CN104530214A - 一种醋酸普兰林肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种醋酸普兰林肽的制备方法，包括了它的合成与纯化，属于药物制备领域。本发明通过1)Fmoc-Tyr(tBu)-Rink Amide-MBHA Resin氨基树脂的制备、2)全肽树脂的合成、3)全肽树脂的切割、4)中间肽的环化、5)初步纯化、6)精制等过程采用简便实用的空气氧化法制得了醋酸普兰林肽，其粗品仅需经过一次反相高效液相色谱纯化和一次精制即可制得精制液，其精制品的纯度大于99％，纯化总收率高达51.2％，有效的提高了产品生产效率和质量，制备过程简单，操作方便。

Description

一种醋酸普兰林肽的制备方法
技术领域
本发明涉及药物的制备方法，特别是一种降糖多肽类药物醋酸普兰林肽的制备方法。
背景技术
醋酸普兰林肽(Cas No:196078-30-5)是一种由美国Amylin公司研发的人胰淀素类似物，主要用于治疗使用胰岛素仍无法达到理想的血糖控制效果的Ⅰ型与Ⅱ糖尿病，其中胰淀素是指由胰腺β细胞产生的一种协助机体进行血糖调节的激素。普兰林肽的分子式为C171H267N51O53S2，其对应的分子量为3949.4，氨基酸序列为：Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser-Ser-Asn-Asn-phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr-NH2。美国专利US5424394中公开了采用依次偶联氨基酸区段的方法合成醋酸普兰林肽，另一份美国专利US2009055867中也公开了先合成四个氨基酸区段,再将这些氨基酸区段依次偶合，从而合成醋酸普兰林肽的方法，以上方法均采用了条件温和的Fmoc固相合成法，但所使用的构建二硫键的碘氧化法不够简便实用，且未详细提及醋酸普兰林肽的纯化过程；在现有中国专利CN101525382中公开了醋酸普兰林肽的纯化方法，该法需要经过两次高效液相纯化和一次阴离子交换转盐制得纯度大于98％的精制品，其过程复杂，纯化收率仅为40.3％。
发明内容
本发明希望提供一种制备过程简单实用的醋酸普兰林肽的制备方法，包括了醋酸普兰林肽的合成与纯化。
本发明首先公开了一种醋酸普兰林肽的制备方法，包括以下步骤：
1)Fmoc-Tyr(tBu)-Rink Amide-MBHA Resin氨基树脂的制备
以Fmoc-Tyr(tBu)-OH和替代度为0.1～0.5mmol/g的Rink Amide-MBHA Resin氨基树脂为起始原料，通过Fmoc固相合成法制备得到Fmoc-Tyr(tBu)-RinkAmide-MBHA Resin氨基树脂；
2)全肽树脂的合成
将由步骤1)得到的Fmoc-Tyr(tBu)-Rink Amide-MBHA Resin氨基树脂按照肽序在偶联剂作用下依次偶联除Tyr外剩余的每个氨基酸的保护氨基酸，每次偶联一个氨基酸的保护氨基酸后形成新的氨基树脂，将所述新的氨基树脂在脱保护剂的作用下进行脱保护，再偶联下一个氨基酸的保护氨基酸，以此循环至全部氨基酸连接完毕，得到全肽树脂，其中所述保护氨基酸为连接有保护基团的氨基酸，所述脱保护为将所述保护基团从所述保护氨基酸上脱除的过程；
3)全肽树脂的切割
将由步骤2)得到的全肽树脂通过裂解液进行裂解，制得普兰林肽的中间肽；
4)中间肽的环化
通过空气氧化法在步骤3)制得的中间肽的内部构建出二硫醚键，得到粗肽，此处所述空气氧化法为将中间肽溶入纯水后形成混合液，将混合液经PH调节后暴露在空气中自然氧化的方法；
