CN105734013B - 目标细胞的多重捕获配体修饰的多层纳米粒柔性支架及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种目标细胞的多重捕获配体修饰的多层纳米粒柔性支架及其应用，其以活性大分子为交联剂，在载体基质上构建多层纳米粒子的粗糙表面，再在该粗糙表面上化学连接活性大分子，获得了多层纳米粒柔性支架，然后在该多层纳米粒柔性支架上固定多重捕获配体，得到连接有多重捕获配体的多层纳米粒柔性支架。本发明基于大分子交联法实现了简单、快速、可控的纳米粒有序多层柔性支架组装，该支架既具有纳米粒结构，又具有柔性结构，同时表现出了高粗糙度的优势，对于目标细胞，该支架表现出了极低的非特异性吸附，修饰了多价适体的支架具有极高特异性捕获效率，可制备成体外流通捕获系统应用于体外循环捕获体内目标细胞方面。

Description

目标细胞的多重捕获配体修饰的多层纳米粒柔性支架及其 应用

技术领域

本发明涉及一种用于循序捕获体内目标细胞的支架、包含该支架的体外流通捕获系统及其应用，尤其涉及一种用于循环捕获体内目标细胞的多重捕获配体修饰的多层纳米粒柔性支架及其应用，属于单细胞捕获技术。

背景技术

癌症致死的主要原因是部分肿瘤细胞获得侵袭能力并造成远处转移。肿瘤细胞脱落、侵袭并进入血液循环是实现肿瘤转移的最初阶段，并为最终形成肿瘤转移病灶提供了可能。理论上外周血中的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC)与肿瘤的血行转移有直接关系，因此癌症患者外周血液中的CTC被视作肿瘤诊断十分理想的生物标志物。然而CTC在外周血中的数量稀少，在1mL全血中，存在大量的血细胞，相应的白细胞和红细胞分别高达4.0-10.0×10⁶和5.0-6.0×10⁹个，而CTC平均可能只有1个，因此特异性的、高效的细胞富集是CTC检测的关键问题。

CTC的富集方法主要有两类，以形态学为基础的富集和以CTC表面表达的特异性膜蛋白为识别受体的分离富集。前者是借助细胞的物理特性进行分离，典型的方法即为密度梯度法，如Oncoquick法、RosetteSep^TM分离法，这类富集均不具有特异性。对于以CTC表面表达的特异性膜蛋白为识别受体的分离富集方法，是将识别受体的捕获配体固载于载体上，利用捕获配体与特异性膜蛋白受体的相互作用，实现CTC的特异性识别和分离富集。特异性配体主要使用的是抗体，然而无论是阳性富集(如最具代表性的CellSearch方法所用的抗-EpCAM抗体)，还是阴性分选(如抗CD45抗体，或抗CD61抗体)，均不能实现特定CTC的捕获。对于特定CTC捕获的配体，当前有大量的研究者开始关注适体。适体具有亲和力高、特异性强、分子范围广、筛选制备方便、稳定性好、修饰灵活、分子量小以及无免疫原性的特点，使得适体具有代替抗体成为“化学抗体”对特定CTC进行捕获的潜能。无论对于抗体还是适体，在提高CTC特异性捕获的同时，更为关注的是提高捕获效率。当前主要采用三类手段提高捕获效率，即微流控芯片、提高固载配体的载体基质粗糙度、和多价配体键合。

对于微流控芯片技术，通过改变细胞液的流体方式和减小流体通道的截面积以增加CTC表面受体与固载于微通道中的配体之间的键合碰撞几率。在特异性识别的捕获体，即CTC-膜蛋白(受体)----配体-载体基质中，膜蛋白受体和配体分子的尺度均远远小于微米级的CTC以及更大尺度的载体基质，这种具有大尺度效应的CTC和载体基质均显著增加了配体识别受体的空间位阻。若在载体基质表面构造一定程度的粗糙度，即在表面构建众多支架，将形成高效的捕获体CTC-受体----配体-支架-载体基质，支架将减小载体基质的空间位阻，这将是提高捕获效率的另一种有效手段。

事实上在微流控芯片的微通道中增加通道粗糙度即构建支架，是当前提高CTC捕获效率最为关注的研究领域。在微流控芯片中，相对于未粗糙化的通道，氢氟酸腐蚀基片表面可以提高捕获效率10％左右，而利用光刻蚀法在载体基质上产生“微墩”型的支架，捕获效率获得了进一步提高。相对于“微墩”型的微米级甚至更大尺度的支架，基于纳米粒组装而构建的粗糙表面，捕获效率或者捕获特异性明显提高。对于基于生物素-亲和素相互作用组装的单层金纳米粒的载体基质，其表面具有纳米粒结构的粗糙度，载体基质的空间位阻较小，同时，由于多价适体金纳米粒所具有的强捕获力，使捕获效率明显提高。对于化学沉积法制备的基于金纳米粒的微纳结构表面，表面粗糙度明显增加。利用这种高粗糙表面固载的适配体，对血浆中的目标细胞表现出了良好的捕获特异性。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种用于循环捕获体内目标细胞的多重捕获配体修饰的多层纳米粒柔性支架及其应用，该支架能够快速可控的实现纳米粒有序多层柔性支架的组装，且该支架不仅具有纳米粒结构还具有柔性结构，同时表现出了高粗糙度的优势，具有较高的特异性捕获效率，可应用于体外流通捕获系统中。

