CN104072678A - 一种聚合物微球及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种单分散核壳结构聚合物纳米粒子及其制备和应用。单烯类功能单体与多烯类交联单体通过聚合制得的聚合物粒子为核，然后通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合技术在核表面包裹3-丙烯酰胺基苯硼酸（APBA）与多烯类交联单体，形成表面光滑且带有硼酸功能基团的核壳结构的聚合物纳米粒子。本发明在材料表面通过RAFT方法引入苯硼酸功能基团，不仅克服了传统后修饰方法步骤繁琐、反应效率低以及直接聚合时产物形貌不稳定的缺点，而且使得APBA能够更稳定聚合，提高表面硼酸的键合量。本发明的聚合物纳米粒子可用于分离或富集带有1,2-顺式二醇结构的糖蛋白，在蛋白质组学等领域有较好的实用价值和应用前景。

Description

一种聚合物微球及其制备和应用

技术领域

本发明涉及富集糖蛋白，具体地说是一种单分散核壳结构聚合物纳米粒子及其制备和在糖蛋白富集中的应用。

背景技术

随着人类基因组测序的结束，蛋白质组学逐渐成为大家关注的焦点。众所周知，蛋白质的组成在生物体内是极其复杂并且不断变化，即使在相同物种的不同细胞或是相同细胞的不同时期，蛋白质的组成都存在显著差异。在这些蛋白中，翻译后修饰蛋白往往因其低丰度及复杂性而成为蛋白质组学研究的热点和难点。

糖蛋白作为一类重要的翻译后修饰蛋白，在信号转导、免疫及肿瘤发生等生物学过程中发挥着重要的作用。因此，糖蛋白和糖肽的发现与鉴定在疾病的诊断和蛋白质组学领域意义重大。在众多方法中，质谱技术已成为研究糖蛋白糖基化位点信息及糖型结构归属的有效工具，但由于糖蛋白丰度低、糖肽占总肽段比例小，分析检测时往往被高丰度的非糖肽掩盖，因此在分析之前，需要对糖蛋白/糖肽进行选择性富集。

目前最常用的糖蛋白富集方法包括凝集素亲和色谱，酰肼及硼酸功能化材料等。对于具有1,2-顺式二醇化学结构的糖型，苯硼酸可以与其形成可逆的五元或者六元环的酯。此方法步骤简便快捷，避免了糖链结构的破坏，且富集产物与质谱兼容。因此，苯硼酸在糖肽和糖蛋白的选择性富集领域受到了人们的关注。目前，在利用苯硼酸功能化基团对糖蛋白富集的材料中，使用较为广泛的是氨基苯硼酸和硫基苯硼酸。目前主要是利用这些功能分子上的氨基和硫基与基质材料上的基团反应，将苯硼酸功能化基团接枝在基质材料的表面（X Zhang,X He,L Chen,Y Zhang,J.Mater.Chem.2012,22,16520–16526;L Liang,Z Liu,Chem.Commun.2011,47,(8),2255-2257）。然而所采用的后修饰接枝策略效率较低并且步骤极其繁琐。有研究利用共聚合的方式制备了硼酸功能化整体柱（L Ren,Y Liu,M Dong,Z.Liu.J.Chromatogr.A.2009,1216,8421-8425；Z Lin,J Pang,H Yang,Z Cai,L Zhang,G.Chen,Chem.Commun.2011,47,9675-9677；Y Liu,L Ren,Z Liu.Chem.Commun.2011,47,5067-5069），虽硼酸键合效率提高且糖蛋白富集效果较好，但整体柱本身柱容量的限制使得此类材料不利于规模化蛋白样品的预处理。

发明内容

针对以上不足，本发明提供一种简单、省时、易行、产物重现性高的聚合反应方法，得到的产物颗粒形状规整，单分散性好，表面不含有任何表面活性剂和添加剂。利用该聚合物材料作为富集材料，对糖蛋白的分离富集以及可以兼容后续的MALDI-TOF/MS直接分析，从而解决了样品的分析困难。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

