CN103304735B - 一种在水醇混合溶剂中制备聚合物微球的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属聚合物材料和分析技术领域，涉及一种苯硼酸聚合物微球及其制备方法和在糖蛋白富集方面的应用。本发明在水和乙醇的新型混合溶剂体系中制备含有乙烯基苯硼酸聚合物微球。包括如下步骤：将含有单体、交联剂、引发剂分散在水和乙醇的混合溶液中，在60-70℃的条件下反应8-24小时，即可以在反应体系中收集到本发明的产物。本发明的合成方法简单、易行、成本低廉、对环境友好是典型的绿色反应，制备得到的聚合物微球具有单分散性好，作为富集材料具有比表面积大，特异性强等特点，可以用于分离或富集带有1，2-顺式二醇结构的糖蛋白。

Description

一种在水醇混合溶剂中制备聚合物微球的方法
技术领域
本发明属于聚合物材料和分析技术，具体地涉及一种含有4-乙烯基苯硼酸聚合物纳微球的制备方法以及在糖蛋白富集中的应用。
背景技术
随着人类基因组测序的结束，蛋白质组学逐渐成为大家关注的焦点，其中对翻译后修饰蛋白的分析与鉴定是蛋白质组学研究的重点。糖蛋白作为一种非常重要的翻译后修饰蛋白，参与细胞的生长、细胞之间信息传导、免疫等过程。但是由于在生物体内含量少，其容易被其他非糖基化蛋白干扰，并且在质谱中不容易电离等特点，对其鉴定之前，需要对其经行富集。
硼酸亲和作用机理是硼酸基团对于1，2-邻二羟基化合物在碱性的条件下结合形成五元环的脂类，在酸性条件下还原解离，因此，对于糖类、RNA、核酸、糖蛋白和糖肽等具有1，2-邻二羟基结构的分子具有较强的特异性富集能力。使用硼酸机理材料对糖类，糖蛋白的富集得到越来越多的关注。
专利CN 101684005A采用在磁性纳米粒子表面的氨基分别于己二酰氯、3-氨基苯硼酸反应制备表面修饰的硼酸基团的纳米材料，并且用于糖蛋白与糖肽的富集，但是采用这种方法制备的材料步骤较为复杂，消耗时间大，并且在制备上要求较高。
利用3-丙烯酰氨基苯硼酸作为单体(APBA)与N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)聚合形成聚合物微球，并且用于对糖进行富集(VéroniqueLapeyre，Isabelle Gosse，Sylviane Chevreux，and Valérie Ravaine，Biomacromolecules 2006，7，3356-3363)。但是，其合成过程中加入了表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)，能够残留在聚合物微球的表面，残留的SDS对很多化合物都具有很强非特异性吸附，使用该方法制备的材料用于富集其特异性下降。
发明内容
本发明目的是克服现有技术中的不足，提供一种制备单分散的纳米/微米级带有苯硼酸功能聚合物微球及其制备方法以及用于对糖蛋白分离富集的应用。本发明以4-乙烯基苯硼酸作为单体，使用水和乙醇作为混合溶剂采用一步法制备了具有单分散的纳米/微米聚合物微球。该方法简单、省时、易行是绿色聚合反应。得到的产物颗粒形状规整，单分散性好，表面不含有任何表面活性剂和添加剂。利用该聚合物材料作为富集材料，对糖蛋白的分离富集以及MALDI-TOF/MS直接分析，从而解决了样品的分析困难，同时也为聚合物纳米/微米球的应用开辟了新的途径。
本发明提供的制备聚合物微球的方法，包括如下步骤：
步骤一：在25mL的圆底烧瓶中，装上冷凝管，加入乙醇和水的混合溶液，加入单体、交联剂和引发剂等，超声1分钟，使得加入的试剂溶解形成均匀的溶液，之后通氮气15分钟，加入磁力搅拌子。反应装置放在油浴锅中均匀缓慢加热，在30min内升温至60～80℃。磁力搅拌子保持300rad/min速度。维持60～80℃条件下反应10～24小时，停止反应，冷却至室温。
步骤二：使用高速离心机用10000rad/min的速度离心，去除上清液，加入乙醇和水的混合溶液洗三遍，之后用四氢呋喃、丙酮、无水乙醚各洗涤3遍后，50℃真空干燥箱内真空干燥24小时。