本发明的技术方案是：

本发明公开了一种多层纳米粒柔性支架，所述多层纳米粒柔性支架的第一层由固载于载体基质表面上的纳米粒子层所构成，然后在该柔性支架第一层的纳米粒子层上固定大分子层，并依次重复纳米粒子层的固定和所述大分子层的固定来实现纳米粒子的多层组装，构成所述多层纳米粒柔性支架。

其进一步的技术方案是：

所述多层纳米粒柔性支架第一层的纳米粒子层固载于所述载体基质表面上的方式为下述两种方式的中一种：直接在载体基质表面沉积一层纳米粒子层，该沉积方式可采用目前现有技术中常见的化学沉积法、电沉积法等；先将大分子固载于载体基质上形成大分子层，再将纳米粒子固定在所述大分子层上构成纳米粒子层。

所述大分子为聚合物、蛋白质、多肽、核酸、寡核苷酸和多糖中的一种，且所述大分子上具有活性基团；所述纳米粒子上具有活性基团，且该纳米粒子上的活性基团与所述大分子上的活性基团之间能够产生化学作用力；所述载体基质为毛细管状结构和平板状结构的载体基质，且该载体基质的材质为普通玻璃、石英玻璃和高分子聚合物中的一种；且所述多层纳米粒柔性支架的层数为2-30层。

本发明还公开了一种目标细胞的多重捕获配体修饰的上述多层纳米粒柔性支架，其是由多重捕获配体通过下述两种方式中的一种固定于所述多层纳米粒柔性支架上所构成的：在所述多层纳米粒柔性支架上直接固定多重捕获配体的方式；先在所述多层纳米粒柔性支架上直接固定大分子，再在所固定的大分子上固定多重捕获配体的方式。

其进一步的技术方案是：

所述捕获配体为抗体和核酸适体中的一种，所述大分子为聚合物、蛋白质、多肽、核酸、寡核苷酸和多糖中的一种。

本发明还公开了一种上述目标细胞的多重捕获配体修饰的多层纳米粒柔性支架的应用，多重捕获配体修饰的多层纳米粒柔性支架对体内循环系统中目标细胞的特异性捕获。

本发明还公开了一种包括上述目标细胞的多重捕获配体修饰的多层纳米粒柔性支架的体外流通捕获系统，其包括捕获管、恒温水导管和抗凝剂注入管；其中所述捕获管包括毛细管载体基质、固载于所述毛细管载体基质上的多层纳米粒柔性支架和固定于该多层纳米粒柔性支架上的捕获配体；所述捕获配体为抗体或核酸适配体中的一种。

本发明还公开了一种上述体外流通捕获系统的应用，从血管将血液引流进入所述体外流通捕获系统，经该体外流通捕获系统处理后血液流回血管内，以此循环构成体外循环捕获体内目标细胞的循环系统。

其进一步的技术方案是：

血液流通捕获的方式为血液分流捕获和血液全流捕获中的一种，其中所述血液全流捕获通过体内全结扎引流血管而将血液引流入捕获系统，其中所述血液分流捕获通过体内部分结扎引流血管或体内全结扎引流血管而体外采用血液分流管的方法实现。

经该体外流通捕获系统所捕获的目标细胞在细胞学、免疫学、生物化学和核酸检测中的应用。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：本发明以活性大分子为交联剂，在载体基质上构建多层纳米粒子的粗糙表面，再在该粗糙表面上化学连接活性大分子，获得了多层纳米粒柔性支架，然后在该多层纳米粒柔性支架上固定捕获配体，成功组装得到了连接有捕获配体的多层纳米粒柔性支架。本发明基于大分子交联法实现了简单、快速、可控的纳米粒有序多层柔性支架组装，该支架既具有纳米粒结构，又具有柔性结构，同时表现出了高粗糙度的优势，对于目标细胞，该支架表现出了极低的非特异性吸附，修饰了多价适体的支架具有极高特异性捕获效率，可制备成体外流通捕获系统应用于体外循环捕获体内目标细胞方面。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1中a是Apt-FTLS特异性捕获CTC后的结构示意图；b是Apt-GOLS特异性捕获CTC后的结构示意图；c是Apt-FTLS特异性捕获Ramos细胞(亮点)后的荧光图；d是Apt-GOLS特异性捕获Ramos细胞(亮点)后的荧光图；e是Apt-FTLS和Apt-GOLS分别特异性捕获Ramos细胞的数目对比图(mean±SD,n＝3)；

