CN101525382A - 一种纯化普兰林肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纯化普兰林肽的方法，属于HPLC技术领域，包括以下步骤：1)将合成所得粗肽溶解后，用固定相为反向硅胶柱，流动相为三氟乙酸水溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，收集目的峰值的肽溶液；2)将步骤1)纯化所得目的肽溶液浓缩后用固定相为反向硅胶柱，流动相为磷酸盐水溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化收集目的峰值的肽溶液；3)将磷酸盐采用阴离子交换转盐法转成醋酸盐。本发明使用反相高效液相色谱法与阴离子交换法纯化普兰林肽，纯度高且收率好，提供了一条适于规模化纯化亮丙瑞林的工艺方法，达到产业化要求。

Description

一种纯化普兰林肽的方法
技术领域
本发明属于HPLC技术领域，尤其是涉及一种规模化纯化普兰林肽(Pramlintide)的方法。
技术背景
普兰林肽(Pramlintide)中文制剂名称为醋酸普兰林肽，英文名为：Pramlintide acetate，分子式：C171H267N51O53S2 ·x(C2H4O2)·x(H2O)，分子量：3949.39，CAS登录号：196078-30-5。
普兰林肽是一种治疗糖尿病的多肽药物，其效果较好且副作用小，具有很好的市场前景。在已发表的文献和专利中，未有大规模生产、并且具有较高收率的纯化工艺报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一条适于产业化纯化普兰林肽的工艺方法，使用反相高效液相色谱法纯化普兰林肽，纯度高且收率好，达到产业化要求，解决现有技术存在的缺陷。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种纯化普兰林肽的方法，包括以下步骤：
1)将合成所得粗肽溶解后，用固定相为反向硅胶柱，流动相为三氟乙酸水溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，收集目的峰值的肽溶液；
2)将步骤1)纯化所得目的肽溶液浓缩后用固定相为反向硅胶柱，流动相为磷酸盐水溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化收集目的峰值的肽溶液；
3)将磷酸盐采用阴离子交换转盐法转成醋酸盐。
优选的方案是：所述的反向硅胶柱为十八烷基硅烷键合硅胶。
更为优选的方案是：所述步骤1)三氟乙酸水溶液浓度为0.1％(V∶V)；检测波长为：230nm。
更为优选的方案是：所述步骤2)磷酸盐水溶液pH值为7.0～8.0。
更为优选的方案是：所述的阴离子交换转盐法为通过采用能够提供醋酸根的阴离子交换树脂进行离子交换实现，所述的阴离子交换树脂是Amberlite IR A-93。
本发明与现有技术相比，有如下优点和有益效果：
本发明使用反相高效液相色谱法与阴离子交换法纯化普兰林肽，纯度高且收率好，提供了一条适于规模化纯化亮丙瑞林的工艺方法，达到产业化要求。
具体实施方式
实施例1
1.样品处理：粗肽用超纯水溶解成10mg/mL，使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液备用。
2.第一次纯化：纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：5cm×25cm。流动相：A相：0.1％三氟乙酸水溶液；B相：乙腈。流速：70-80ml/min。检测波长：230nm。梯度：B％：25％～45％(45min)。进样量为1.5-2.0g。
纯化过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为1.5-2.0g。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约50-60mg/mL后备用。
3.第二次纯化：纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：5cm×25cm。流动相：A相：20mmol/L磷酸二氢钠水溶液用氢氧化钠调pH至7.0；B相：乙腈。流速：55-60ml/min。检测波长：230nm。梯度：B％：25％～45％(45min)。进样量为1.5-2.0g。
纯化过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为30-40ml样品溶液。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约50-60mg/mL后备用。
4、转盐：色谱柱填料为阴离子交换树脂：Amberlite IRA-93，柱子直径和长度为：5cm×25cm。流动相：0.1-0.3％醋酸水溶液。流速：55-60ml/min。检测波长：280nm。进样量为1.5-2.0g。
转盐过程：将色谱柱用去离子水平衡后上样，上样量为30-40ml样品溶液。0.1-0.3％醋酸水溶液洗脱60min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液合并于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约80-100mg/mL后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于98％的符合标准的普兰林肽，纯化收率41.2％。
实施例2
1.样品处理：粗肽用超纯水溶解成10mg/mL，使样品完全溶解后用
Figure A20091010675700051
滤膜过滤，收集滤液备用。