在步骤一中，所说的单体选自4-乙烯基苯硼酸或者4-乙烯基苯硼酸和甲基丙烯酸的混合物，混合物中两者的摩尔比例为1∶1-4。交联剂选自N，N-亚甲基双丙烯酰胺或者N，N-亚甲基双丙烯酰胺和二乙烯基苯混合物，混合物中两者的摩尔比例为3～6∶1。引发剂选偶氮二异丁腈。单体与交联剂之间的摩尔比例为3～6∶1。混合溶液为乙醇和水，其中乙醇占总溶剂的体积比为：10％-30％。含有单体，交联剂和引发剂的溶剂中，单体和交联剂总重量浓度为1％～2％，引发剂的重量浓度为0.05％～0.1％，余量为混合溶剂。
在步骤二中，制备出来的单分散聚合物微球，其粒径为200nm～1μm，聚合物微球的PdI小于0.15。
使用水-醇混合溶剂制备聚合物纳/微球的方法，其制备得到的聚合物微球可以用于分离或富集糖蛋白。
本发明的优点如下：
1.本发明提供的聚合物纳微球制备方法，采用乙醇与水的混合溶液作为溶剂，提高了功能单体4-乙烯基苯硼酸的溶解性，克服了以往方法采用在溶剂中增加SDS等表面活性剂的方法，增强材料的特异吸附能力，并且乙醇和水都是无毒无害的溶剂，因此该反应对环境友好是典型的绿色反应，
2.本发明提供的聚合物纳微球制备方法，采用“一锅法”合成步骤简单、易行、成本低廉、制备过程中反应条件温和，易于操作，因此，便于推广普及。
3.使用该方法制得的纳米/微米功能性聚合物微球，其粒径在200nm到1μm之间，粒径单分散，且聚合物颗粒干净，不含有任何添加剂或者稳定剂。
4.使用水-醇混合溶剂制备聚合物纳/微球的方法制备得到的聚合物微球可以用于分离或富集糖蛋白，开辟聚合物微球在蛋白质组学方面的新应用。
附图说明
图1为实施例1中4-乙烯基苯硼酸与亚甲基双丙烯酰胺摩尔比为1∶6制备的聚合物微球的扫描电镜照片(图a)和动态光散射图(图b)。
图2为实施例2中4-乙烯基苯硼酸与亚甲基双丙烯酰胺与二乙烯基苯摩尔比为1∶3∶1制备的聚合物微球的扫描电镜照片(图a)和动态光散射图(图b)。
图3为实施例3中4-乙烯基苯硼酸与亚甲基双丙烯酰胺与甲基丙烯酸摩尔比为1∶6∶1制备的聚合物微球的扫描电镜照片(图a)和动态光散射图(图b)。
图4为实施例4，其中a图为非糖蛋白(BSA)和糖蛋白(HRP)的原蛋白混合溶液，b图为经过材料富集后的第一次洗脱的上清液，c图为第二次洗脱的上清液。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容做出一些非本质的改进和调整。
本发明所用的原料：所有交联剂、共聚单体，引发剂，溶剂和试剂都是分析纯。
实施例1
在25mL的圆底烧瓶中，装上冷凝管，加入2ml乙醇和8ml水形成混合溶液，加入33.8mg的4-乙烯基苯硼酸、221.1mg的亚甲基双丙烯酰胺和5毫克的偶氮二异丁腈，超声1分钟，使得加入的试剂溶解形成均匀的溶液，之后通氮气15min，加入磁力搅拌子。反应装置放在油浴锅中均匀缓慢加热，在30min内升温至70℃。磁力搅拌子保持300rad/min速度。维持反应条件24小时，停止反应，冷却至室温。使用高速离心机用10000rad/min的速度离心，去除上清液，加入乙醇和水的混合溶液洗三遍，之后用四氢呋喃、丙酮、无水乙醚各洗涤3遍后，50℃真空干燥箱内真空干燥24小时，得到聚合物样品。经过扫描电镜测试，结果如图1a)所示，沉淀聚合制得的聚合物颗粒平均粒径为250nm；通过动态光散射测试得到颗粒的聚合物分散系数为0.122，如图1b)所示，聚合物颗粒的粒径分布均匀，单分散性好。
实施例2
在25mL的圆底烧瓶中，装上冷凝管，加入2ml乙醇和8ml水形成混合溶液，加入47.35mg的4-乙烯基苯硼酸、148mg的亚甲基双丙烯酰胺、45.6μL的二乙烯基苯和5mg的偶氮二异丁腈，超声1min，将加入的试剂溶解形成均匀的溶液，之后通氮气15min，加入磁力搅拌子。反应装置放在油浴锅中均匀缓慢加热，在30min内升温至70℃。磁力搅拌子保持300rad/min速度。维持反应条件24小时，停止反应，冷却至室温。使用高速离心机用10000rad/min的速度离心，去除上清液，加入乙醇和水的混合溶液洗三遍，之后用四氢呋喃、丙酮、无水乙醚各洗涤3遍后，50℃真空干燥箱内真空干燥24小时，得到聚合物样品。经过扫描电镜测试，结果如图2a)所示，沉淀聚合制得的聚合物颗粒平均粒径为300nm；通过动态光散射测试得到颗粒的聚合物分散系数为0.093，如图1b)所示，聚合物颗粒的粒径分布均匀，单分散性好。