5)初步纯化
通过反相高效液相色谱法对由步骤4)得到的粗肽进行初步纯化，得到纯化肽；
6)精制
通过流动相中含有体积百分浓度为0.1％的醋酸溶液的反相高效液相色谱法对由步骤5)得到的所述纯化肽进行转盐与精制，即得到醋酸普兰林肽，其中所述转盐是指纯化肽与醋酸溶液反应得到普兰林肽的醋酸盐。所述醋酸溶液为将冰醋酸溶解于纯水中得到的溶液。
在上述步骤1)中Rink Amide-MBHA Resin氨基树脂的进一步优选为替代度为0.25mmol/g。
上述制备方法的优选为：所述步骤2)中的偶联剂为HOBT、DIC与DMF的混合溶液，其与步骤1)中所述的Rink Amide-MBHA Resin氨基树脂的摩尔比为1:1～5:1，其中HOBT与DIC的摩尔比为1:1。
另一种优选为：所述步骤2)中所述的每个氨基酸的保护氨基酸与步骤1)中所述的Rink Amide-MBHA Resin氨基树脂的摩尔比为1:1～5:1。
另一种优选为：所述步骤2)中所述的脱保护剂为体积百分浓度为10～40％的哌啶的DMF溶液，其用量为：所述哌啶的DMF溶液的体积与所述RinkAmide-MBHA Resin氨基树脂的物质的量之比为30:1～10:1，其中哌啶的DMF溶液是指将哌啶溶解于DMF中形成的溶液。
上述优选中，哌啶在反应体系中的浓度对保持氨基酸的构型起到重要作用，因此选择适当的浓度是很重要的。
另一种优选为：所述步骤3)中所述裂解液为体积比为85：10：5的TFA、EDT与H20相混合的混合溶液，其用量为：所述裂解液的体积与所述全肽树脂的质量的比为15:1～5:1。
另一种优选为：所述步骤4)中所述的空气氧化法的过程为：将中间肽溶入纯水后形成混合液，使用氨水将混合液PH值调至中性附近，再将其暴露在空气中于室温下自然氧化1～2天，其后使用醋酸将PH值调节至3～5。
另一种优选为：所述步骤5)中所述反相高效液相色谱法中使用10μm的C8反相色谱柱，由体积百分浓度为0.1％的三氟乙酸溶液作为极性流动相中的A相，由乙腈作为极性流动相中的B相，所述A相与B相混合作为洗脱剂。
在上述反相高效液相色谱法中进一步的优选为：所述步骤5)中的反相高效液相色谱法包括以下步骤：
(1)以三氟乙酸溶液平衡10μm的C8反相色谱柱，其后取所述粗肽进样，并采用三氟乙酸溶液对进样后的粗肽进行冲洗；
(2)对完成步骤(1)的粗肽进行梯度洗脱，所述洗脱剂中乙腈的体积百分比从30％不断上升至35％，以215nm的波长检测色谱，观察色谱中主峰的出现情况，当主峰出现时，开始收集产物；
(3)对主峰峰顶出现前、峰顶附近、峰顶出现后的产物分段收集，至无杂峰出现时结束收集；
(4)对步骤(3)中收集到的峰顶出现前、峰顶出现后的产物进行浓缩并对浓缩后产生的粗肽重复步骤(1)至步骤(3)的过程多次；
(5)对步骤(3)与步骤(4)中收集到的峰顶附近的产物进行合并与旋转浓缩，即得到所述纯化肽。
所述醋酸普兰林肽制备方法的另一种优选为：步骤6)中所述反相高效液相色谱法中使用10μm的C8反相色谱柱，由水作为极性流动相中的A相，由体积比为40:60的水与乙腈相混合形成的混合液作为极性流动相中的B相，由体积百分浓度为0.1％的醋酸溶液作为极性流动相中的C相，所述B相与C相混合作为洗脱剂。
在精制中使用的以上反相高效液相色谱法的进一步的优选为：步骤6)中所述反相高效液相色谱法包括以下步骤：
(1)以所述A相平衡10μm的C8反相色谱柱，其后取所述纯化肽进样，并采用所述A相对进样后的纯化肽进行冲洗，冲洗后的纯化肽再进入所述的C相；