图2中A是FOLS的电镜图(SEM)；B是FOLS的原子力显微镜图(AFM)；C和D是FTLS的原子力显微镜图(AFM)；

图3中a是Apt-GOLS特异性捕获CTC后的结构示意图；b是Apt-FOLS特异性捕获CTC后的结构示意图；c是Apt-GOLS特异性捕获Ramos细胞(亮点)后的荧光图；d是Apt-FOLS特异性捕获Ramos细胞(亮点)后的荧光图；e是Apt-GOLS和Apt-FOLS分别特异性捕获Ramos细胞的数目对比图(mean±SD,n＝3)；

图4中a是Apt-FOLS特异性捕获Ramos细胞(亮点)后的荧光图；b是Apt-FTLS特异性捕获Ramos细胞(亮点)后的荧光图；c是Apt-FOLS和Apt-FTLS分别特异性捕获Ramos细胞的数目对比图(mean±SD,n＝3)；

图5中a是Apt-FOLS和Apt-FTLS特异性捕获Ramos细胞(亮点)后的荧光图，unApt-FOLS和unApt-FTLS非特异性吸附Ramos细胞(亮点)后的荧光图；b是Apt-FOLS和Apt-FTLS特异性捕获Ramos细胞，unApt-FOLS和unApt-FTLS非特异性吸附Ramos细胞数目对比图(mean±SD,n＝3)；c的左侧是所述支架和载体基质非特异性吸附Ramos细胞的数目柱状对比图；右侧是所述unApt和Apt非特异吸附Ramos细胞的吸附率(mean±SD,n＝3)；

图6是HL-60和血细胞对Apt-FOLS捕获目标细胞效率的影响，其中左侧是待测样本(R&H、R&B)中Ramos目标细胞的捕获量与对照样本(Ram)中目标细胞捕获量的捕获效率对比图(mean±SD,n＝3)，右侧是待测样本(R&H、R&B)中干扰细胞的非特异性捕获量占总捕获量的比率对比图(mean±SD,n＝3)；

图7是血液中Apt-FTLS对目标细胞的捕获效率，其中左侧是在血浆和全血中特异性捕获Ramos细胞和非特异性捕获血细胞的数目对比图(mean±SD,n＝3)，右侧是在血浆和全血中特异性捕获目标细胞的捕获率(mean±SD,n＝3)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

具体实施例1：SiO₂纳米粒的制备及其硅烷化

在二颈瓶中依次加入恒温至40℃的无水乙醇25mL，氨水1.5mL，水0.5mL，于40℃恒温水浴中、500rpm/min搅拌下迅速加入0.75mLTEOS(正硅酸乙酯)，反应7h，再加入0.5mLTEOS，继续反应15h，停止反应。高速离心，弃上清，沉淀依次用无水乙醇和三蒸水洗涤，最后复溶于25mL三蒸水中备用，得SiO₂纳米粒溶液(11mg/mL)。

以19mL无水乙醇、0.3mLAPTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)和0.3mL三蒸去离子水搅拌5min制得硅烷化水解液。取11mg/mL SiO₂纳米粒溶液2mL，离心20min，复溶于1mL无水乙醇中，加入硅烷水解液，超声5-10min，常温搅拌反应5h，超声5min，无水乙醇洗涤3次。沉淀于40℃烘干，得硅烷化的SiO₂纳米粒，备用。临用时用三蒸去离子水配制2.2mg/mL的纳米粒水溶液，即硅烷化的SiO₂纳米粒溶液，待用。

具体实施例2：柔性纳米粒支架的制备及其适体的连接

硅烷化载体基质的制备：将30％双氧水与98％的硫酸按3:7体积比混合制成洗液。将载玻片裁成25.4×19mm²大小的矩形玻璃片作为载体基质。用水和无水乙醇分别洗涤载体基质，吹干，放入洗液，80～100℃下加热1小时，自然冷却，用三蒸去离子水洗涤载体基质，冷风吹干。载体基质于2％APTES的无水乙醇溶液中反应18h，用三蒸去离子水冲洗玻片，吹干，120℃烘6h，即制得表面偶联氨基的硅烷化载体基质。

活化PAA溶液制备：取聚丙烯酸(PAA，25wt％水溶液，Mw＝240000)100μL于10mL的单颈瓶中，加入5mL的三蒸去离子水，摇匀，加入2mL的0.8mg/mL的EDC·HCL(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)和2mL的2.2mg/mL的sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)，摇匀，37℃水浴活化60min，使用三蒸去离子水定容至50mL，即得0.5mg/mL的活化PAA溶液，即0.5mg/mL PAA-NHS溶液。