步骤一：在25mL的圆底烧瓶中，加入反应溶液，加入单烯类功能单体、多烯类交联剂和引发剂等，超声1分钟，使得加入的试剂溶解形成均匀的溶液，在烧瓶上装上Dean-Stark接收器，其上接冷凝管，之后通氮气15分钟，加入磁力搅拌子，磁力搅拌子保持300rad/min速度。反应装置放在油浴锅中均匀缓慢加热，反应器由室温在10～60分钟内升到60～140℃。维持60～140℃条件下，在1～4小时内将反应体系中的溶剂蒸馏掉一半，停止反应，冷却至室温。之后使用高速离心机用10000rad/min的速度离心，去除上清液，加入反应溶剂洗三遍，50℃真空干燥箱内真空干燥24小时。

步骤二：在25mL的圆底烧瓶中，装上冷凝管，加入反应溶剂或者混合溶液，加入步骤一中得到的聚合物核颗粒、3-丙烯酰胺基苯硼酸、多烯类功能单体、引发剂、链转移试剂等，超声1分钟，使得加入的试剂以及颗粒溶解形成均匀分散在溶液中，之后通氮气15分钟，加入磁力搅拌子，磁力搅拌子保持300rad/min速度。反应装置放在油浴锅中均匀缓慢加热，在30min内升温至60～140℃。维持60～80℃条件下反应4-48小时，停止反应，冷却至室温。之后使用高速离心机用10000rad/min的速度离心，去除上清液，加入反应溶剂洗三遍，50℃真空干燥箱内真空干燥24小时。

在步骤一中，所说的单烯类功能单体为丙烯酸、丙烯酸酯类、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、丙烯酰胺、4-乙烯吡啶或N-乙烯基吡咯烷酮。多烯类交联单体是N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、双甲基丙烯酸乙二醇酯、三甲基丙烯酸三羟甲基丙酯、二乙烯基苯，混合物中两者的摩尔比例为1:0.2至1:8。引发剂选偶氮类引发剂。反应溶液为乙腈、甲醇、甲苯、N,N-二甲基甲酰胺。含有单烯类功能单体，多烯类交联单体和引发剂的溶液中，单体的总摩尔数浓度为0.05～0.4mol/L，引发剂占单体总质量的0.5～10%，余量为反应溶剂。制备出来的单分散聚合物微球，其粒径为200nm～1μm，聚合物微球的PdI小于0.2。

在步骤二中，所说的多烯类交联单体是多烯类交联单体是N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、双甲基丙烯酸乙二醇酯、三甲基丙烯酸三羟甲基丙酯、二乙烯基苯，混合物中两者的摩尔比例为1:2～8，引发剂选偶氮类引发剂，链转移剂为二硫酯或三硫酯。反应溶液为乙腈、甲醇、甲苯、N,N-二甲基甲酰胺。含有单烯类功能单体，多烯类交联单体和引发剂的溶液中，单体的总摩尔数浓度为0.05～0.4mol/L，引发剂占单体总质量的0.5～10%，链转移剂与引发剂的摩尔比为1:0.1至1:10，余量为反应溶剂。制备出来的单分散聚合物微球，其粒径为200nm～5μm，聚合物微球的PdI小于0.2。

偶氮类引发剂如：偶氮二异丁腈，偶氮二异庚腈，偶氮二异丁脒盐酸盐，或偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐。

本发明具有如下优点：

1.本发明所述制备方法，采用蒸馏沉淀聚合与可逆加成-断裂链转移聚合结合，使得制备材料时间减少，反应重现性高，反应条件温和，反应效率高。

2.本发明制备核壳结构聚合物纳米粒子的粒径分布较窄，粒径单分散，且聚合物颗粒干净，不含有任何添加剂或者稳定剂。

3.聚合物纳米颗粒外层形成采用可逆加成-断裂链转移聚合，使得本发明核壳结构聚合物纳米粒子的表面含有大量硼酸功能基团，并具有更高的糖蛋白吸附容量。

4.通过本发明制备的硼酸功能化核壳结构聚合物纳米粒子；通过活性基团间的偶联，糖蛋白简便并且可逆的结合与粒子表面，实现糖蛋白的选择性富集和之后的质谱直接分析，开辟聚合物微球在蛋白质组学方面的新应用。

附图说明

图1为实施例1中制备的聚合物微球的透射电镜照片（图a）和动态光散射图（图b）。

图2单分散核壳结构聚合物纳米粒子的X射线光电子能谱。出现了B元素1s轨道的结合能谱图（190eV）。

图3单分散核壳结构聚合物纳米粒子对糖蛋白（辣根过氧化物酶，HRP）与非糖蛋白（牛血清白蛋白，BSA）混合溶液（质量比1：1）的富集效果图。a）原液；b）上清；c）富集产物。