(2)对完成步骤(1)的纯化肽进行梯度洗脱，所述洗脱剂中B相的体积百分比从90％不断升至100％，以215nm的波长检测色谱，观察色谱中主峰的出现情况，当主峰出现时，开始收集产物；
(3)对主峰峰顶出现前、峰顶附近、峰顶出现后的产物分段收集，至无杂峰出现时结束收集；
(4)对步骤(3)中收集到的峰顶出现前、峰顶出现后的产物进行浓缩并对浓缩后产生的纯化肽重复步骤(1)至步骤(3)的过程多次；
(6)对步骤(3)与步骤(4)中收集到的峰顶附近的产物进行合并与旋转浓缩，即得到所述醋酸普兰林肽。
对完成上述步骤的醋酸普兰林肽精制液可以冷冻暂存，也可通过滤膜过滤后分装于适当容器中冻干，将冻干粉用洁净的容器密封包装并通过检测后，即制得成品。
本发明具有以下有益效果：
1)采用简便实用的空气氧化法来构建二硫键；
2)粗品仅需经过一次反相高效液相色谱纯化和一次精制即可制得精制液，过程简单，操作方便；
3)精制品的纯度大于99％，纯化总收率高达51.2％，有效的提高了产品生产效率和质量。
附图说明
图1为本发明中的一种制备醋酸普兰林肽的方法的完整工艺流程的演示图。
具体实施方式
醋酸普兰林肽的详细制备过程为：
1)Fmoc-Tyr(tBu)-Rink Amide-MBHA Resin氨基树脂的制备
以Fmoc-Tyr(tBu)-OH和替代度为0.1～0.5mmol/g的Rink Amide-MBHA Resin氨基树脂为起始原料，通过Fmoc固相合成法制备得到Fmoc-Tyr(tBu)-RinkAmide-MBHA Resin氨基树脂；
2)全肽树脂的合成
将由步骤1)得到的Fmoc-Tyr(tBu)-Rink Amide-MBHA Resin氨基树脂按照肽序在偶联剂作用下依次偶联除Tyr外剩余的每个氨基酸的保护氨基酸，每次偶联一个氨基酸的保护氨基酸后形成新的氨基树脂，将所述新的氨基树脂在脱保护剂的作用下进行脱保护，再偶联下一个氨基酸的保护氨基酸，以此循环至全部氨基酸连接完毕，得到全肽树脂，其中所述保护氨基酸为连接有保护基团的氨基酸，所述脱保护为将所述保护基团从所述保护氨基酸上脱除的过程；
3)全肽树脂的切割
将由步骤2)得到的全肽树脂通过裂解液进行裂解，制得普兰林肽的中间肽；
4)中间肽的环化
通过空气氧化法在步骤3)制得的中间肽的内部构建出二硫醚键，得到粗肽，此处所述空气氧化法为将中间肽溶入纯水后形成混合液，将混合液经PH调节后暴露在空气中自然氧化的方法；
5)初步纯化
通过反相高效液相色谱法对由步骤4)得到的粗肽进行初步纯化，得到纯化肽；
6)精制
通过流动相中含有体积百分浓度为0.1％的醋酸溶液的反相高效液相色谱法对由步骤5)得到的所述纯化肽进行转盐与精制，即得到醋酸普兰林肽，其中所述转盐是指纯化肽与醋酸溶液反应得到普兰林肽的醋酸盐。所述醋酸溶液为将固体冰醋酸溶解于纯水中得到的溶液。
在上述步骤1)中Rink Amide-MBHA Resin氨基树脂的进一步优选为替代度为0.25mmol/g，步骤2)中的偶联剂可选HOBT、DIC与DMF的混合溶液，其与步骤1)中所述的Rink Amide-MBHA Resin氨基树脂的摩尔比为1:1～5:1，其中HOBT与DIC的摩尔比为1:1，步骤2)中所述的每个氨基酸的保护氨基酸与步骤1)中所述的Rink Amide-MBHA Resin氨基树脂的摩尔比为1:1～5:1，步骤2)中所述的脱保护剂为体积百分浓度为10～40％的哌啶的DMF溶液，其用量可选哌啶的DMF溶液的体积与所述Rink Amide-MBHA Resin氨基树脂的物质的量之比为30:1～10:1。