柔性单层纳米粒支架的制备及其适体的连接：将硅烷化载体基质置于5mL PAA-NHS溶液，37℃下反应1h，收集反应后的PAA溶液；三蒸去离子水洗涤载体基质2次，N₂吹干，置于5mL硅烷化SiO₂纳米粒溶液，在37℃下反应3h，收集反应后的SiO₂纳米粒溶液。三蒸去离子水洗涤载体基质2次，N₂吹干，置于5mL PAA-NHS溶液，在37℃下反应1h，收集反应后的PAA-NHS溶液。三蒸去离子水洗涤载体基质2次，N2吹干，向3mL的BB溶液中加入10μL的用BB溶液配制的TD05适配体(序列为5’-CACCGGGAGGATAGTTCGGTGGCT GTTCAGGGTCTCCTCCCGGTGTTTTTAAGGAGCAGCGTGGAGGATA-NH₂-3’)溶液(5×104μmol/L)，在37℃下反应1h，三蒸去离子水洗涤2次，用3mL 0.1mol/mL甘氨酸的PBS溶液封蔽，载体基质用N2吹干，即得连接了适体的单层纳米粒柔性支架(Apt-FOLS)，作为实验组，备用。除了TD05适配体没有被使用以外，其它所有过程均平行实验，即得未连接适体的单层纳米粒柔性支架(unApt-FOLS)，作为对照组，备用。其中BB溶液为结合缓冲液：称取0.025g tRNA、0.25g牛血清白蛋白(BSA)，溶解于250mLWB溶液中，分装冷冻保存，即得0.01M pH为7.4的结合缓冲液；其中WB溶液为洗涤缓冲液：称取1.237g葡萄糖、0.254g MgCl₂·6H₂O，溶解于250mL灭菌PBS中，分装冷冻保存，即得0.01M pH为7.4的洗涤缓冲液；其中PBS为磷酸盐缓冲液：分别称取4.003g NaCl、0.1005gKCl、1.7908g Na₂HPO₄·12H₂O、和0.1760g KH₂PO₄，溶解于500mL超纯水中，调节pH至7.4，用高压蒸汽灭菌半小时，灭菌后分装冷冻保存，即得0.01M pH为7.4的磷酸盐缓冲液。

柔性三层纳米粒支架的制备及其适体的连接：按Apt-FOLS和FOLS柔性单层纳米粒支架的制备方法，重复进行一次PAA-NHS和硅烷化SiO₂纳米粒的组装，其它实验过程完全相同，即得修饰了适体的三层纳米粒柔性支架(Apt-FTLS)和未修饰适体的三层纳米粒柔性支架(unApt-FTLS)。

具体实施例3：细胞培养与细胞捕获

细胞培养与染色：对于Ramos和HL-60细胞，在配制的培养液(以RPMI-1640培养基配制培养液，其中FBS含15％，亲霉素-链霉素为100U/mL)中，37℃下5％CO₂饱和湿度进行培养。Ramos细胞用橙红色的DiI染料为标记液，而HL-60细胞用绿色的DiO染料标记液。以无血清培养基悬浮细胞，相应细胞密度为1.0×10⁶个/mL，每1mL细胞悬液加入5μL细胞标记液，混匀，37℃孵育10-20分钟，1500rpm 5分钟离心，用37℃培养基轻轻重悬细胞。用5mL洗涤缓冲液WB重复2次洗涤，最后将其悬浮于6mL的BB中，即得1.0×10⁶个/mL染色的细胞悬液。其中DiI和DiO溶液为采用DMSO作溶剂，分别配制含DiI和DiO染料浓度均为1mM的溶液。

细胞捕获：将六孔板置于固载了纳米粒支架的载体基质上，每个孔加1mL染色的细胞悬液，放置培养箱中37℃孵育1.5-2小时，每30分钟轻轻振摇一次，反应结束后用37℃WB洗涤2次，干燥后置于荧光显微镜下成像，并计数，整个过程避光操作。

具体实施例4：MTT实验

3mL硅烷化的SiO₂纳米粒溶液(2.2mg/mL)和6mL PAA-NHS溶液(0.5mg/mL)，混匀，37℃反应3小时，离心，WB洗涤2次，沉淀复溶于3mL BB中，即得PAA交联的SiO₂纳米粒溶液(2.2mg/mL)，备用，以此考察支架的细胞毒性。收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度至7.0×10⁴个/mL，48孔板中设对照组和4个实验组，每组设5个孔，每孔中加100μL细胞悬液，正常培养24小时。除对照组外，实验组分别加10uL-40uL的纳米粒溶液，每孔加60μL培养液，加入BB调节每孔溶液体积至120μL。置于培养箱中，37℃孵育12小时，去除培养液。加10μL MTT溶液(5mg/mL)，在不含血清的培养基中让MTT反应4小时。去除反应液，每孔加入100μLDMSO，10min后，在酶标仪中检测490nm处的吸光度。

具体实施例的实验结果与表征如下。

一、表面形态特征

本具体实施例中利用扫描电镜(SEM)表征了所获得的柔性单层纳米粒支架(FOLS)的纳米粒形貌、粒径大小以及载体基质表面形态(图2A)，可以发现，支架中SiO₂纳米粒子形态均匀，其粒径约为100nm，载体基质表面也出现了功能化纹路。利用原子力显微镜(AFM)表征了柔性单层和柔性三层纳米粒支架的结构特征(图2B-D)：首先在FOLS支架(图2B)中明显发现了组装的单层纳米粒，并表现出了有序排列。同时在FTLS支架(图2C和D)中，不但发现了同时组装上的第二层和第三层纳米粒，也发现了纳米粒在该两层中的有序排列。无论在单层还是在三层支架上，纳米粒均保持了球形外貌特征，并具有均一的粒径，表明PAA交联组装过程并未明显改变纳米粒子的形貌特征和粒径均一特征。综上所述，本具体实施例组装的支架具有明显的纳米粒结构，该支架中并未发现像化学沉积法获得高粗糙度表面时所出现的纳米粒融合和纳米粒结构消失的现象。