具体实施方式

下面采用具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

实施例1

1.单分散核壳结构聚合物纳米粒子的制备

在150mL的圆底烧瓶中，加入80mL乙腈，加入105mg甲基丙烯酸（MAA）,755mgN，N'-亚甲基双丙烯酰胺（MBAA）以及17mg偶氮二异丁腈（AIBN），超声1分钟，使得加入的试剂溶解形成均匀的溶液，在烧瓶上装上Dean-Stark接收器，其上接冷凝管，之后通氮气15分钟，加入磁力搅拌子，磁力搅拌子保持300rad/min速度。反应装置放在油浴锅中均匀缓慢加热，反应器由室温在30分钟内升到115℃。维持115℃条件下，在2小时内将反应体系中的溶剂蒸馏掉一半，停止反应，冷却至室温。之后使用高速离心机用10000rad/min的速度离心，去除上清液，加入乙腈洗三遍，50℃真空干燥箱内真空干燥24小时，得到poly(MBAA-co-MAA)。在25mL的圆底烧瓶中，装上冷凝管，加入反应溶剂水-乙醇混合溶液（体积比为2:1）15mL，加入聚合物核颗粒400mg poly(MBAA-co-MAA)、100mg3-丙烯酰胺基苯硼酸(APBA)、300mg N，N'-亚甲基双丙烯酰胺（MBAA）、20mg偶氮二异丁腈（AIBN）、20mg2-氰丙基-2-基苯并二硫，超声1分钟，使得加入的试剂以及颗粒溶解形成均匀分散在溶剂中，之后通氮气15分钟，加入磁力搅拌子，磁力搅拌子保持300rad/min速度。反应装置放在油浴锅中均匀缓慢加热，在30min内升温至75℃。维持75℃条件下反应12小时，停止反应，冷却至室温。之后使用高速离心机用10000rad/min的速度离心，去除上清液，加入反应溶液洗三遍，50℃真空干燥箱内真空干燥24小时。

2.聚合物纳米粒子的表征

经过扫描电镜测试，结果如图1a)所示；通过动态光散射测试如图1b)所示，制得的聚合物颗粒平均水合半径粒径为432±3.6nm，得到颗粒的聚合物分散系数为0.163±0.016，聚合物颗粒的粒径分布均匀，单分散性好。

X射线光电子能谱如图2所示，在190mV出现了B元素的1s的结合能，证明了材料中硼酸基团的存在。

实施例2

将糖蛋白（辣根过氧化物酶，HRP）与非糖蛋白（牛血清白蛋白，BSA）按质量比1：1混合，并溶解于50mM碳酸氢铵缓冲溶液中（pH9.0），从而制得浓度为100ng/μL的蛋白混合溶液。

称取1mg在实施例1中制备的poly(MBAA-co-MAA)(MBAA-co-APBA)核壳结构聚合物纳米粒子，分散在200μL上述蛋白溶液中，在室温条件下孵育2小时，反应结束后离心，保留上清液待质谱鉴定。50mM碳酸氢铵缓冲溶液（pH9.0）洗涤材料数遍，离心弃上清。在分离得到的材料中加入20μL乙腈：水：三氟乙酸体积比为50:49:1的混合溶液，在室温下孵育1小时，离心取去富集产物。将蛋白原液、上述步骤中的上清液和富集产物进行MALDI-TOF MS鉴定。

将1μL待分析物与1μL SA基质（SA基质为：20mg芥子酸溶于体积比是乙腈：水：三氟乙酸=60:39:1的1ml溶液中）依次点于MALDI靶板上，待样品点干燥后进行质谱鉴定。MALDI-TOF MS实验是在UltraflexⅢTOF/TOF(Bruker Daltonics,Bremen,Germany)上进行，检测时采用线性正离子模式。

如图3所示，a图为未经过材料分离富集处理的原蛋白混合溶液，b图为上清液，c图为富集产物。如图3c所示，经核壳型聚合物纳米粒子富集之后，HRP信号强度较原液（图3a）显著提高；且无BSA非特异吸附，干扰蛋白仅存在于上清之中（图3b）。表明材料具有较好的糖蛋白富集能力及良好的亲水性。