2.第一次纯化：纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：15cm×25cm。流动相：A相：0.1％三氟乙酸水溶液；B相：乙腈。流速：500-550ml/min。检测波长：230nm。梯度：B％：25％～45％(45min)。进样量为15-20g。
纯化过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为15-20g。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约50-60mg/mL后备用。
3、第二次纯化：纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：15cm×25cm。流动相：A相：20mmol/L磷酸二氢钠水溶液用氢氧化钠调pH至7.0；B相：乙腈。流速：500-550ml/min。检测波长：230nm。梯度：B％：25％～45％(45min)。进样量为15-20g。
纯化过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为300-400ml样品溶液。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约50-60mg/mL后备用。
4、转盐：纯化条件：色谱柱填料为阴离子交换树脂：Amberlite IRA-93，柱子直径和长度为：15cm×45cm。流动相：0.1-0.3％醋酸水溶液。流速：150-170ml/min。检测波长：280nm。进样量为10-15g。
转盐过程：将色谱柱用去离子水平衡后上样，上样量为300-400ml样品溶液。0.1-0.3％醋酸水溶液洗脱75min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约80-100mg/mL。后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于98％的符合标准的普兰林肽，纯化收率达43.3％。
实施例3
1.样品处理：粗肽用超纯水溶解成10mg/mL，使样品完全溶解后用
Figure A20091010675700061
滤膜过滤，收集滤液备用。
2.第一次纯化：纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：30cm×25cm。流动相：A相：0.1％三氟乙酸水溶液；B相：乙腈。流速：2000-2200ml/min。检测波长：230nm。梯度：B％：25％～45％(45min)。进样量为65-75g。
纯化过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为65-75g。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约50-60mg/mL后备用。
3、第二次纯化：纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：30cm×25cm。流动相：A相：20mmol/L磷酸二氢钠水溶液用氢氧化钠调pH至7.0；B相：乙腈。流速：2000-2200ml/min。检测波长：230nm。梯度：B％：25％～45％(45min)。进样量为65-75g。
纯化过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为1.3-1.5L样品溶液。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约50-60mg/mL后备用。
4、转盐：纯化条件：色谱柱填料为阴离子交换树脂：Amberlite IRA-93，柱子直径和长度为：30cm×70cm。流动相：0.1-0.3％醋酸水溶液。流速：2000-2200ml/min。检测波长：280nm。进样量为65-75g。
转盐过程：将色谱柱用去离子水平衡后上样，上样量为1300-1500ml样品溶液。0.1-0.3％醋酸水溶液洗脱160min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约80-100mg/mL后转至合适大小西林瓶，冷冻干燥后即可得到纯度大于98％的符合标准的普兰林肽，纯化收率达40.3％。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1、一种纯化普兰林肽的方法，包括以下步骤：
1)将合成所得粗肽溶解后，用固定相为反向硅胶柱，流动相为三氟乙酸水溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，收集目的峰值的肽溶液；
2)将步骤1)纯化所得目的肽溶液浓缩后用固定相为反向硅胶柱，流动相为磷酸盐水溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化收集目的峰值的肽溶液；
3)将磷酸盐采用阴离子交换转盐法转成醋酸盐。
2、如权利要求1所述纯化普兰林肽的方法，其特征是：所述的反向硅胶柱为十八烷基硅烷键合硅胶。
3、如权利要求1或者2所述纯化普兰林肽的方法，其特征是：所述步骤1)三氟乙酸水溶液浓度为0.1％(V∶V)；检测波长为：230nm。
4、如权利要求1或者2所述纯化普兰林肽的方法，其特征是：所述步骤2)磷酸盐水溶液pH值为7.0～8.0。
5、如权利要求1或者2所述纯化普兰林肽的方法，其特征是：所述的阴离子交换转盐法为通过采用能够提供醋酸根的阴离子交换树脂进行离子交换实现，所述的阴离子交换树脂是Amberlite IRA-93。
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