二、所述支架的柔性结构和捕获能力

为了说明构建的支架FTLS的柔性结构，本具体实施例考察了不包含基质载体的情况下，PAA交联纳米粒子的粒径。将硅烷化的SiO₂纳米粒在水溶液中与活化了羧基的PAA进行交联，组装成为更大的纳米粒子。结果表明，未组装纳米粒的水合平均粒径为110nm，而组装的纳米粒粒径明显增大，平均水合粒径为404.7nm，约为前者的3.6倍。预示着在组装纳米粒子的径向分布上，大约组装了3个SiO₂纳米粒，并且它们之间存在一定的间隔，这应该是由于相同电荷的SiO₂纳米粒之间强烈的静电排斥作用所导致的。表明利用如此大分子量(Mw＝240,000)的PAA能够实现SiO₂纳米粒的交联，并且刚性粒子间存在一定的间隔，即柔性链，使得组装纳米粒的连接体具有柔性结构。相对于纳米粒在水溶液中的无序组装，在载体基质上利用PAA交联进行的纳米粒组装，它将受到两方面因素的制约。第一，交联剂PAA首先是被固载在载体基质上的；第二，组装纳米粒的载体基质具有较大的空间位阻。前者实现了纳米粒的有序、可控组装，而后者提高了多层纳米粒支架的柔性程度，组装原理参见图1。

从图1所示，无论对于第一层纳米粒交联、还是同时对第二层和第三层纳米粒的交联，交联剂PAA均必须先行固定，以此为约束条件进行有序组装，而不像溶液中交联纳米粒时交联剂PAA是分散在溶液中的，即前者为被固定的状态，后者为无序的自由状态。由于宏观尺度的载体基质极大的空间位阻，在支架中被组装上的纳米粒之间将有更大的间隔，即柔性程度更为明显。这预示着在载体基质上的有序交联不可能像溶液中的无序组装那样，即一个被固定的PAA大分子链上不可能同时组装三层纳米粒。事实上，第一次仅仅交联了一层纳米粒，第二次交联时同时交联了两层纳米粒(参见图1和图2)。

当在载体基质上第一次交联时，交联剂被直接固定在载体基质上，载体基质极大的空间位阻使得仅能组装上一层纳米粒，被交联的纳米粒与载体基质间表现出了较大的间隔。然而，在第二次交联时PAA即就是被固定在第一层纳米粒上，而不是宏观尺度的载体基质上，此时的空间位阻明显减小，能够同时交联两层纳米粒。当然，纳米粒层间的间隔必然也减小。预示着本具体实施例构建的支架中三层纳米粒间可能也表现出一定程度的柔性。事实上，从PAA交联的柔性支架的AFM图(图2B和D)可以发现，无论在单层的支架FOLS，还是在三层的支架FTLS中，纳米粒子边缘部分均存在明显的“波纹”(如图中黑色圈所示)，预示着聚合物PAA被交联在纳米粒的表面。

为了考察本具体实施例构建的三层纳米粒支架的柔性结构对细胞捕获能力的提高，应该构建一个具有刚性结构的三层纳米粒支架作为对照。然而由于纳米粒之间的空间位阻和纳米粒的融合，这类支架的构建是极其困难的。因此，本文将以一层纳米粒支架进行研究(参见图3)。将环氧化的SiO₂纳米粒直接固载在氨基化的载体基质上。与单层纳米粒柔性支架(FOLS，图3b)比较，此时的SiO₂纳米粒与载体基质间没有一个柔性的间隔,即为具有刚性结构的单层纳米粒支架(GOLS，图3a)。在两类支架上均固载上适体，但是它们对目标细胞的捕获效率却存在较大的差异(图3c和d)。相对于GOLS，FOLS的捕获效率提高了9倍(图3e)。对于FOLS，多重适体被化学连接在PAA上(图3b)。对于GOLS，多重适体被直接地化学连接在纳米粒子上(图3a)。由于它们均是多重适体，因此我们推测显著的捕获效率差异应该是柔性支架的贡献。由于柔性支架具有更小的空间位阻，使得固定于支架上的适体能够更为自由地弯曲和折叠，以形成识别受体所需要的三维空间结构；同时支架的柔性也赋予了自身具有一定程度的弯曲能力，使得固定于同一支架上的多个适体能够同时与同一细胞上的多个膜蛋白受体多价键合，支架对细胞的捕获力将显著增强。相对于单层纳米粒支架，由本具体实施例构建的三层纳米粒柔性支架应该具有更高的捕获效率。事实上FTLS的捕获效率是单层刚性支架GOLS的17倍。