Claims (10)

1.一种核壳结构的聚合物微球，其特征在于：

所述聚合物微球颗粒，首先以单烯类功能单体与多烯类交联单体通过聚合制得的聚合物粒子为核，然后通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合技术在核表面包裹3-丙烯酰胺基苯硼酸与多烯类交联单体，形成表面光滑且带有硼酸功能基团的核壳结构的聚合物纳米粒子。

2.按照权利要求1所述的聚合物微球，其特征在于：所述核颗粒的单烯类功能单体为丙烯酸、丙烯酸酯类、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯类、丙烯酰胺、4-乙烯吡啶或N-乙烯基吡咯烷酮；多烯类交联单体是N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、双甲基丙烯酸乙二醇酯、三甲基丙烯酸三羟甲基丙酯或二乙烯基苯。

3.按照权利要求1或2所述的聚合物微球，其特征在于：单烯类功能单体与多烯类功能单体的摩尔比为1:0.2至1:8。

4.按照权利要求1所述的聚合物微球，其特征在于：所述颗粒壳结构中单烯类功能单体为3-丙烯酰胺基苯硼酸，多烯类交联单体是N,N’-亚甲基双丙烯酰胺、双甲基丙烯酸乙二醇酯、三甲基丙烯酸三羟甲基丙酯或二乙烯基苯。

5.按照权利要求1或4所述的聚合物微球，其特征在于：壳的表面带有硼酸功能基团，其3-丙烯酰胺基苯硼酸在壳中质量分数范围是10%～80%。

6.按照权利要求1所述的聚合物微球，其特征在于：

所述聚合物微球为单分散核壳结构聚合物纳米粒子，粒径大小范围是100nm～10μm且根据缓冲溶液体系中pH值的变化（变化范围为pH：1～13）对带有邻二羟基的化合物具有很好富集与释放性能。

7.一种权利要求1所述聚合物微球的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）形成聚合物核：将单烯类功能单体、多烯类功能单体与引发剂混合加入反应器中，通氩气或者氮气5～60分钟；将反应器由室温在10～60分钟内升到沸腾状态，然后在1～4小时内将反应体系中的溶剂蒸馏掉一半，核心聚合物微球在溶剂蒸馏过程中形成；离心得到聚合物微球，之后依次使用反应溶剂洗涤微球中未反应物质至清洁，约2～5遍，在真空干燥箱中至恒重；

2）制备聚合物微粒的壳层：将得到的聚合物核颗粒、3-丙烯酰胺基苯硼酸、多烯类功能单体、引发剂、链转移试剂在反应溶剂体系中混合，在60-80℃下反应4-48小时；离心分离得到核壳结构聚合物纳米粒子，之后依次使用反应溶剂洗涤微球中未反应物质至清洁，约2～5遍，在真空干燥箱中至恒重。

8.按照权利要求7所述的制备方法，其特征在于：形成核时期，单烯类功能单体与多烯类功能单体的摩尔比为1:0.2至1:8，单体总摩尔数浓度为0.05-0.4mol/L;

形成核时期，其所用的溶剂为乙腈、甲醇、甲苯、N,N-二甲基甲酰胺中一种或二种及以上混合；

聚合引发体系为：所述引发剂为偶氮类引发剂，加入量占单体总质量的0.5-10%。

9.按照权利要求7所述的制备方法，其特征在于：形成核壳时期，体系中加入单烯类功能单体为3-丙烯酰胺基苯硼酸与多烯类功能单体的摩尔比为1:0.2至1:8，单体总摩尔数浓度为0.05-0.4mol/L;

形成核壳时期，聚合物核颗粒加入质量与形成壳的单体总质量比为1:0.1至1:10；

形成核壳时期，所述引发剂为偶氮类引发剂，加入量占形成壳的单体总质量的0.5～10%；所述的链转移剂为二硫酯或三硫酯，加入量与引发剂的摩尔比为1:0.1至1:10；

形成核壳时期，其所用的溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、甲苯、N,N-二甲基甲酰胺、水中一种或二种及以上混合溶液。

10.一种权利要求1所述聚合物微球可用于分离或富集（从简单样品混合物或者复杂样品中进行分离）带有1,2-顺式二醇结构的化合物，化合物为核酸、糖蛋白、糖肽中一种或二种以上混合。