤(2)的具体步骤为：取磁性MOF材料置于1.5mL离心管中，用上样缓冲液清洗三次，上样缓冲液包括50％乙腈和1％TFA；向离心管中加入150μL上样缓冲液重悬磁性MOF材料，加入蛋白酶切产物，室温涡旋15min；在外加磁场作用下，吸去上清液，用上样缓冲液和洗涤缓冲液各漂洗材料三次，洗涤缓冲液包括50％乙腈和0.1％TFA；用1μL 0.1M氨水洗脱结合在材料上的磷酸肽，重复五次。
4.根据权利要求1所述的基于磁性多孔材料的磷酸肽富集新方法，其特征在于，所述NH2-MNP通过热溶剂法制备。
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