三、粗糙度增加和捕获能力增强

载体基质表面的粗糙度增加是提高流动细胞捕获效率的另一重要手段。为了考察粗糙度对捕获效率的影响，比较研究单层和三层纳米粒柔性支架的捕获效率(图4a和b)。可以发现，Apt-FTLS细胞捕获量约为Apt-FOLS的1.9倍(图4c)。相对于柔性单层支架FOLS，FTLS的三层纳米粒的柔性空间结构，表现出了更高的粗糙度；在对流动细胞进行捕获时，载体基质对细胞捕获的空间位阻更小，细胞上的受体与固载于支架上的配体之间的键合碰撞几率变大，有利于形成配体-受体binding，从而增加捕获效率。

四、特异性和非特异性捕获

当在支架上修饰适体以后，由于适体对目标细胞上的特异性膜蛋白受体能够特异性地识别，形成配体-受体键合，从而特异性捕获目标细胞。以刚性的单层纳米粒支架GOLS为对照，考察了本具体实施例所构建的三层纳米粒支架FTLS上修饰适体对细胞的特异性捕获(图5a和b)，同时以未修饰适体的支架考察了支架的非特异性吸附(图5a和c)。相对于修饰了适体的Apt-GOLS，Apt-FTLS特异性捕获效率增加显著(图5a和b)。对目标细胞，Apt-FTLS是Apt-GOLS的17倍(图5b)。捕获效率的极大提高当然是源自于Apt-FTLS的高粗糙度、柔性结构和多价受体-配体键合共同作用的结果。

由于本具体实施例构建的Apt-FTLS是由多重适体和三层纳米粒柔性支架组成，细胞的非特异性捕获应该也是来自于这两个部分。由于适体的非特异性不属于本文的研究范围，因此我们仅仅考察了支架(柔性三层unApt-FTLS)的非特异性吸附(图5a和c)。相对于刚性的unApt-GOLS，unApt-FTLS的粗糙度增加明显，显然细胞与高粗糙度的载体表面的碰撞几率也会显著增加，相应的非特异性吸附也应该明显增加。事实上unApt-FTLS的绝对量仅仅有极小的增加(图5c中左侧)。但与特异性捕获比较，支架unApt-FTLS的非特异性吸附相对比率却没有增加，反而明显降低，仅为unApt-GOLS的11.1％(图5c右侧)。这种现象产生的原因，主要应该是由支架中纳米粒子的表面电荷和支架的亲水性所决定的。

在unApt-GOLS中，硅烷化的SiO₂纳米粒子表面Zeta电位为弱正电荷(+3.15mV)，而在unApt-FTLS中，由于SiO₂纳米粒子通过PAA进行了粒子间交联，PAA固载在粒子表面，支架中的纳米粒子表现出了强的负电性，相应的表面Zeta电位为-18.14mV。对于表面电荷通常为负的目标细胞，即使在高的细胞碰撞几率的条件下，由于电荷的排斥作用，也不会明显增加支架unApt-FTLS的非特异性吸附。另一方面，unApt-FTLS是由具有良好亲水性的SiO₂纳米粒子和聚电解质PAA所组装，在对流动细胞捕获的水溶液介质中，它将表现出极强的亲水性，与目标细胞的膜蛋白不会发生疏水互相作用。事实上，在用化学沉积或者电沉积的金纳米粒载体基质上，常常会由于金-巯基共价键和疏水相互作用，极易导致目标细胞的非特异性捕获。

五、干扰细胞对捕获效率的影响

由于外周血中存在大量的血细胞，本具体实施例中将考查血细胞对CTC捕获效率的影响，同时也将考查所用TD05适体在适体筛选时所采用的对照细胞HL-60对捕获效率的影响。本具体实施例中采用的全血细胞为十人份混合全血细胞，由江苏省苏州市红十字中心血站提供。在结合缓冲液BB中，加入5.0×10⁵个目标细胞Ramos细胞作为对照样本(Ram)，考查本具体实施例构建的Apt-FTLS对相同量的Ramos细胞和血细胞所组成的待测样本(R&B)的捕获效率，同时也考查相同量的Ramos细胞和HL-60细胞所构成的待测样本(R&H)的捕获效率。以待测样本中Ramos目标细胞的捕获量与对照样本中捕获量的比率表征在干扰细胞存在下的相对特异性捕获效率(图6左侧)。结果表明，在不同干扰细胞存在下，Apt-FTLS对目标细胞的捕获效率是存在差异的；与无任何干扰的对照样本Ram比较，在对照细胞HL-60干扰之下，目标细胞Ramos的相对捕获效率降低为78％；在血细胞干扰之下，相对捕获效率却为84％，预示着血细胞的干扰程度与适体筛选时所选用的对照细胞HL-60的干扰能力没有显著差异。待测样本中干扰细胞的非特异性捕获量占总捕获量的比率即为非特异性捕获率(图6右侧)。该比率即可表征干扰细胞对目标细胞特异性捕获的干扰程度。从图6中发现，HL-60和血细胞对Apt-FTLS的特异性捕获的干扰程度确实没有明显差异，前者为7.7％，后者为10.1％。上述研究说明，血细胞对在血液中循环肿瘤细胞的特异性捕获效率的影响是不显著的。