实施例3
在25mL的圆底烧瓶中，装上冷凝管，加入2ml乙醇和8ml水形成混合溶液，加入29.6mg的4-乙烯基苯硼酸、185mg的亚甲基双丙烯酰胺、17.1μL甲基丙烯酸和5mg的偶氮二异丁腈，超声1min，将加入的试剂溶解形成均匀的溶液，之后通氮气15min，加入磁力搅拌子。反应装置放在油浴锅中均匀缓慢加热，在30min内升温至70℃。磁力搅拌子保持300rad/min速度。维持反应条件24小时，停止反应，冷却至室温。使用高速离心机用10000rad/min的速度离心，去除上清液，加入乙醇和水的混合溶液洗三遍，之后用四氢呋喃、丙酮、无水乙醚各洗涤3遍后，50℃真空干燥箱内真空干燥24小时，得到聚合物样品。经过扫描电镜测试，结果如图2a)所示，沉淀聚合制得的聚合物颗粒平均粒径为1000nm；通过动态光散射测试得到聚合物颗粒的分散系数为0.142，如图1b)所示，聚合物颗粒的粒径分布均匀，单分散性好。
实施例4
BSA和HRP质量比1∶1的混合蛋白溶解在浓度为50mM，pH＝9.0的碳酸氢铵缓冲溶液中配置为蛋白原溶液。称取1mg在实施例1中制备的poly(MBA-VPBA)聚合物微球，分散在200μL上述蛋白溶液中，在室温条件下孵育2小时，反应结束后离心，保留上清液(标注为：上清液1)待质谱鉴定。50mM碳酸氢铵缓冲溶液(pH 9.0)洗涤材料数遍，离心弃上清。在分离得到的材料中加入20μL乙腈、水、三氟乙酸的混合溶液，(乙腈、水、三氟乙酸三者的体积比为50∶49∶1)，在室温下孵育1小时，离心取出上清液(标注为：上清液2)待质谱鉴定，即富集产物。将蛋白原液、上清液1和上清液2进行MALDI-TOF MS鉴定。
将1μL待分析物与1μL SA基质(20mg/mL芥子酸溶于含1％三氟乙酸的60％乙腈溶液)依次点于MALDI靶板上，待样品点干燥后进行质谱鉴定。MALDI-TOF MS实验是在Ultraflex III TOF/TOF(Bruker Daltonics，Bremen，Germany)上进行，检测时采用线性正离子模式。
如图4所示，a图为未经过材料分离富集处理的原蛋白混合溶液，b图为上清液，c图为富集产物。由图可以看出经Poly(MBA-co-VPBA)纳米粒子富集之后，HRP信号强度较原液(图4a)显著提高；且无BSA非特异吸附，干扰蛋白仅存在于上清之中(图4b)，表明材料具有较好的糖蛋白富集能力及良好的亲水性。

Claims (5)

1.一种在水醇混合溶剂中制备聚合物微球的方法，其特征在于：它包括以下步骤：将单体、交联剂和引发剂，分散在乙醇和水的混合溶剂中，在60～80℃下反应，反应8-24小时，从得到的乳液中收集产物，得聚合物微球 ；所述的单体选自4-乙烯基苯硼酸或者4-乙烯基苯硼酸和甲基丙烯酸的混合物，混合物中两者的摩尔比例为1:1-4；交联剂选自N,N’-亚甲基双丙烯酰胺或者N,N’-亚甲基双丙烯酰胺和二乙烯基苯混合物，混合物中两者的摩尔比例为3-6:1；单体总量与交联剂总量之间的摩尔比例为3-6:1；所述混合溶剂的组成为乙醇和水，其中乙醇体积占总混合溶剂的体积比为：10％-30％。
2.按照权利要求1中所述的方法，其特征在于：引发剂选偶氮二异丁腈。
3.按照权利要求1-2任一项中所述的方法，其特征在于：在含有单体、交联剂和引发剂的混合溶液中，单体和交联剂总重量浓度为1％～2％，引发剂的质量浓度为0.05％-0.1％，余量为混合溶剂。
4.按照权利要求1中所述的方法，其特征在于：单分散聚合物微球的粒径为200nm～1μm，聚合物分散系数(PdI)为0.09～0.15。
5.根据权利要求1-4任一项中所述的在水醇混合溶剂中制备聚合物微球的方法，其特征在于：制备得到的聚合物微球用于分离或富集糖蛋白。
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