步骤3)中裂解液为体积比为85：10：5的TFA、EDT与H20相混合的混合溶液，其用量可选裂解液的体积与全肽树脂的质量的比为15:1～5:1。步骤4)中所述的空气氧化法的过程为：将中间肽溶入纯水后形成混合液，使用氨水将混合液PH值调至中性附近，再将其暴露在空气中于室温下自然氧化1～2天，其后使用醋酸将PH值调节至3～5。步骤5)中的反相高效液相色谱法中使用10μm的C8反相色谱柱，由体积百分浓度为0.1％的三氟乙酸溶液作为极性流动相中的A相，由乙腈作为极性流动相中的B相，所述A相与B相混合作为洗脱剂，其过程为：(1)以三氟乙酸溶液平衡10μm的C8反相色谱柱，其后取所述粗肽进样，并采用三氟乙酸溶液对进样后的粗肽进行冲洗；(2)对完成步骤(1)的粗肽进行梯度洗脱，所述洗脱剂中乙腈的体积百分比从30％不断上升至35％，以215nm的波长检测色谱，观察色谱中主峰的出现情况，当主峰出现时，开始收集产物；(3)对主峰峰顶出现前、峰顶附近、峰顶出现后的产物分段收集，至无杂峰出现时结束收集；(4)对步骤(3)中收集到的峰顶出现前、峰顶出现后的产物进行浓缩并对浓缩后产生的粗肽重复步骤(1)至步骤(3)的过程多次；(4)对步骤(3)与步骤(4)中收集到的峰顶附近的产物进行合并与旋转浓缩，即得到所述纯化肽。步骤6)中所述反相高效液相色谱法中使用10μm的C8反相色谱柱，由水作为极性流动相中的A相，由体积比为40:60的水与乙腈相混合形成的混合液作为极性流动相中的B相，由体积百分浓度为0.1％的醋酸溶液作为极性流动相中的C相，所述B相与C相混合作为洗脱剂，其过程为：(1)以所述A相平衡10μm的C8反相色谱柱，其后取所述纯化肽进样，并采用所述A相对进样后的纯化肽进行冲洗，冲洗后的纯化肽再进入所述的C相；(2)对完成步骤(1)的纯化肽进行梯度洗脱，所述洗脱剂中B相的体积百分比从90％不断升至100％，以215nm的波长检测色谱，观察色谱中主峰的出现情况，当主峰出现时，开始收集产物；(3)对主峰峰顶出现前、峰顶附近、峰顶出现后的产物分段收集，至无杂峰出现时结束收集；(4)对步骤(3)中收集到的峰顶出现前、峰顶出现后的产物进行浓缩并对浓缩后产生的纯化肽重复步骤(1)至步骤(3)的过程多次；(5)对步骤(3)与步骤(4)中收集到的峰顶附近的产物进行合并与旋转浓缩，即得到所述醋酸普兰林肽。
其中Rink Amide-MBHA Resin氨基树脂为：
Fmoc-Tyr(tBu)-OH为N-芴甲氧羰基-侧链tBu保护的酪氨酸；HOBT为1-羟基苯并三唑；DIC为N,N’-二异丙基碳二亚胺；DMF为N,N-二甲基甲酰胺；EDT为1，2-乙二硫醇。
具体的流程如下：
下面结合本发明的实施例对本发明作进一步的阐述和说明：
实施例1：Fmoc-Tyr(tBu)-Rink MBHA Resin氨基树脂的制备
将40g(10mmol)替代度为0.25mmol/g的Rink Amide-MBHA Resin氨基树脂加入到玻璃反应柱中，向其中加入200mLDMF溶胀30min，其后向玻璃反应柱内加入200mL配置好的体积浓度为20％的哌啶的DMF溶液，并搅拌进行反应30min，其后抽除反应液，再向玻璃反应柱中加入DMF进行洗涤，洗涤6次，每次用量200mL；同时称取50mmol的Fmoc-Tyr(tBu)-OH和50mmol的HOBT，将这两种物质用200mL的DMF溶解，溶解完全后向其中加入50mmol的DIC形成混合液，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌反应2小时。其后抽除液体，用DMF进行洗涤，洗涤6次，每次用量200mL；即得到Fmoc-Tyr(tBu)-Rink MBHA Resin氨基树脂约42.0g。