六、血液中目标细胞的捕获

血液由血细胞和血浆组成，对于血液中CTC的捕获，除了血细胞的干扰之外，还可能存在其它生物基质的干扰。因此在实验样本中将以血浆代替前述研究中的缓冲液，考查血液中Apt-FTLS对目标细胞的捕获效率(图7)，其中的血浆为十人份混合血浆(由江苏省苏州市红十字中心血站提供)。从图7可以发现，与缓冲液中的细胞捕获比较，在血液中无论对于目标细胞的特异性捕获，还是对干扰细胞全血细胞的非特异性捕获，其捕获量均显著降低(图7左侧)，对于特异性捕获量降低了87.0％，非特异性捕获量降低了83.7％。由此表明，血液中的血浆组分对特异性和非特异性捕获均构成了严重干扰，这种干扰是没有选择性。事实上当从同一样本中特异性捕获量与总捕获量的比率也能说明此干扰的非选择性(图7右侧)，缓冲液中该比率为89.1％，血液中为84.0％。

为了更清楚地说明血浆对特异性捕获的影响，还设计了一组实验：对照样本用结合缓冲液作为介质，而试验样本以血浆为介质，两类样本中均仅含相同量的目标细胞Ramos。在这种没有干扰细胞存在的情况下，后者的特异性捕获量仅仅为前者的22.3％。由此进一步说明了血浆对基于Apt-FTLS的特异性细胞捕获的影响是非常明显的，而前述研究已经证明了仅仅只有支架的情况下，支架对细胞的非特异性吸附是不明显的，由此表明特异性细胞捕获效率显著降低主要是血浆组分严重影响了修饰在支架上的适体对目标细胞的识别。

采用本具体实施例中制备所得的多重捕获配体修饰的三层纳米粒柔性支架可构成一种体外流通捕获系统，其包括捕获管、恒温水导管和抗凝剂注入管，其中所述捕获管包括毛细管载体基质、固载于所述毛细管载体基质上的多层纳米粒柔性支架和固定于该多层纳米粒柔性支架上的捕获配体；本具体实施例中的捕获配体采用TD05。使用时，从血管将血液引流进入所述体外流通捕获系统，经该体外流通捕获系统处理后血液流回血管内，以此循环构成体外循环捕获体内目标细胞的循环系统。血液流通捕获的方式为血液分流捕获和血液全流捕获中的一种，其中所述血液分流捕获方式有两种：一种是通过在体内部分结扎引流血管，使引流血管中的部分血液引流入体外捕获系统中的捕获管进行血液分流捕获；第二种是通过在体内将引流血管全部进行结扎将血液引流至体外，且在体外采用血液分流管将部分血液回流入血管，其余部分的血液引流进入体外捕获系统的捕获管中进行进行血液分流捕获。其中血液全流捕获的方式是，将引流血管在体内全部结扎，使血管中的血液全部引流进入体外捕获系统中的捕获管进行血液全流捕获。经该体外流通捕获系统所捕获的目标细胞在细胞学、免疫学、生物化学和核酸检测中的应用。

本具体实施例以阴离子聚电解质PAA为交联剂，硅烷化的玻璃基片为载体基质，组装了三层SiO₂纳米粒的粗糙表面，并再将PAA化学连接到粗糙表面上，即获得了三层纳米粒柔性支架FTLS。据此将TD05适体化学接连到FTLS的PAA上，成功组装了多重配体修饰的柔性支架Apt-FTLS。基于SEM和AFM表征，表明支架中纳米粒子均保持了球形外貌特征，且粒径均匀，约为100nm。同时，支架中的纳米粒层状结构明显，在第一次交联后，仅仅组装上了一层纳米粒，然而在第二次交联时，却一次同时组装上了两层纳米粒。与单层纳米粒刚性支架GOLS比较，对于修饰适体后的特异性捕获，Apt-FTLS的捕获效率显著增加，为Apt-GOLS的17倍；对于未修饰适体的非特异性吸附，当用吸附量占特异性捕获量的比率表征时，unApt-FTLS仅为unApt-GOLS的11.1％。这些显著的优势主要是由具有纳米粒结构的支架所表现出的柔性结构和高粗糙度确定的。随着载体基质粗糙度的提高，特异性捕获效率随之提高，三层纳米粒柔性支架是单层支架的1.9倍；而支架的柔性结构对提高特异性捕获率的贡献更加明显，单层纳米粒柔性支架是单层刚性支架的9倍。对于本具体实施例构建的Apt-FTLS，干扰细胞对它的特异性捕获影响是不显著的；与无任何干扰的对照组比较，分别存在对照细胞HL-60和血细胞的情况下，捕获效率降低到了78％和84％。基于PAA交联法本具体实施例实现了简单、快速、可控的纳米粒有序多层柔性支架组装，该支架既具有纳米粒结构，又具有柔性结构，同时表现出了高粗糙度的优势。对于目标细胞，该支架表现出了极低的非特异性吸附，修饰了多价适体的支架具有极高特异性捕获效率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种多层纳米粒柔性支架，其特征在于，包括氨基化载体基质和氨基化SiO₂纳米粒，其中所述氨基化载体基质为由含氨基的硅烷化试剂进行氨基硅烷化后在表面形成有多氨基的普通玻璃、石英玻璃和高分子聚合物中的一种，其中所述氨基化SiO₂纳米粒为由含氨基的硅烷化试剂进行氨基硅烷化后在表面形成有多氨基的SiO₂纳米粒；所述氨基化载体基质的表面通过酰胺化反应与游离的多羧基大分子形成酰胺键将该游离的多羧基大分子固载于氨基化载体基质表面形成固定大分子接枝链，所述游离的多羧基大分子为多羧基聚合物，且该游离的多羧基大分子上的羧基为经羧基活化试剂活化后的羧基；所述氨基化SiO₂纳米粒的表面通过酰胺化反应与固定大分子接枝链的多羧基大分子形成酰胺键将该氨基化SiO₂纳米粒固载于固定大分子接枝链上形成纳米粒子层；所述纳米粒子层的氨基化SiO₂纳米粒通过酰胺化反应与游离多羧基大分子形成酰胺键将游离的多羧基大分子固载于纳米粒子层的表面，再次形成固定大分子接枝链；依次重复纳米粒子层的固载和固定大分子接枝链的固载形成依次重复的纳米粒子层和固定大分子接枝链，构成所述多层纳米粒柔性支架。