实施例2：全肽树脂的合成
向步骤1)生成的Fmoc-Tyr(tBu)-Rink MBHA Resin氨基树脂中加入200mL配置好的体积浓度为20％的哌啶的DMF溶液，搅拌使其反应30min，之后抽除液体，用DMF洗涤产物10次，每次用量200mL，将洗涤液DMF抽干，其后称取50mmol的Fmoc-Thr(tBu)-OH和50mmol的HOBT，将这两种物质用200mL的DMF溶解，溶解完全后向其中加入50mmol的DIC形成混合液，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌反应2小时，其后抽除液体，用DMF对产物洗涤6次，每次用量200mL，抽干即得到Fmoc-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Rink MBHAResin氨基树脂，此后加入脱保护试剂，将剩余氨基酸顺次偶联与脱保护，操作至最后一个氨基酸偶联完毕，即得到全肽树脂约131.0g。
实施例3：全肽树脂的切割
裂解液的配制：
取2000mL的圆底烧瓶,向其中加入850mL的TFA,100mL的EDT,50mL的H20,并搅拌混匀得到裂解液。
裂解：
向裂解液中加入全肽树脂100g,搅拌反应3小时,然后用砂芯漏斗进行过滤,滤出的树脂再用400mL的TFA洗涤,重复过滤与洗涤两次后合并滤液,减压浓缩至滤液体积约为原始体积的1/10左右,然后将其加入到体积为浓缩液10倍的预冷的乙酸乙酯溶剂中,沉降析出白色固体,将该白色固体过滤，滤得的白色固体用乙酸乙酯洗涤4次，每次用乙酸乙酯400mL,过滤,得固体粉末,真空干燥12小时,取出称重，即得到中间肽23.5g(含量：52.44％，HPCL纯度：50.5％)。
实施例4：中间肽的环化
将中间肽固体按2mmol/L的浓度溶入5L纯水中，用氨水调节溶液PH至7.2左右，于室温下暴露在空气中反应1天，反应后加入醋酸调节PH至5左右,其后终止反应，将混合液进行过滤，收集滤液即得到粗肽。
实施例5：醋酸普兰林肽粗肽的初步纯化
使用反相高效液相色谱法对中间肽进行初步纯化，使用的反相高效液相色谱的组成为：
极性流动相：A相：体积百分浓度为0.1％的三氟乙酸(TFA)溶液；B相：乙腈；
色谱柱：10μm的C8反相色谱柱；
检测波长：215nm；
流速：80mL/min(色谱柱放大的情况下，流速可相应地增加)；
先以流动相A平衡柱子，然后取粗肽液(含肽约29.2g)5L进样，先用流动相A冲洗15min，然后采用梯度洗脱：洗脱剂为A相与B相的混合，其中B相的体积百分比在45min内由30％上升至35％，密切观察主峰的出现，主峰出现时开始收集，主峰峰顶前、峰顶附近、峰顶后分段收集，无杂峰出现时收集结束。将峰顶出现前、峰顶出现后收集到的液体进行适量浓缩，再加入色谱柱中进行相同的流动相A冲洗与洗脱剂的梯度洗脱，同样收集三段产物，以此重复多次后合并每次收集到的峰顶附近的液体，将其适度地旋转蒸发浓缩，即制得纯化肽的溶4757mL(含量：3.64mg/mL，HPCL纯度：98.4％,收率59.3％),可将其冷冻暂存。
实施例6：醋酸普兰林肽的转盐及精制
使用反相高效液相色谱法对纯化肽进行转盐与精制，使用的反相高效液相色谱的组成为：
极性流动相：流动相A：水；流动相B：体积比为40:60的水与乙腈的混合液；流动相C：体积百分浓度为0.1％的醋酸溶液；
色谱柱：10μm的C8反相色谱柱；
检测波长：215nm
流速：80mL/min(色谱柱放大的情况下，流速可相应地增加)；
先以流动相A平衡柱子，然后取纯化肽的溶液4757mL进样，先用流动相A对其冲洗15min，洗去盐分，再加入流动相C，反应10分钟，然后采用梯度洗脱，洗脱剂为B相与C相混合，其中B相的体积百分比在45min内由90％升至100％，密切观察主峰的出现，主峰出现时开始收集，密切观察主峰的出现，主峰出现时开始收集，主峰峰顶前、峰顶附近、峰顶后分段收集，无杂峰出现时收集结束。将峰顶出现前、峰顶出现后收集到的液体进行适量浓缩，再加入色谱柱中进行相同的梯度洗脱，同样收集三段产物，以此重复多次后合并每次收集到的峰顶附近的液体，将其适度地旋转蒸发浓缩，即制得醋酸普兰林肽的精制液842mL(含量：17.77mg/mL，HPCL纯度：99.7％,收率86.4％),可冷冻暂存。
实施例7：冻干、包装
取醋酸普兰林肽的精制液842mL，以0.22μm的滤膜进行过滤,将滤得的固体分装于适当容器中进行冻干，冻干粉用洁净的容器密封包装，经检测合格后入库，即制得醋酸普兰林肽成品14.3g(HPCL纯度：99.53％)。
上面虽然结合实施例对本发明进行了详细的说明，但是，本领域技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，在权利要求的范围内，还可以对上述实施例进行变更或改变等。

Claims (10)

1.一种醋酸普兰林肽的制备方法，包括以下步骤：
1)Fmoc-Tyr(tBu)-Rink Amide-MBHA Resin氨基树脂的制备
以Fmoc-Tyr(tBu)-OH和替代度为0.1～0.5mmol/g的Rink Amide-MBHAResin氨基树脂为起始原料，通过Fmoc固相合成法制备得到Fmoc-Tyr(tBu)-Rink Amide-MBHA Resin氨基树脂；
2)全肽树脂的合成
将所述Fmoc-Tyr(tBu)-Rink Amide-MBHA Resin氨基树脂按照肽序在偶联剂作用下依次偶联除Tyr外剩余的每个氨基酸的保护氨基酸，每次偶联一个氨基酸的保护氨基酸后形成新的氨基树脂，将所述新的氨基树脂在脱保护剂的作用下进行脱保护，再偶联下一个氨基酸的保护氨基酸，以此循环至全部氨基酸连接完毕，得到全肽树脂，其中所述保护氨基酸为连接有保护基团的氨基酸，所述脱保护为将所述保护基团从所述保护氨基酸上脱除的过程；
3)全肽树脂的切割
将所述全肽树脂通过裂解液进行裂解，制得普兰林肽的中间肽；
4)中间肽的环化
通过空气氧化法在所述中间肽的内部构建出二硫醚键，得到粗肽，所述空气氧化法为将中间肽溶入纯水后形成混合液，将混合液经过PH调节后暴露在空气中自然氧化的方法；
5)初步纯化
通过反相高效液相色谱法对所述粗肽进行初步纯化，得到纯化肽；
6)精制
通过流动相中含有体积百分浓度为0.1％的醋酸溶液的反相高效液相色谱法对所述纯化肽进行转盐与精制，即得到醋酸普兰林肽，其中所述转盐是指纯化肽与醋酸溶液反应得到普兰林肽的醋酸盐。
2.根据权利要求1所述的醋酸普兰林肽的制备方法,其特征在于：所述步骤2)中所述的偶联剂为HOBT、DIC与DMF的混合溶液，其与步骤1)中所述的Rink Amide-MBHA Resin氨基树脂的摩尔比为1:1～5:1，其中HOBT与DIC的摩尔比为1:1。