2.根据权利要求1所述的多层纳米粒柔性支架，其特征在于，所述氨基化载体基质为毛细管状结构和平板状结构的氨基化载体基质，且所述多层纳米粒柔性支架的层数为单层或2-30层。

3.根据权利要求1所述的多层纳米粒柔性支架，其特征在于，所述含氨基的硅烷化试剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷，所述羧基活化试剂为EDC·HCl和sulfo-NHS。

4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的多层纳米粒柔性支架，其特征在于，所述多层纳米粒柔性支架是通过包括下述步骤的制备方法制备得到的：

S1：氨基化SiO₂纳米粒的制备：采用正硅酸乙酯、氨水、无水乙醇和水制备得到SiO₂颗粒，并将该SiO₂颗粒复溶于水中形成SiO₂纳米粒溶液；使用含氨基的硅烷化试剂、无水乙醇和水制备得到硅烷化水解液，将所述SiO₂纳米粒溶液加入所述硅烷化水解液中常温超声反应后进行分离干燥得到氨基化SiO₂纳米粒；

S2：氨基化载体基质的制备：将载体基质经水清洗、无水乙醇清洗、双氧水-硫酸洗液加热清洗、去离子水清洗后吹干，再置于含氨基的硅烷化试剂的无水乙醇溶液中进行反应后得到氨基化载体基质；

S3：羧基经活化的聚丙烯酸溶液的制备：在聚丙烯酸中加入三蒸去离子水摇匀后加入羧基活化试剂，37℃水浴活化60 min后得到羧基经活化的聚丙烯酸溶液，即羧基经活化的PAA-NHS溶液；

S4：多层纳米粒柔性支架的制备：将氨基化载体基质置于羧基经活化的PAA-NHS溶液中于37℃下进行反应后，用三蒸去离子水洗涤氨基化载体基质后吹干；将经吹干的氨基化载体基质置于使用氨基化SiO₂纳米粒制备形成的氨基化SiO₂纳米粒水溶液中，于37℃下进行反应后用三蒸去离子水洗涤氨基化载体基质后吹干；再次将上述经吹干后的氨基化载体基质置于羧基经活化的PAA-NHS溶液于37℃下进行反应后，用三蒸去离子水洗涤氨基化载体基质后吹干；依次重复该步骤中氨基化SiO₂纳米粒的固载和羧基经活化的PAA-NHS的反应过程后，得到所述多层纳米粒柔性支架。

5.一种目标细胞的多重捕获配体修饰的权利要求1至3中任一权利要求所述多层纳米粒柔性支架，其特征在于，在所述多层纳米粒柔性支架的固定大分子接枝链上，利用最后固载的固定大分子接枝链上经羧基活化试剂活化后的羧基与捕获配体上的氨基进行酰胺化反应形成酰胺键，将所述捕获配体固定连接于所述多层纳米粒柔性支架上，其中所述捕获配体为带有氨基的抗体和带有氨基的核酸适体中的一种。

6.一种包括权利要求5所述目标细胞的多重捕获配体修饰的多层纳米粒柔性支架的体外流通捕获系统，其特征在于，包括捕获管、恒温水导管和抗凝剂注入管；其中所述捕获管包括毛细管载体基质、固载于所述毛细管载体基质上的多层纳米粒柔性支架和固定于该多层纳米粒柔性支架上的捕获配体；所述捕获配体为带有氨基的抗体和带有氨基的核酸适体中的一种。