3.根据权利要求1所述的醋酸普兰林肽的制备方法,其特征在于：所述步骤2)中所述的每个氨基酸的保护氨基酸与步骤1)中所述的Rink Amide-MBHAResin氨基树脂的摩尔比为1:1～5:1。
4.根据权利要求1所述的醋酸普兰林肽的制备方法,其特征在于：所述步骤2)中所述的脱保护剂为体积百分浓度为10～40％的哌啶的DMF溶液，其用量为：所述哌啶的DMF溶液的体积与所述Rink Amide-MBHA Resin氨基树脂的物质的量之比为30:1～10:1，其中哌啶的DMF溶液是指将哌啶溶解于DMF中形成的溶液。
5.根据权利要求1所述的醋酸普兰林肽的制备方法,其特征在于：所述步骤3)中所述裂解液为体积比为85：10：5的TFA、EDT与H20相混合的混合溶液，其用量为：所述裂解液的体积与所述全肽树脂的质量的比为15:1～5:1。
6.根据权利要求1所述的醋酸普兰林肽的制备方法,其特征在于：所述步骤4)中所述的空气氧化法的过程为：将中间肽溶入纯水后形成混合液，使用氨水将混合液PH值调至中性附近，再将其暴露在空气中于室温下自然氧化1～2天，其后使用醋酸将PH值调节至3～5。
7.根据权利要求1所述的醋酸普兰林肽的制备方法,其特征在于：所述步骤5)中所述反相高效液相色谱法中使用10μm的C8反相色谱柱，由体积百分浓度为0.1％的三氟乙酸溶液作为极性流动相中的A相，由乙腈作为极性流动相中的B相，所述A相与B相混合作为洗脱剂。
8.根据权利要求7所述的醋酸普兰林肽的制备方法,其特征在于：所述步骤5)中所述反相高效液相色谱法包括以下步骤：
(1)以所述三氟乙酸溶液平衡10μm的C8反相色谱柱，其后取所述粗肽进样，并采用所述三氟乙酸溶液对进样后的粗肽进行冲洗；
(2)对完成步骤(1)的粗肽进行梯度洗脱，所述洗脱剂中乙腈的体积百分比从30％不断上升至35％，以215nm的波长检测色谱，观察色谱中主峰的出现情况，当主峰出现时，开始收集产物；
(3)对主峰峰顶出现前、峰顶附近、峰顶出现后的产物分段收集，至无杂峰出现时结束收集；
(4)对步骤(3)中收集到的峰顶出现前、峰顶出现后的产物进行浓缩并对浓缩后产生的粗肽重复步骤(1)至步骤(3)的过程多次；
(5)对步骤(3)与步骤(4)中收集到的峰顶附近的产物进行合并与旋转浓缩，即得到所述纯化肽。
9.根据权利要求1所述的醋酸普兰林肽的制备方法,其特征在于：所述步骤6)中所述反相高效液相色谱法中使用10μm的C8反相色谱柱，由水作为极性流动相中的A相，由体积比为40:60的水与乙腈相混合形成的混合液作为极性流动相中的B相，由体积百分浓度为0.1％的醋酸溶液作为极性流动相中的C相，所述B相与C相混合作为洗脱剂。
10.根据权利要求9所述的醋酸普兰林肽的制备方法,其特征在于：所述步骤6)中所述反相高效液相色谱法包括以下步骤：
(1)以所述A相平衡10μm的C8反相色谱柱，其后取所述纯化肽进样，并采用所述A相对进样后的纯化肽进行冲洗，冲洗后的纯化肽加入所述的C相；
(2)对完成步骤(1)的纯化肽进行梯度洗脱，所述洗脱剂中B相的体积百分比从90％不断升至100％，以215nm的波长检测色谱，观察色谱中主峰的出现情况，当主峰出现时，开始收集产物；
(3)对主峰峰顶出现前、峰顶附近、峰顶出现后的产物分段收集，至无杂峰出现时结束收集；
(4)对步骤(3)中收集到的峰顶出现前、峰顶出现后的产物进行浓缩并对浓缩后产生的纯化肽重复步骤(1)至步骤(3)的过程多次；
(5)对步骤(3)与步骤(4)中收集到的峰顶附近的产物进行合并与旋转浓缩，即得到所述醋酸普兰林肽。
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